Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biyomedikal Bölümü ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_141007) tarafından desteklenmiştir. Markus Saxer teknik destek sağladı.

Hayvan deneyleri 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür (2010/63 / AB) ve gözden ve İsviçreli yetkililer tarafından izin verildi. 1. Organotipik Entorhino-hipokampal Dilim Kültürler kurma <ol><li> Statik kuluçka yöntemi 4,11 kullanarak doğum sonrası güne 4 (P4) fare yavrularından entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri (EHOSCs) hazırlayın. Burada, C57Bl6 ve CB6F1 fareler kullanır. <ol><li> Örneğin dilim kültürlerinin hazırlanması için yavru fare başına yaklaşık olarak 30 dakika, 6 fare yavrular bir çöp 3 saat al. Steril cerrahi aletler ile bir laminer akış tezgah steril koşullar altında tüm adımları uygulayın. </li><li> Septorinoplastiyi zamansal ekseni boyunca dilimin konumundan muhtemel müdahaleyi önlemek için, yalnızca hipokampal septal yarısı dilim kullanır. Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> T kestiO cerrahi makas ile bir P4 fare yavru kafa. Resim anestezi Bu aşama için gereklidir. <ol><li> Beyin çevresinde kafatası çıkarın ve hemisferdeki ve orta beyinin kaudal ucu arasındaki fissür tespit. Dikkatle kafatasından orta beyin beynin rostral bir kısmını çıkarmak ve L-glutamin, stabilize edilmiş bir formu ile takviye edilmiş MEM oluşan buzla soğutulmuş Müstahzar ortamda yerleştirin. </li></ol></li><li> Beyin, buz gibi hazırlama ortamına daldırılmış edilir bir stereo mikroskop altında diseksiyon devam edin. Kortikal hemisferden kalan meninks çıkarın. Yarımkürenin orta kaudal yüzeyinde hipokampus belirlenmesi ve beynin geri kalanından komşu entorhinal korteks ile birlikte ayırın. <ol><li> Bir doku helikoptere doku aktarın ve hipokampus septorinoplastiyi-zamansal eksene aseptik koşullar altında çaprazlama 400 mikron kalınlığında dilimler kesilir. </li></ol></li><li> Ce üzerinde dilimlerini yerleştirinll kültür ekleri (yaklaşık 6 uç başına dilim) ve inkübasyon ortamının (47 mi, MEM, 25 mi Eagle Medium, oyuk başına 1 mi, 25 mi at serumu, bir 1 ml Glutamax I, 1 ml &#39;si ile 6-yuvalı plakalar içinde inkübe bunları 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde ve steril% 10 glükoz çözeltisi, pH 7.3). Konusu orta ertesi gün ve 1 hafta sonra her gün yukarı değiştirin. </li></ol> REPERFÜZYONUNDA Vitro Hipokside 2. ve Oksijen-glukoz Yoksunluk <ol><li> Prosedürün tam bir zaman çizelgesi için Tablo 1&#39;e bakınız. Hipoksi ve OGD&#39;ye maruz bırakılmadan önce 5 gün boyunca (DIV5) için kültür EHOSCs. Bu zaman noktasında, aşağıdaki bileşim ile serum içermeyen ortam,% 25 at serumu ihtiva eden inkübasyon ortamından orta geçiş: Neuro temelli vasat% 2 B27 takviyesi,% 1 Glutamax ve ilave% 0.1 glukoz ile birlikte. </li><li> Referans 7 bileşenlerin .The son konsantrasyonları ayrıntılı olarak aşağıdaki gibi olacaktır OGD ortamı hazırlayın: 0.3mM CaCl2, 70 mM NaCI, 5.25 mM NaHCO 3, 70 mM KCI, pH 6.8, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 ve 10 mM sukroz. Iki adet 6 oyuklu doku kültür plakalarının her bir oyuğuna OGD, ortamın 1 ml ilave edilir. <ol><li> Hipoksi bir odasında 1 saat süreyle N2 ile