Name: cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

Maya hücrelerinin 1. Büyüme ve Hasat <ol><li> Bir endojen maya protein degradasyon kinetiği analiz değilse, ilgili proteini kodlayan bir plazmid ile arzu edilen maya suşu (ler) dönüşümü. Maya transformasyonu için güvenilir yöntemler, daha önce 37 tarif edilmiştir. </li><li> Uygun bir ortamda 5 ml maya inoküle (örneğin, dönüştürülmüş hücreler ya da dönüştürülmemiş hücreler için seçici olmayan bir maya ekstresi-pepton dekstroz (YPD) orta plasmid bakımı için Seçici Sentetik tanımlanan (SD) ortamı). döner, 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Not: 30 ° C, tipik vahşi tip laboratuar maya kökleri 38 için en uygun bir büyüme sıcaklığıdır. Mutant maya cinsleri, 30 ° C &#39;de en iyi şekilde büyümez ve bazı proteinler sıcaklığa bağlı bozunmaya maruz Ancak, maya hücresi büyümesi ve sikloheksimid Chase için kullanılan sıcaklıklar deneysel 39 tespit edilmelidir. </li><li> th ölçünHer gecede kültür, 600 nm (OD 600) e optik yoğunluk. Not: Hücreler logaritmik ya da sabit büyüme fazında olabilir, fakat minimal = OD 600 seyreltme izin 0.2 ml taze ortam 15 bir yoğunluğa ulaştığı olmalıdır. </li><li> Taze ortam 0.2 15 ml&#39;lik bir OD 600 değerine gece boyunca kültürler ile seyreltilir. </li><li> Hücreler, orta-logaritmik büyüme fazı ulaşana kadar çalkalanarak 30 ° C&#39;de inkübe edin maya (örneğin, OD 0.8 ve 1.2 arasında, 600). </li><li> maya hücre büyümesi sırasında, sikloheksimid kovalamaca prosedürü için hazırlık aşağıdakileri gerçekleştirin: <ol><li> sikloheksimid mevcudiyetinde hücre inkübasyon için 30 ° C, 15 ml konik tüpü bir ısıtma bloğu ayarlayın. kültürlere verimli ısı dağılımını sağlamak için ısı bloğu çukurlarına su eklenir. 15 ml konik tüp, su seviyesi taşma yükselecek, ancak iyi bir dudak neden olacağını her kuyu gibi su ekleyin. </li><li> hücre lisizini takiben protein denatürasyonu 95 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ikinci bir ısıtma bloğu ayarlayın. </li><li> Ön sıcak taze büyüme ortamı, 30 ° C (analiz edilecek kültür başına zaman noktası başına 1.1 mi). </li><li> 50 ul 20x Durdurma Mix ekle (kültür başına bir tüp zaman başına nokta denenecek) mikrosantrifüj tüpleri önceden etiketlenmiş. buz üzerinde tüpler yerleştirin. DİKKAT: sodyum azid, 20x Durdurma Karışım bir madde, oral yoldan ya da deri teması ile toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve sodyum azit tutarken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın. </li></ol></li><li> Hücreler, orta-logaritmik büyüme ulaştığı zaman, her zaman noktasında her kültür 2.5 OD 600 birim toplamak (örneğin, 7,5 OD 600 tane üç zaman noktasında protein bolluğu analiz etmek için) tahlil edilecek. Santrifüj Eğer 3,0, 15 ml konik tüplerde hücreler toplanmış2 dakika boyunca oda sıcaklığında 00 xg. NOT: Bir OD 600 ünite OD 1.0 600, 1 ml kültüre mevcut maya miktarına eşittir. V = x OD 600 birim / OD 600 ölçüm süresi: X, OD 600 birim (V) hasat için gereken kültür (ml) hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir. Örneğin, bir OD 1.0 600 maya hücresi kültürü 7.5 OD 600 birim hasat 7.5 OD 600 birim / 1.0 = 7.5 ml maya kültürü toplamak. </li><li> 30 ° C (7.5 OD 600 birim örneğin, 3 ml), hücrelerin 2.5 OD 600 birimi başına (önceden ısıtılmış), taze büyüme ortamı, 1 ml her bir hücre pelletini. </li></ol> 2. Siklohekzimid Chase <ol><li> 30 ° C ısı bloğu 5 dakika boyunca kuluçkalama ile maya hücre süspansiyonları dengelenmesi. </li><li> 0:00 kadar saymak için bir zamanlayıcı hazırlayın. </li><li> zamanlayıcı sikloheksimid kovalamaca, basın &quot;Başlat&quot; başlayacak. hızla,ama