Name: organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells
Uploaded: 2017-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells at JoVE.com

Yazarlar Christine Auste onun desteğiyle video kayıt ve stadyum Ghadban onun mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Urszula Grabiec, Roux Programm FKZ 29/18 tarafından desteklenmiştir.

hayvan deneyleri gerçekleştirilen etik ilke ve nörolojik araştırma hayvanlara kullanım ilkesi doğrultusunda Avrupa Toplulukları Konseyi yönergesi 2010/63/AB tarafından Avrupa Parlamentosu onaylanmış ve bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması üzerinde Avrupa Birliği Konseyi.
 1. Kültür ortam ve aygıtlar hazırlık <ol><li>OHSC hazırlanması için aşağıdaki araç kümesi, kullanın: iki küçük makas, iki eğri cımbız, iyi bir ipucu ile bir cımbız üç Bıçaklar (iki boyutu 11, mevcudu 15 biri), Üç neşter sahipleri, yuvarlak filtre kağıtları (çapı: 35 mm), agar, bir tıraş bıçağı, biri Pasteur pipet değiştirilmemiş ve biri Pasteur pipet bir ipucu olmadan değiştirilebilir. Kullanım ( şekil 1) önce bir otoklav içinde tüm malzemeleri sterilize.</li>
	<li>5 g agar tartmak ve 100 mL distile suda çözülür. Bir otoklav içinde 210.8 kPa, 121.7 ° C'de 20 dk için çözüm sterilize. 3 mL sıvı agar çözüm 60 mm Petri yemeklerinde steril cam pipet kullanarak dağıtmak, 5 h için kuvvetlendirmek, kirlenmesini önlemek ve 4 ° C'de daha fazla kullanmak kadar saklamak için plastik parafin film ile karşılamak izin. Agar blok Dilimleme işlemi sırasında beyin stabilize etmek için gereklidir.</li>
	198 mL en az gerekli orta (MEM) ve 2 mL L-glutamin çözüm <li>medya <ol><li>yapmak 200 mL hazırlık orta (pH 7,35) oluşan (son konsantrasyonu 2 mM). Çözüm medyası hazırlama gününde hazırlamak ve 4'te saklayın ° C.</li>
		<li>100 mL 49 mL MEM, 25 mL Hanks oluşan kültür ortamının hazırlamak &#39; dengeli tuz Çözümleri (HBSS), 25 mL (v/v) normal at serum (NHS), 1 mL L-glutamin çözüm (son konsantrasyonu 2 mM), 100 µg insülin, 120 mg glikoz, 10 mg streptomisin , 10.000 U penisilin ve 800 µg daha önce bildirildiği gibi C vitamini. Orta (37 ° C) sıcak, pH 7.4 ve steril filtre (0.2 µm gözenek boyutu) pH değerine ayarlayın. Orta değiştirmeden önce her iki günde (ısınma pH ayarlama, vb,) yordamı yineleyin. Orta en bir hafta boyunca kullanmak saat 4'te saklandığında ° C.</li>
	</ol></li> <li>Bir 35 mm Petri kabına beyin depolamak için hazırlık orta ile doldurun. Doku üzerinde bir soğutma paketi çalışma alanı içinde toplamak için iki boş Petri tabağı yere.</li>
</ol> 2. Hazırlık ve dilimleme bir Vibratome ile <ol><li>Kullanım beyin 7-9 gün eski fareler veya 4-5 gün Stoppini ve ark göre OHSC hazırlık için eski fareler. 4 sonra işten çıkarma hayvanların, deri kafatasından makasla kaldırmak.</li>
	<li>İyi makas bıçak deliği magnum tanıtmak ve kafatası Kaudal (geri) rostral (açık) ekseni boyunca keserek açın. Yapmak iki makas sırasıyla sol ve sağ kulak doğru işaret böylece ilki için dik keser (&#34; T-kesi &#34;).</li>
	<li>Kafatası beyin zarar değil dikkat iyi Forseps ile dikkatlice açın. Bir neşter (bıçak büyüklüğüne 11) ön direğe ve beyincik en rostral parçası kesmek için kullanın.</li>
	<li>Tarafından bir spatula ile beyin kaldırmak ve hazırlık orta ( Şekil 2) ile dolu Petri kabına dikkatle yer anlamına gelir. Beyin numune tutucu üzerinde konumlandırın ve tıbbi siyanoakrilat yapıştırıcı ile düzeltebilirim. Mekanik stabilizasyon temin için agar parçaları kullanın.</li>