OGD, orta serpmek ve daha sonra sızdırmaz hale getirir ve tutmak O / 37 ° C&#39;de bir kuluçka K. </li><li> Hipoksik göstergeleri olarak anaerobik şeritler kullanın. Şeritlerin rengi beyaz pembeden değiştirildiğinde oksijensiz ortama düşünün. </li><li> Hypoxia, yerine OGD, ortamın glikoz ile serumsuz ortamı kullanmaktadır. Kullanmadan önce, OGD, orta kısmında anlatıldığı şekilde bir bölme hipoksi halinde N2 ile orta serpmek. </li></ol></li><li> Dilimleri OGD&#39;ye maruz kalan önce, 30 dakika süreyle N2 ile tekrar orta OGD, serpmek. 1 mg / ml propidyum iyodür (PI), 30 dakika boyunca dilimlerine (2 ug / ml &#39;lik son bir konsantrasyon için) oyuk başına çözeltisi ve seçmek, 2 uldeney için, sadece sağlıklı dilim PI pozitif hücrelerin düşük sayılar ile gösterildiği gibi. </li><li> . OGD maruz kalma ve reperfüzyon Şekil 1&#39;de gösterildiği zamanlamasını kullanın 15 dakika boyunca ya oksijen sadece (hipoksi) veya oksijen ve glikoz (OGD) dilimleri mahrum. <ol><li> Hipoksi ve OGD&#39;ye indüksiyonu için OGD ortamına dilim aktarmak ve hipoksi odası içinde 15 dakika için tutun. Kültürler, orta ve arka OGD düzenli ortamından açıldığında, insertin iki tarafında kalan tüm sıvı aspire emin olun. </li><li> Hipoksi ve OGD&#39;ye sonra, oksijenli serum barındırmayan ortam maddesi ile OGD, orta yerine ve kültürler,% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de normal inkübatörde serum barındırmayan ortam içinde 3, 24 veya 48 saat süre ile iyileşmelerine izin verilir. Hücre ölümü tespiti için tespit için önce yeniden PI ekleyin. </li></ol></li></ol> Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler 3. Farmakolojik Tedaviler <ol><li> Kültürfarmakolojik tedavilere maruz bırakılmadan önce, kuluçkalama ortamı içinde 5 gün (DIV5) e EHOSCs. Farmakolojik tedaviler sırasında veya hemen OGD&#39;ye dilim serumsuz ortama transfer zaman sonra OGD, ya başlatın. </li><li> OGD&#39;ye koruması için Tedaviler. <ol><li> OGD, 30 dakika boyunca, indüksiyondan sonra hemen 100 uM 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX) ya da (15 dk) OGD, indüksiyon sırasında kültür ortamına 1 uM Tetrodotoksin (TTX) veya ekleyin. Daha sonra, tespitten önce, 48 saat boyunca normoksik, serum barındırmayan ortam içinde inkübe edilir. </li></ol></li><li> Eksitotoksik ölüme indüksiyonu için tedaviler. <ol><li> Kuluçka ortamı anahtar kültürlerinde 5 gün sonra, 30 dakika boyunca 100 uM, (RS) -α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) içeren içermeyen ortam serum. </li><li> Aspirasyon (ekler üzerinde herhangi bir kalıntı orta kaldırmak için özen) tarafından AMPA içeren kültür ortamı çıkarın, sonra da normal serum serbest orta ve taze plakaları dilim aktarmakfiksasyon kadar 48 saat boyunca saklayın. </li></ol></li></ol> 4. Fiksasyon ve immün Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler <ol><li> Propidium iyodür (PI) boyama. <ol><li> 2 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda canlı dilimlerin kültür ortamına PI, 30 dakika boyunca ilave edin. Floresan optik ile donatılan bir ters mikroskop ile canlı kültürler el ve daha fazla tedavi için dilim seçmek. Immünhistokimya ile birlikte PI boyama için, önce kültürlerin tespit PI boňaltılması 30 dakika