dikkatle, aşağıdaki adımları gerçekleştirin: <ol><li> İlk maya hücre süspansiyonuna, 250 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar sikloheksimid ekleme (örneğin, hücre süspansiyonu, 3 ml, 20 mg / ml siklohegzimid stokunun 37.5 ul), ve vorteks kısa bir süre karıştırmak. DİKKAT: Siklohekzimid dermal tahriş ve ağız yoluyla ilaç yoluyla toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve Siklohekzimidsiz işlerken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın. </li><li> Hemen sikloheksimid ve vorteks ilave edildikten sonra, 50 ul buz soğukluğunda 20x durdurma karışımı ihtiva eden bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sikloheksimid maya hücre süspansiyonu 950 ul (~ 2.4 OD 600 birim) aktarın. Tüm örnekler toplanmıştır kadar buz üzerinde ependorf tüp, ve yer Vortex. </li><li> 30 ° C&#39;ye kadar maya hücre süspansiyonu geri dönün. </li></ol></li><li> Adımları tekrarlayın 2.3 ile 2.3.1.3 Düzenli zaman aralıklarında (kalan maya hücresi süspansiyonları her biri için, örneğin, sikloheksimid ilave edilir, öyle ki, her 30 saniye, 1:00 de, 0:30 de, 0:00 de örnek # 3 Örnek 2. 1. Numune vb.). </li><li> sonraki her zaman noktasında 50 ul önceden soğutulmuş 20x Durdurma Mix ihtiva eden etiketli mikrosantrifüj tüplerine vorteks maya hücresi süspansiyonları ve transfer 950 ul. Vortex ve buz üzerinde yer hücreler toplandı. 30 ° C ısı bloğu 15 ml konik tüpler dönün. <ol><li> Örneğin, 30 dakika sikloheksimid ilave edildikten sonra hücrelerin toplanması için, girdap (zamanla başlangıcında, maya hücre süspansiyonlarına sikloheksimid ilave arasında 30 saniyelik aralıklarla varsayarak) ve 30:00 de örnek # 1 hücre süspansiyonu 950 ul çıkarın . böylece 30:30 de örnek # 2 için tekrarlayın ve. Not: Chase süresince konik tüp yaklaşık 5 dakika 15 ml maya, girdap hücre süspansiyonları oturmasını önlemek için. Alternatif olarak, maya hücre süspansiyonus sikloheksimid takip deney süresince sürekli olarak ajite su banyosu içinde muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Tüm numuneler toplanmıştır sonra, pelet 30 saniye boyunca oda sıcaklığında 6500 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplandı. pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. Hücreler artık alkali lizis için hazır. Seçenek olarak ise, ek bileşen dondurularak sıvı azot ve mağaza pelet hücreleri -80 ° C&#39;de ilave edildi. </li></ol> 3. Post-alkali Protein Ekstraksiyonu (16,40 den Modifiye) <ol><li> Her hücre pelletine damıtılmış suyun 100 ul ekle. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks tarafından süspanse edin. </li><li> Her bir örnek için 0.2 M NaOH, 100 ul ekle. yukarı pipetleme ve aşağı ya da vorteks karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında süspansiye edilmiş hücreler inkübe edin. Bu aşamada, maya hücreleri lize edilmemiştir ve proteinler 40 serbest edilmemiştir. </li><li> Oda öfke 18.000 xg santrifüj Pelet hücreleri30 sn için çalıçtırdıgınızda. pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> , Hücreler lize edildi Her hücre pelletine Laemmli numune tampon 100 ul ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks tarafından süspanse edin. Not: Tris-glisin çalışan tamponu sistemi kullanılarak sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir biçimde NaOH ve Laemmli numune tamponu bültenleri proteinleri ile hücrelerin ardışık inkübasyon. </li><li> 5 dakika tam proteinleri denatüre etmek için 95 ° C&#39;de inkübe edin. Not: 95 ° C&#39;de inkübasyon toplama eğilimli proteinlerin analizi için uygun değildir (örneğin, çeşitli transmembran segmentlerle