	<li>Yatay olarak 350 µm doku teşrih sürgülü vibratome kullanarak kalın OHSC.</li>
	<li>Optik Binoküler mikroskop kullanma dilim değerlendirin. OHSC düşük kalite hemen atın. Hipokampüs orta kısmından izole olduğu gibi cytoarchitecture ile yalnızca bu dilimleri almak önemlidir (bkz. Şekil 3 ve 4) arasında dorsal ve ventral Hipokampus.</li>
	Hipokampal bölgeyi ve neşter (yuvarlak bıçak büyüklüğüne 15; kullanarak entorhinal korteks <li>ayrı şekil 3). Perforant yolu ve entorhinal korteks korunmalıdır.</li>
	<li>6-8 OHSC her beyin elde edilir. 2-3 dilim içine bir hücre kültür ekleme (gözenek boyutu 0.4 µm) aktarmak ve 1 mL kültür orta iyi ücret içeren bir 6-şey kültür yemeğin bir şey yerleştirebilirsiniz.</li>
	<li>6-iyi yemekler %5 (v/v) CO 2 ile tam olarak oksijen bir ortamda 35 ° C'de kuluçkaya ve hücre kültür orta iki günde değiştirin. 
	Not: 6 gün vitro (div), senin deney. İnflamatuar reaksiyonları Dilimleme yordamı ile ilişkili gün 6 tarafından yok olur. Bu aşamada, mikroglial hücre ramified Morfoloji yeniden göstermek ve sinaptik bağlantıları olgunlaştı.</li>
</ol> 3. Doku niteliğinin <ol><li>fiksasyon, etiketleme ve görsel olarak yozlaşıyor nöronların OHSC <ol><li>deneyler gerçekleştirdikten sonra fiksasyon önce 2 h 5 µg/mL propidium iyodür (PI) ile OHSC içinde kuluçkaya nöronların oluşan bozucu çekirdekleri leke için sipariş. 
		Dikkat: PI şüpheli bir kanserojen, her zaman kişisel koruyucu ekipman (PPE) gibi eldiven giymek.</li>
		<li>0.1 M fosfat tampon (pH 7,4) ile OHSC yıkama ve paraformaldehyde (PFA) 24 h için %4 (v/v) çözeltisi ile tamir 
		Dikkat: PFA şüpheli ve zehirli kanserojen olduğu. İş duman başlık altında ve KKE giymek.</li>
		<li>OHSC ekler 1 mL PBS ile yıkayın ve membran dilimleri ayırmak için bir de fırça kullanın.</li>
		<li>Etiket OHSC IB 4 boya 24-şey plaka ( şekil 5).</li>
	</ol></li> <li>Tek hücreleri iletim tümör işgali deneyler fluorescently kullanarak etiketli <ol><li>bir deney başlamadan önce 24 h etiket tümör hücreleri floresan boya Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl kullanarak Ester (CFDA SE).</li>
		<li>Ayır ve Neubauer odası kullanarak tümör hücreleri saymak.</li>
		<li>Süspansiyon 10 µL istenen cep numarasını (normalde 50.000 veya 100.000 hücreleri) içerir öyle ki Orta, hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Hücre süspansiyon dilim kültür üzerine 10 µL uygulayın ve 3 gün boyunca işgal hücrelere izin.</li>
		<li>Deneme sonunda %4 (v/v) İngiltere'de yılın 24 h için kullanma dilim kültürler düzeltmek ve PI başka bir 24 h için cytoarchitecture görselleştirmek için yardımcı kültürlerle etiket. 
		Dikkat: PFA şüpheli ve zehirli kanserojen olduğu. İş duman başlık altında ve KKE giymek.</li>
		<li>Üzerine bir kapak notu montaj medya kullanarak daha ayrıntılı bir çözümleme için ortak kültürler mount.</li>
	</ol></li></ol> 4. OHSC deneyler değerlendirilmesi OHSC confocal lazer mikroskop (CLSM) tarama bir analiz. 543 PI tespiti etiketli, nöronların oluşan bozucu veya cytoarchitecture etiketli PI kullanın monokromatik ışık dalga boyu λ = nm ve emisyon grubu pass filtre dalga boyu λ için 585-615 nm =. Tümör hücreleri veya IB 4 microglia CFDA etiketli, bir uyarma dalga boyu λ kullanmak 488 = nm. Deneysel her iki türü için bir z-yığın 2 µm kalınlığında optik dilim ile kayıt ve değerlendirme için kullanılan.