ekleyin. </li></ol></li><li> Dilimleri Fiksasyon. <ol><li> 6-delikli plaka kültür Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA), 3 ml ekleyin. Daha sonra, bir buzdolabı içinde 6 oyuklu plaka yerleştirilir ve 4 ° C&#39;de O / N düzeltin. </li><li> PFA çözüme ertesi gün çıkarın ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile dilimleri 3-4 kez yıkayın. </li></ol></li><li> Hücre kültürü i ikinci dilim uzaklaştırılmasınsert ve serbest yüzen bölümlerinin imünohistokimya için engelleme prosedürü. <ol><li> Dikkatlice ayırın ve boyutu 0 veya daha küçük bir sanat boya fırçası kullanılarak kültürü ekler gelen dilim çıkarın. (% 3 normal keçi serumu (NGS) ve 2% Triton-X100 ile PBS) ile bloke edici tampon ile doldurulmuş bir 96 gözenekli plakanın bir kuyuya her bir dilim aktarın. Orbital bir karıştırıcı ile sabit çalkalama altında, oda sıcaklığında 2 saat için bloke edici tampon dilimleri tutun. </li></ol></li><li> Dilim kültürlerin immün <ol><li> Etiketleme için kan damarları 1 bir seyreltme poliklonal anti-laminin kullanın: 200 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden. </li><li> PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 içeren 500: etiketleme nöronlar 1 bir seyreltme proteini 2 (MAP2) ilgili anti-mikrotübül kullanın. </li><li> Sürekli çalkalama ile 4 ° C&#39;de 48 saat için primer antikorlar ile inkübe dilimleri. İnkübasyon süresinden sonra, 3-4 kez,% 0.5 Triton-X100 ile PBS ile yıkayın. </li&gt; <li> İkincil antikorlar 1 seyreltin: 500 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden. Alexa fluorofor konjüge sekonder antikor ile karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe dilimleri. Alexa 350 veya 488 konjuge uygun keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare ikincil antikoru kullanın. </li><li> Ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) ile dilimleri üç defa yıkamak; cam slaytlar takar ve Mowiol ile slaytlar lamel. </li></ol></li><li> Lekelenmiş dilimlerin Mikroskopi </li><li> Epifloresans donanımları ile standart bir mikroskop veya bir konfokal mikroskop ile ya lekeli dilimleri gör. Uygun bir kamera ile çektiğiniz görüntüleri. Bazı görüntüler için, parlak arka planda koyu renkte boyalı gemileri elde etmek için floresan kontrast (Şekil 5 ve 6) ters çevirin. </li></ol> Kültürlerin Bölgesel Gemi Yoğunluk 5. Belirlenmesi <ol><li> Vesse niceliğiniReferans 8&#39;de tarif edildiği gibi kap geçişleri göre L. yoğunluğu. </li><li> Bu ölçümler için laminin lekeli dilimleri kullanın. Her grid kare başına 100 x 100 mikron, 0.25 mm 2 toplam alanına eşit bir 6 x 6 ızgara ile 10X büyütme Kayıtlı görüntüleri üst üste. </li><li> CA1, CA3, DG ve AK bölgede bindirme böyle üç ızgaraları (Şekil 2). Izgara çizgileri geçen gemileri saymak. </li><li> İyi bir istatistik alaka ile sonuç elde etmek için, fare yavru başına 3 dilim ile 3 fare yavrular, en az 3 bağımsız deneyde dahil her veri ölçümlerini yapmak. </li><li> Her bölge için ızgaralardan damar geçişlerinin ortalama değerini belirler ve uygun istatistik yazılımı kullanılarak (anlamlı olarak tanımlanan p &lt;0.05) post hoc test olarak Bonferroni düzeltmeli ANOVA ile istatistiksel analiz yapmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