proteinleri). Yüksek sıcaklıklarda 41 ° C&#39;de inkübe bu proteinler çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, bu tür proteinlerin analizinde, lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 dakika, hem deneysel olarak belirlenebilir. </li><li> ro 18.000 xg&#39;de santrifüj lizatları1 dakika için OM sıcaklığı çözünmeyen malzeme peletlendi. Süpernatan (çözünebilir ekstre protein), SDS-PAGE ve ardından Western blot analizi ile ayrılması için hazır hale gelir. Alternatif olarak, -20 ° C&#39;de mağaza lizatları. </li></ol> 4. Temsilcisi SDS-PAGE ve Western Blot Prosedürü (16 uyarlanmıştır) <ol><li> Yük proteini moleküler ağırlık standartları ve bir SDS-PAGE jeli üzerine lizatları ampirik bir biçimde tespit hacmi. Not: ilgilenilen proteinin moleküler ağırlığı bazında SDS-PAGE jeli akrilamid ve bis-akrilamid yüzdesini seçin. Genel olarak, düşük bir yüzde jeller yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin çözülmesi için daha uygundur. </li><li> boya ön kadar 200 V çalıştırmak jel jel alt kenarı ulaşmıştır. </li><li> 4 ° C&#39;de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florit (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın. </li><li> (TBC Tris tamponlu tuz içinde kuluçkalanmasıyla zar blokeS),% 5 kaymağı alınmış süt içeren, 1 saat boyunca veya bütün gece 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında, sallanan. Not: gece boyunca inkübe bir membran mevcudiyetinde mikrobiyal büyümeyi önlemek için,% 0.02 nihai bir konsantrasyonda bloke çözeltisi içinde sodyum azit dahil edilmesi önerilmektedir. </li><li> 1 saat süre ile, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ve% 1 yağsız süt, sallanan TBS daki protein için spesifik primer antikor ile membran inkübe edin. </li><li> sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın. </li><li> Sallanan 1 saat boyunca oda sıcaklığında% 1 yağsız süt ile TBS / T uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. NOT: Flüoroforlar ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, florofor konjüge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmıştır ve membranların ışık geçirmeyen (ör, metal yaprak sarılı) co gerçekleşmelidir fluorophores ve daha sonra yıkama aşamasına konjuge antikor varlığında olmalıdırntainers. </li><li> sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın. </li><li> LI-COR Odyssey CLX ve üretici tavsiyelerine aşağıdaki Image Studio yazılımı (ya da benzer görüntüleme cihazları ve yazılım), kullanarak görüntü membran. </li><li> Membran görüntü aldıktan sonra, sallama, 1 saat süre ile, oda sıcaklığında,% 1 yağsız süt ile TBS / T içinde bir yükleme kontrol proteini için spesifik bir primer antikor ile membran inkübe edin. </li><li> sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın. </li><li> Sallanan 1 saat boyunca oda sıcaklığında% 1 yağsız süt ile TBS / T uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. </li><li> sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın. </li><li> Adım 4.9 gibi görüntü membran. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yazıda, protein yıkımı kinetik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik hali hazırda çeşitli mekanizmalar ile bozulmuş proteinler, bir dizi uygulanabilir. Sikloheksimid kovalamaca deneyleri belirli bir proteinin kararlı durum havuzunun bozulma kinetiği rapor dikkat etmek önemlidir. Diğer teknikler proteinlerinin spesifik popülasyonlarının degradasyon kinetiğinin analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, doğmakta olan polipeptidlerin parçalayıcı kaderi darbe kovalamaca analizi ...