Yazarlar ifşa yoktur

Mevcut protokolünü OHSC hazırlanması açıklar. Bu model iç yetenekleri ve beyin dokusu reaksiyonları fizyolojik ve patolojik bir çekim gücü uygulamadan sonra test sağlar. Elektrofizyolojik parametrelerinin analizler, yanı sıra OHSC lesioned olabilir ve hasar etkisi tüm hücre türleri belirlenebilir. Farklı maddeler ve lesioning işlemler veya makrofajlar ve lenfositler yokluğunda şifa ayrıntılı açıklaması ile tedavi mümkündür.
The Most kritik adımlar için bir başa...

OHSC nöronlar, astrocytes ve microglia1fizyolojik ve patolojik özelliklerini incelemek için iyi karakterize vitro modeli vardır. Hücre dışı ortam kontrol etmek ve hücresel ve morfolojik değişiklikler sonra çeşitli uyaranlara izlemek kolaydır. Hipokampal nöronlar organizasyonu ve bağlantıları sonra hazırlık2,3iyi korunmuş. Çeşitli yararları dışarı OHSC izin hayvan ameliyat olmadan beyin hasarı ve tümör işgalinin izleme. Altı ya da sekiz OHSC tek bir kemirgen beyinden elde edilebilir. OHSC bu nedenle önemli ölçüde hayvan sayısını azaltmak ve birden fazla ilaç konsantrasyonları, genetik manipülasyon veya farklı lezyon modelleri aynı hayvan test izin vermek için yardımcı olur. Dilim tabanlı deneyleri içinde deneysel koşullar tam olarak kontrol edilebilir. Ayrıca, ikincil hasar gibi patolojik durumlardan zaman bağımlı geliştirme kolayca zaman hata görüntüleme tarafından izlenebilir.
Başlangıçta Stoppini ve ark. tarafından kurulan belirli iletişim kuralı 4, hazırlık adımları açıklanmıştır ve uygun dilimleri seçimi için önemli morfolojik yerler vurgulanır. Doğum sonrası gün 7-9 fareler veya doğum sonrası 4-5 gün fareler hazırlanması tavsiye ediyoruz. Bu dönemlerde OHSC mekanik travmalar ve nöronal devreler yeniden yapılanma yüksek bir potansiyel güçlü bir direnç gösteriyor. Buna ek olarak, ürünleri embriyonik veya yetişkin fareler üzerinden hızla yapılarını değiştirmek ve onların organotypic Morfoloji ekimi sırasında kaybetmek ve bu nedenle temel araştırma5,6 ' uzun vadeli işlemler çalışmak için daha az uygun , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Difüzyon ve böylece besin kaynağı sınırlı12,13,14OHSC hayatta kalma oranı için başka bir kritik nokta dilim kalınlığı 's.