Hayvan deneyleri 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür ve İsviçreli yetkililer tarafından yorumlanan ve izin verildi. Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada sunulan yöntemleri ile, hipokampal organotipik dilim kültürleri yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araç olarak kullanılabilir. Organotipik kültürler dilim damar değişikliklerinin eş zamanlı çalışma yeni özelliğine 7, iskemi 6 nöronal reaksiyonların araştırılması için geçmişte kullanılan olsa da önemli ölçüde bu yöntemin potansiyel uygulamaları artırır. OGD&#39;ye ya da tek başına Hypoxia organotipik k...

Merkezi sinir sistemi, damar ile kayıp ya da oksijen ve glükoz stokunda azaltılmasına özellikle duyarlıdır. Beyne kan sağlayan bile çok kısa bir kesinti tipik inme sendromu yol, ilgili beyin alanlarında fonksiyonunun bir şekilde kaybolmasına neden olabilir. Birincil etkilenen bölgelerde nöron kaybına ek olarak, tipik olarak ikincil zararlar yoluyla ek geciktirilmiş nöron kaybı bulunmaktadır. Ne yazık ki, şu ana kadar ikincil nöronal ölümün azaltılması için bir nöro-koruyucu bir tedavi 1 kullanılabilir. Ikincil hasar mekanizmalarının incelenmesi için gösterilen araştırma çabaları arasında orta serebral arter oklüzyonu ve çeşitli trombotik oklüzyon teknikleri gibi serebral iskemi ile ilgili deneysel modellerinin kullanımına dayalı (güncel bir değerlendirme için bakınız 2). Buna paralel olarak,, aynı zamanda, sınırlama ve hayvan modellerinde, çeşitli merkezi sinir sistemi dokuların Organotipik kesit kültürünün kullanımı ile etik kaygılar Stu izin veren kullanılmıştıryaralanma 3-5 çeşitli tip nöronal reaksiyonların dy. Iskemik beyin yaralanmasının taklit koşullarda nöronal reaksiyonun incelenmesi için, oksijen glikoz yoksunluğu model sistem (OGD) geliştirilmiştir. Bu modelde, dilim kültürler geçici olarak glikoz yoksun ve oksijenin yokluğunda azot gazı ile dengeye getirilmiş olan bir ortama maruz bırakılır. Bu tür bir işlem ile, in vivo 6, 7 iskemik yaralanma sonrası gözlenen ile oldukça benzer nöronal yaralanma ve kaybını uyarmak mümkündür. Hipokampta, böyle bir tedavi olarak, özellikle CA1 nöronal kaybı uyarmaktadır ama CA3 alan veya hipokampus dentat girus. Bunun aksine, kesit kültürlerinde vasküler reaksiyonların Bu güne kadar geniş ele edilmemiştir. Bir belirgin bir neden dilim kültürü modelinde dolaşım ve kan damarı perfüzyon olmamasıdır. Bununla birlikte, bu B korumak mümkün olduğunu göstermiştikMSS lood gemiler 9, birkaç gün 8 kültürleri dilim. Bu yöntemin genel amacı OGD&#39;ye sonra nöronların kaderi izlemek, ancak yaralanma yanıtın önemli bir parçası olan damar kaderi ve biçimlenme çalışma genişletmek için değil sadece. Şimdiye kadar bu tür çalışmalar, hayvan deneylerinde kullanımını gerektirmiştir (. De Jong ve arkadaşları, 1999; Cavaglia ve diğerleri, 2001.). Protokol Burada yer olarak, bu tür çalışmalar, hipoksi ile birlikte ya da her ikisi nöronal hayatta kalma ve damar reaksiyonlarının analizi ile takip eksitotoksik lezyonlar ya meydan entorhino-hipokampal kesit kültürlerinde Organotipik detay yapılabilir nasıl. Bu protokol, bu konuda 10 önceden yayımlanan bir çalışmada dayanmaktadır ve MSS nörovasküler etkileşimleri ilgilenen herhangi bir laboratuvar için yararlı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

İskemik beyin hasarı uygun beyin işlevini kaybetmesine en yaygın ve yıkıcı koşullar arasında ve genellikle etkilenen hastalarda fonksiyon kaybı devam eden yol açar. Yoğun araştırmalara rağmen, halen nöronal hasarı azaltır ve geciktirilmiş ikinci ölüm iskemik alanlarda nöronları korur hiçbir etkili bir tedavi seçeneği yoktur. Bu alanda yapılan araştırmalar, tipik olarak karmaşık ve sorunlu hayvan modellerinin kullanımını içerir. Oksijen ve glikoz mahrumiyet (OGD) ile meydan Entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri serebral iskemi taklit in vitro modellerinde kurulmuştur. Bu çalışmada yeni veçhesi, beyin kan damarları ile karşılaştırılır değişiklikler korele edilebilir, nöronal ve nöronal değişiklikler bölmesi ve vasküler bölmesinin her iki reaksiyona ek olarak incelenmiştir olmasıdır. Bu protokol sunulan yöntemler ölçüde potansiyel uygulamalarını genişletmek veyaganotypic dilim kültür yaklaşım. OGD&#39;ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ile uygulanabilir ve nöronal dokuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir hasara neden olabilir. Bu in vivo inme ve iskemi teşvik karmaşık ve sorunlu hayvan deneylerinde tezat olduğunu. Analizini genişleterek korumak ve beyin fonksiyonlarını geri nasıl yeni yollar sağlayabilir damar reaksiyonu çalışma dahil. Burada sunulan dilim kültür yaklaşımı iskemik beyin hasarının çalışma için cazip ve önemli bir araç haline olabilir ve nöro yönelik potansiyel terapötik önlemlerin test edilmesi için yararlı olabilir.

Oksijen glikoz yoksunluğu ve hipoksi hipokampal CA1 bölgesinde özellikle nöronal ölüm ve kan damarı azalmaya neden. Daha önce tarif edildiği gibi, 7 &#39;e benzer hipokampus (Şekil 3) CA1 bölgesinde spesifik olarak, propidyum iyodür boyaması yolu ile görüldüğü gibi OGD, veya oksijen-yoksunluk sadece 15 dakika boyunca hücre ölümünün kuvvetli bir uyarımının neden olmuştur. Belirteçler kan damarlarının ağ görselleştirmek ile, damar yoğunluğu ve ...

Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Görüntüleme.  University of Basel.  Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır. 

Video: The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Nörobilim

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Dilim hazırlanması, Organotipik Doku ekimi ve suprakiazmatik nükleus Saat Gen Faaliyet Lusiferaz Kayıt

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...