Proteinler hemen her hücresel süreçte önemli işlevleri yerine getirir. Pek çok fizyolojik işlem zaman ya da belirli koşullar altında, belirli bir süre için belirli bir protein (ya da proteinlerin) varlığını gerektirir. Organizmalar nedenle izlemek ve hücresel ihtiyaçlarını karşılamak 1 protein bolluğu düzenler. Örneğin, siklinler (hücre bölünmesini kontrol eden proteinler), hücre döngüsünün belirli aşamalarında mevcut olduğu ve düzenlenmiş siklin seviyelerinin kaybı habis tümör oluşumu 2 ile ilişkili olmuştur. Hücresel ihtiyaçlarını karşılamak için, protein düzeylerinin düzenlemenin yanı sıra hücreler, yanlış katlanmış, birleştirilmemiş ya da başka anormal bir protein moleküllerini 3 ortadan kaldırmak için bozundurucu bir kalite kontrol mekanizmaları kullanır. protein oranından kontrol makromoleküler sentezinin (kopya ve çeviri) ve bozulmaya (RNA çürüğü ve proteoliz) hem düzenlenmesini içerir. Bozulmuş veya aşırı protein yıkımı birden patolojilerin katkıdaKanser, sistik fibroz, nörodejeneratif koşullar, ve kalp-damar bozuklukları 4-8 dahildir. Proteolitik mekanizmaları nedenle hastalıkların 9-12 aralığı için gelecek vaat eden terapötik hedeflerini temsil eder. Tek bir zaman noktasında proteinlerin analizi sentezi veya bozulma göreli katkılarını vermeden kararlı durum proteini bolluğu anlık görüntüsünü sağlar (örneğin, western blot 13 ​​tarafından, sitometri 14 veya floresan mikroskobu 15 akış). Benzer bir şekilde, büyüme göre raportör testleri sentez ve degradasyon 15-20 etkilerini ayırt olmadan uzun bir süre boyunca sabit durum protein seviyesini göstermektedir. Daha önce bolluk karşılaştırarak ve farmakolojik prote inaktive ederek, örneğin parçalayıcı mekanizmasının (belirli bileşenlerini inhibe sonra kararlı durum protein düzeyleri parçalayıcı süreçlerin katkısını anlaması mümkünasome 21 veya varsayılmış bir gen nakavt bozulması 13) için gerekli olduğu. Parçalayıcı yolları inhibe sonra kararlı durum protein düzeylerinde bir değişiklik protein bolluğu 13 kontrolüne proteoliz katkısı için güçlü kanıtlar sağlar. Ancak, bu tür bir analiz de protein döngüsü kinetiği ilişkin bilgi sağlamaz. Batı blot takip Siklohekzimid kovalamaca araştırmacılar zaman 22-24 üzerinde protein parçalanmasını görselleştirmek için izin vererek bu zayıflıkları üstesinden gelir. Sikloheksimid Chase, aşağıdaki protein saptama, batı lekeleme, radyoaktif izotoplar ve uzun immünopresipitasyon aşamalarla gerçekleştirilir, çünkü daha fazla, aynı zamanda protein degradasyonunu 25 görselleştirmek için gerçekleştirilen çok sayıda yaygın olarak kullanılan darbe takip teknikleri, farklı olarak, sikloheksimid Chase gerekli değildir. Sikloheksimit birinci anti-mantar, uygun olan bir bileşik olarak tanımlanmıştır26,27 griseus gram-pozitif bakteri Streptomyces tarafından üretilen kravatlar. Özellikle ribozomal translokasyonu 28-31 bozarak ökaryot sitozolik (ama organel değil) çeviri inhibe eden hücre geçirgen bir moleküldür. Bir sikloheksimid Chase deneyde, sikloheksimid hücrelere ilave edilir ve hücre numuneleri, hemen ve bileşik 22 ilave edildikten sonra belirli zaman noktalarında alınır. Hücreler lizlenir ve her zaman noktasında bir protein bolluğu tipik western blot ile analiz edilmiştir. güvenle protein yıkımı atfedilebilir siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki proteini bolluğu azaltır. nispeten istikrarlı bir protein bolca az değişiklik gösterecektir sırasında bir kararsız protein, zamanla bolca azalacaktır. seçici protein