<table><tbody><tr><td>6-Well</td><td>Falcon</td><td>35-3046</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fluka</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Autoclav</td><td>Systec</td><td>DX-45</td><td></td></tr><tr><td>CFDA</td><td>&amp;nbsp;Thermo Fisher</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;acute;s Minimal Essential Medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>32360-034</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1101</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merk</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;acute;s Balanced Salt Solution (with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-133</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;acute;s Balanced Salt Solution (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>LN229</td><td>Cell-Lines-Service</td><td>300363</td><td></td></tr><tr><td>Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)</td><td>B.Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Culture Inserts</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>NMDA N-methyl-D-aspartic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Seum</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (all sizes)</td><td>Greiner</td><td>627160/664160/628160</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Roth</td><td>0335.1</td><td>toxic</td></tr><tr><td>Propidium iodid (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81845-25MG</td><td>toxic</td></tr><tr><td>U138</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT 1200</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC), sinir hücreleri ve gliyal hücreler morfolojik ve fonksiyonel özellikleri iyi korunmuş. Bu model dahil çalışmaları nöronlar, nöronal ağlar veya tümör işgali üzerinde Elektrofizyolojik deneyler neuroprotection üzerinde farklı araştırma soruları ele almak için uygundur. Hipokampal mimarisi ve multisynaptic devrelerde nöronal aktivite iyi OHSC, düz-se bile Dilimleme yordam başlangıçta lezyonlar ve gliyal yara oluşumuna yol açar korunmuş. Yara oluşumu muhtemelen mekanik özellikleri ve küçük moleküller, vbdiffusive davranışını değiştirir. Dilimleri Saat bağımlı süreçlerinin beyin hasarı hayvan cerrahi ve çeşitli beyin türetilmiş hücre tipleri, yani astrocytes, microglia ve fizyolojik ve patolojik altında nöronlar arasındaki etkileşimler çalışmaları olmadan sonra izleme izin koşullar. Bu model kararsız bir yönünü kan akımı ve bağışıklık kan hücreleri olmaması. Nöronal yaralanma ilerleme sırasında bağışıklık hücreleri kan oynamak önemli bir rol geçirme. Bu hücreleri dilimler halinde eksik olduğundan, içsel süreçleri kültür dış müdahale gözlenen. Ayrıca, OHSC orta-dış ortam bileşimi tam olarak kontrol edilir. Bu yöntem bir başka kurban hayvanların standart hazırlıkları için karşılaştırıldığında daha düşük sayıda avantajdır. Birkaç OHSC birden çok tedavileri ile eşzamanlı çalışmalar bir hayvan edinerek bir hayvandan elde edilebilir. Bu nedenlerden dolayı OHSC sonra doku hasarı veya tümör işgali sırasında yeni koruyucu tedavi etkilerini çözümlemek için uygundur.
Sunulan Protokolü burada üreten son derece tekrarlanabilir sağlar OHSC hazırlama yöntemi açıklar, iyi korunmuş deneysel araştırma, neuroprotection veya tümör işgali çalışmalar gibi çeşitli için kullanılan dilimler.

Neuroprotection çalışmaları: Nöronal hasar, PI olumlu çekirdek ve IB4 microglia dentat gyrus (DG) granül hücre Katmanı (un) her üçüncü optik bölümünde sayılan olumlu sayısını belirlemek için. Tümör işgali deneyler için maksimum yoğunluk z-projeksiyon yığının tümör hücreleri tarafından işgali ve farklı işgali desenleri (şekil 6) görselleştirmek için bir tedbir olarak bölgeyi hesaplamak için...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells at JoVE.com

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

organotypic-hippocampal-slice-cultures-as-model-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.8K Görüntüleme.  Martin Luther University Halle-Wittenberg. Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Video: Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Gelişim Biyolojisi

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Nörobilim

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Tıp

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early postnatal development, cerebellar Purkinje cells are known to go through a vulnerable period, during which they undergo programmed cell death. Here, we provide a detailed protocol to perform mouse organotypic cerebellar slice culture during this critical time. The slices are further labeled to assess Purkinje cell survival and the efficacy of neuroprotective treatments. This method can be extremely valuable to screen for new neuroactive molecules.

Organotypic slice cultures are a powerful tool to study neurodevelopmental or degenerative/regenerative processes. Here, we describe a protocol that models the neurodevelopmental death of Purkinje cells in mouse cerebellar slice cultures. This method may benefit research in neuroprotective drug discovery.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Renal Korteks-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Epileptogenez Modeli

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Establishing a Brain Tumor in an Organotypic Slice Co-culture Model

Source: Chadwick, E. J. et al. <a href="https://app.jove.com/v/53304">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of a 3D co-culture system. Mouse brain slices are placed on a membrane, and fluorescently labeled human brain tumor cells are allowed to grow on it. Once the system is ready, it is stained for imaging.

Organotipik Dilim Ko-kültür Modelinde Beyin Tümörü Kurulması

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plating the Slices onto the ...