yıkımı mekanizmaları son derece ökaryotlarının boyunca muhafaza edilmiştir. protein yıkımı hakkında bilinen çok ne ilk öğrenildiModel tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) 25,32-36. maya ile yapılan çalışmalar protein yıkımı içine yeni ve önemli bilgiler sunmaya devam etmek olasıdır. protein oranından Western blot analizi ile, ardından maya hücrelerinde sikloheksimid Chase bir yöntem sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>A tube roller is recommended to maintain overnight&amp;nbsp; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&amp;nbsp;</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heaters</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &amp;deg;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td></tr><tr><td>Heating block for 12 x 15 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td></tr><tr><td>Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Protein bolluğu Yönetmelik hemen hemen her hücresel süreç için çok önemlidir. Protein bolluk protein sentezi ve protein yıkımı oranları entegrasyonunu yansıtmaktadır. Protein bolluk raporlama birçok tahliller, protein düzeyleri çeviri ve proteoliz göreli etkilerinin ayrımcılığa izin vermez (örneğin, tek zamanlı noktası batı lekeleme, sitometri floresan mikroskobu veya büyüme-temelli muhabir deneyleri akış). Bu makalede, özellikle model, tek hücreli ökaryot protein parçalanmasını analiz etmek batı blot takip sikloheksimid kovalamacanın kullanımını, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) açıklar. Bu prosedürde, maya hücreleri translasyonel önleyicisi sikloheksimid mevcudiyetinde inkübe edilir. Hücrelerin alikotlan sonra siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki özel zaman noktalarında hemen toplanır. Hücreler lizlenir ve lisatlar fo poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılırHer bir zaman noktasında, protein bolluğu Western blot analizini r. sikloheksimid Chase prosedürü hücresel proteinlerin çeşitli sabit durum nüfusun degradasyon kinetiğinin görselleştirme izin verir. Prosedür protein yıkımı üzerinde genetik gereksinimleri ve çevresel etkileri araştırmak için kullanılabilir.

Sikloheksimid Chase yöntemi göstermek için, Deg1 -Sec62 stabilitesi (Şekil 1) bir model maya endoplazmik retikulum (ER) -associated bozulması (ERAD) alt-tabaka, 42-44 analiz edilmiştir. ERAD, kalite kontrol ubikuitin ligaz enzimleri kovalent ER zarında lokalize anormal proteinlerin küçük bir protein ubikitinin zincirlerini takın. Böyle polyubiquitylated proteinler daha sonra ER kaldırılır ve proteazom, büyük, sitozolik proteaz 45...

Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.8K Görüntüleme.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Video: Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Gelişim Biyolojisi

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Belirli ve verimli protein tükenmesi elde etmek için bozulma ayarlama

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biyoloji

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

Saccharomyces cerevisiae'de 5-Etinil-2'-deoksiüridin Kullanımı Kullanılarak S-Faz Süresinin Belirlenmesi

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

Saccharomyces cerevisiae Yeast as a Model Organism

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

Education

JoVE Science Education

Temel Biyoloji

Biyoloji I: Maya, Drosophila ve C. elegans

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler