Biz plazmid ve maya suşları için S. cümbüş Robertson ve E. Heidenreich teşekkür P. Pham ve MF Goodman yardım withthe TLS tahlil için. Bu çalışma, Amerikan Federasyonu tarafından Yaşlanma Araştırma hibe için, NIH AG20642, AG025135 tarafından kısmen desteklenmiştir.

İki ömrü modelleri S. yaşlanma çalışma var cerevisiae: Huzursuz bacak sendromu ve CLS. Replikatif (tomurcuk) ömür (HBS), maya anne hücreleri bölümler 3-6 sonlu sayıda geçmesi gözleme dayanır . Biz kronolojik ömrü (CLS), kronolojik yaşam, kültür ya da plakaları 7-11 olmayan bölünmesi maya dayalı bir model üzerinde durulacaktır. Wild tip maya sentetik dekstroz tam (SDC) orta 10-12 saat boyunca katlanarak büyür . Glukoz seviyesini düşüren, maya fermantasyonu sonucu solunum anahtarlar, bir süreç diauxic kayması olarak adlandırılır. Hücreler G 0 tutuklama girmeden önce yaklaşık 48 saat sonrası diauxic aşamasında yavaş bölmek için devam ediyor. Hücrelerin metabolik hızı gün 5-6 (0 gün aşılama gün) kadar yüksek kalır. G 0 tutuklama ve form zengin YPED plakalar üzerinde koloni çıkabilirsiniz her iki günde bir örneklenmiş kronolojik yaşlanma hücrelerinin yüzdesi, zamanla hücre canlılığı ulaşılabilir. 1. Maya kronolojik ömrü sıvı kültüründe (CLS) <ol><li> 1 ml tam sentetik şekeri orta (SDC, Tablo 1) tek bir koloni İnokülasyon ve 30 (220 rpm) sallayarak gece boyunca inkübe ° C Üç bağımsız koloniler inoculums biyolojik kopyaları sağlamak için her bir suş için hazırlıklı olmalısınız. </li><li> OD taze SDC orta (genellikle 10 ml) içine bir gecede kültür sulandırınız = 0.05-0.1 (~ 1:100 dilüsyon) ve 30 (220 rpm) sallayarak inkübe ° C Bu zaman noktası, kronolojik yaşlanma gün 0 olarak kabul edilir. Uygun havalandırma sağlamak için bir kültür / balon hacmi (10 ml, 50 ml kültür, ya da daha uzun / geniş deneyler 125 ml 25 ml kültür) 01:05 oranını korumak. </li><li> 3. gün başlayarak, 2 alikotları şişeden 10 ul kaldırmak, YEPD (% 1 maya özü,% 2 bacto pepton, 2% dekstroz otoklava su, 10 ul seyreltilmiş kültürü (yani, 10 4 -10) 10.000 kez seyreltilmiş % 2 agar) plakaları ve birleştirmek (CFU) oluşturan koloni sayılır önce 48-72 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 3. Gün CFU% 100 hayatta kalma kabul edilir. ~ 20-100 koloniler CFU testi (örneğin, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, vb) sağlamak için, sonraki gün yaşlanma kültür Seyreltme faktörü buna göre düzenlenmelidir . DBY746 arka planda vahşi tip hücreler için, CLS, 11 gün% 1 civarına hayatta kalma ulaşır. </li></ol> In situ canlılığı tayininde Varyasyonları şunlardır : <ul><li> Kalori kısıtlaması glikoz sınırlama (CR). Glikoz sınırlı SC orta gecede kültür seyreltilmesi (örneğin, standart% 2 glukoz yerine% 0.5 veya 0.05), genellikle 3. gününde düşük nüfus doygunluk yoğunluğu yol, ancak çok ömrü 12 (10% sağkalım), ortalama ve maksimum uzatıldı. </li><li> Aşırı CR / açlık için, (eşit hacimde su tekrar süspansiyon hücreleri ve 3 kez tekrarlayın, 2500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca aşağı spin) otoklava su ile günde 3 sabit faz kültürü (genellikle 10 ml olarak yukarıdaki adım 3) yıkayın. Su Incubationof hücreler maya vahşi karşılaşabileceğiniz açlık durumu taklit eder. Her iki günde bir daha sonra yaşlanma kültür otoklava su ile yıkanır ve parçalanmış ölü hücrelerden salınan herhangi bir besin kaldırmak için eşit miktarda su yeniden süspanse edilmelidir. Yukarıda açıklandığı gibi yaşlanma kültürü örneklemesi, canlılığı tahlil gerçekleştirin. Bu açlık durumu vahşi tip DBY746 suşu 12 ortalama CLS neredeyse iki katına yol açtı. </li></ul> 2. in situ canlılığı tayininde Sıvı kültüründe, hayatta kalan hücrelerin küçük bir kısmını hücre döngüsü yeniden girdi ve kalan besin ya da orta parçalanan bu ölü hücreleri serbest formu kullanarak büyümek, bir fenotip regrowth olarak adlandırdığı / 13 nefes nefese . DBY746 suşu (trp1) auxotrophy regrowth / nefes nefese sorunu aşmak için kullanır ve aynı zamanda sürekli maruz kalma ya da yoksunluk, çeşitli dış besin veya maya uyaranların etkisi test izin canlılığı-on-a-plate sistem geliştirdi. CLS 11. Bu aynı zamanda in situ canlılığı tayininde hücreler sürekli ömrü analizi boyunca bol miktarda besin maruz kaldığı bu tür replikatif ömrü modeli taklit eder . <ol><li> 1 ml tam sentetik şekeri orta (SDC) tek bir koloni İnokülasyon ve 30 (220 rpm) sallayarak gece boyunca inkübe ° C En az üç bağımsız koloniler inoculums biyolojik kopyaları sağlamak için her bir suş için hazırlıklı olmalısınız. </li><li> Kültür ~ 10 8 hücre / ml (OD 600 = ~ 10) büyümeye culturewith otoklava su sulandırmak, 100-200 cell/10 ul (genellikle 10 4 kat seyreltme) ve 1.000 cells/10 ul (10 3 kat dilüsyon). </li><li> Plaka bir triptofan okulu terk SDC plaka üzerine seyreltilmiş kültür 10-30 ul iki alikot. Içinr ve her bir suş, 8 ila 20 plakaları bir dizi hazırlamak ve kaplama yoğunluğuna göre etiketli (örneğin, 10 4 kat seyreltik, plaka 10 ul veya 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , vb), 10-100 koloniler yaşlanma sırasında azalma canlılığı beklentisiyle sayılabilir sağlamak. </li><li> Plaka ömrü analiz süresi 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kaplama yapıldığı gün ve daha sonra her 2 günde bir, bir plaka ve açılan akıllı kaldırmak canlı hücrelerin büyümesine izin 0.5 ml Triptofan (2 mg / ml) ekleyin. Plaka ek 48-72 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. Triptofan ek gününde canlılığı için CFU güvenin. Kaplama gününde CFU% 100 hayatta kalma kabul edilir. </li></ol> In situ canlılığı tayininde Varyasyonları şunlardır : <ul><li> Agar plaklarına Yaş hücreleri (aşırı açlık koşul). Ekle 1 ml 2x sonraki gün izin büyüme ve CFU sayısı 14 yerine triptofan YPED. </li><li> Yaş hücreleri çeşitli karbon kaynakları, örneğin glikoz çeşitli konsantrasyonlarda (glikoz sınırlama kalori kısıtlaması), etanol gibi çeşitli karbon kaynakları, gliserol, asetik asit 14 triptofan okulu terk sentetik tam orta plakalar. Büyüme ve CFU sayısı izin için 1 ml glukoz / triptofan solüsyonu (% 20 glikoz ve 1mg/ml triptofan) ekleyin. </li><li> Gibi azot gibi diğer besin manipülasyon. </li></ul> 3. Kronolojik yaşlanma sırasında DNA hasarı ve mutasyon sıklığı Canavanine direnci (Can r) ve can1 sıralama Spontan mutasyon sıklığı, kronolojik yaşlanma kültürlerde canavanine direnci (Can r) frekans ölçerek değerlendirilir . Plazma arginin permease kodlar CAN1 (YEL063) gen, mutasyonlar, farklı zaman noktalarında toplanan arginin analog L-canavanine.Can r koloniler karşı dirençli olan hücreler de genomik DNA ve CAN1 sonraki sıralama çıkarılması için kaydedilebilir hale gen mutasyonu spektrum verileri (Mutasyon Surveyor ile SoftGenetics) sağlayabilir. Temel değiştirmelerin (Trp + reversions) Trp1-289 ile Suşlarının TRP1 kodlama sırayla sarı mutasyon (C403T) içerir. Trp + reversion 15 trp1-289 frekans ölçümü maya Kronolojik yaşlanma sırasında baz ikame oranı tahmini sağlar. Çerçeve-kayması mutasyonları Lys - suşu EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200 ura3-52, ade2-1o) LYS2 gen bir BGL II restriksiyon enzimi sitesi oluşturmak için 4 nükleotidler takarak inşa edilmiş bir lys2ΔBgl II mutasyon limanlar . Ekleme / silme küçük mutasyonların 16-17 ters olabilir lisin için auxotrophy açık okuma çerçevesi sonuçları sonucu 4 vardiya. Brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs) Brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs) saptamak için, hangi HXT13 (YEL069), son derece gereksiz bir heksoz taşıyıcı kodlama, bir URA3 kaset 18 kesintiye uğramıştır, bir mutant suşu oluşturulur. HXT13 CAN1 için telomerik 7.5 kb V. Mutasyonlar kromozom bulunur CAN1 ve URA3 genler hem de sırasıyla, L-canavanine ve 5-fluoroorotic asit (5FOA) hücreleri direnç veren. R 5FOA r frekans hem genler, analiz meydana gelen nokta mutasyonu düşük frekanslı göz önüne alındığında, hem genlerin kaybına neden GCRs bir tahmin sağlar. Homolog ve homeologous rekombinasyon Homolog ters yineler (IRS) (pSR406% 100 ya da taşıma: Kronolojik yaşlanma sırasında homolog seviyesi (% 100) ve homeologous rekombinasyon (% 91) izlemek için, biz lineerleştirilmiş plazmid (intron-IR-URA3 HIS3) mutantlar oluşturulan ) veya IRs homeologous HIS3 lokus 19% 91 (pSR407). IRs arasında Rekombinasyon fonksiyonel His3 protein ifade sağlar. <ol><li> Normal canlılığı assay (yukarıda açıklandığı gibi) paralel olarak, yaşlanma kültür hücreleri, uygun bir miktarda kaldırmak <ol><li> Can r mutasyon, ~ 2x10 7 hücre (3 gün kültür ul 200) ile başlar; </li><li> Trp + reversion, ~ 10 8 hücreleri (3 gün kültür 500-1000 ul) ile başlar; </li><li> Lys + çerçeve kayması mutasyonu için ~ 10 8 hücreleri (3 gün kültür 500-1000 ul) ile başlar; </li><li> GCRs, 2-3x10 8 hücreleri (2-3 ml 3. gün kültür) ile başlamak; </li><li> homolog ve homeologous rekombinasyon &amp; tilde ile başlamak5x10 7 hücre (200-500 ul gün 3 kültür); </li></ol> kaplama miktarı, toplam canlılığında azalma ve Kronolojik yaşlanma sırasında (Tablo 2) mutasyon sıklığı artış göre ayarlayın . Hypermutator fenotip ile suşların (DNA onarım eksiklikleri olanlar gibi) durumunda, buna göre örnekleme miktarını azaltmak. </li><li> Pelet tezgah üstü santrifüj makinesi (5 dakika için 6000 rpm) hücreler. </li><li> 1 ml otoklava su, ve pelet hücrelerin hücre tekrar tekrar </li><li> Su 100 ul yeniden süspanse hücre pelletini. Plaka hücreler, <ol><li> arginin-ayrılma sentetik tam orta plakaları r mutasyon (SDC-Arg, 60 mikrogram / ​​ml L-canavanine sülfat ile takviye); </li><li> Trp + reversion, triptofan ayrılma plakaları (SDC-Trp); </li><li> Lys + çerçeve kayması mutasyonu, lisin ayrılma plakaları (SDC-Lys); </li><li> GCRs, arginin ayrılma plakaları (SDC-Arg) 5FOA (1 mg / ml) ve L-canavanine sülfat (60 mg / ml) ile desteklenmiş; </li><li> homolog ve homeologous rekombinasyon, histidin ayrılma plakaları galaktoz (% 2) ile desteklenmiştir. </li></ol></li><li> 3-4 gün inkübasyondan sonra CFU Sayısı 30 ° C. Mutasyon frekansı canlı hücrelerin sayısı normalize. </li></ol> Tamamlayıcı in situ canlılığı tayininde, yaşa bağlı Trp + reversion, Lys + çerçeve kayması mutasyon, rekombinasyon, veya r mi plaka üzerinde yaşlı hücreleri de incelenebilir . <ol><li> Trp, Lys, His-ayrılma ya da L-canavanine sentetik tam orta tabak (yukarıda açıklandığı gibi) Plaka hücreleri (~ 10 8 hücre / plaka). </li><li> Her iki gün (ya da ilgi bir zaman noktasında), yeni ortaya çıkan koloniler puan. </li><li> Mutasyon sıklığı, canlı hücreler, belirli bir günde toplam sayısı yeni ortaya çıkan koloniler normalleştirilmesi tahmin edilmektedir. </li></ol> 4. Translesion sentezi (TLS) Yaşa bağlı mutasyon sıklığı artış, makromolekül hasar, azalmış hücresel koruma / onarım içerir ve yaşlanma sırasında hatalı DNA onarım (Polζ bağımlı translesion sentezi, TLS gibi) artmış olabilir. Örneğin, uzun ömürlü sch9 Δ mutantlar SOD2 yükselmiş ifade sergi, ve hata eğilimli DNA onarım enzimi Rev1 20 ekspresyonu azalmıştır. Burada hasarlı DNA&#39;nın in vitro TLS değerlendirmek için şablon ve tüm nükleer özü birleştiren bir tahlil açıklar. <ol><li> Wang ve ark tarafından tanımlanan nükleer özü hazırlayın 21 BCA yöntemi (Pierce) ile protein konsantrasyonu ölçmek. </li><li> TLS Tampon (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7.8), 200 μMdNTPs ve 100 nM içeren 50 ul (son hacim) reaksiyonları için nükleer özler 0, 5, 10 veya 20 mikrogram ekle 5&#39;-32 P-12-mer astar etiketli ilgi DNA hasarı (5&#39;-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC içeren bir 48-mer şablon tavlanmış (5&#39;-CGA TGG TAC GGA-3 &#39;) ACG TTK GTA CCA TCG-3 &#39;, X), abasic sitesi, 8-oxo-G, vb hasarlı site, örn. </li><li> Karışım 30 ° C&#39;de 30 dakika için 2.5 ul EDTA (20 mM) ve proteinaz K (10 mg / ml) 2 ul ilavesi ile reaksiyon feshedebilir. </li><li> Fenol ekstraksiyonu ve etanol yağış DNA arındırın. </li><li> Süspanse edin jel yükleme tamponu 50 ul DNA (% 98 formamid, 20 mM EDTA, boya ve). </li><li> % 19 poliakrilamid jeller translesion sentez ürünleri giderin. </li><li> Phosphorimaging (Şekil 1) kullanarak TLS niceliğini. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Biz, genellikle standart sıvı CLS analizinde yüzde 100 sağkalım olarak 3 gün CFU sayar. Sonraki günlerde yüzde sağkalım ortalama (% 50 hayatta kalma) hesaplamak için donatılmış ve en fazla (% 10 hayatta kalma) ömrü 12 yayılmış olabilir. Ömrü yerinde canlılığı tayininde elde edilen sonuçlar genellikle sıvı CLS tahlil kullanan kişiler ile tutarlı, ancak kısmen hücreleri besinlerin sürekli maruz kaldığı gerçeği nedeniyle ortalama yaşam süresi, azaltılmış. Glikoz varlığı hücresel koruma etkinliği azaltılmış transaktivasyonunun MSN2 / 4 ve Gis1 12 gibi stres yanıtı transkripsiyon faktörü gösterdi engeller. Yaşa bağımlı mutasyon sıklığı büyük ölçüde gerginlik arka plan, genetik manipülasyon, kültür koşulları, ve yaşa bağlı olarak değişir. Tablo 2 yabani tip suşu (DBY746) elde edilen tipik sonuçlar gösterir. <table border="1"><tbody><tr><th> Bileşen </th><th> g / L </th></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Amonyum sülfat </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Azot taban (-AS/-AA) </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td></td><td> mg / L </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Aspartik asit </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Glutamik asit </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Isoleucine </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Leucine </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L-Lizin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Methionine </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Serine </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L-Threonine </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L-Triptofan </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Urasil </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sentetik tam şekeri orta, SDC (NaOH ile pH 6.0 ayarlamak). 4 kat fazla histidin, lösin, triptofan ve urasil DBY746 suşu auxotrophy telafi etmek dahildir. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> 3. Gün (ortalama ± SEM) </th><th> Kadar (yaşlanma sırasında) </th></tr><tr><td> R mi </td><td> 1.76 ± 0.12 x10 -6 </td><td> X10 -6 6-8 </td></tr><tr><td> Trp + reversion </td><td> 6.60 ± 1.70 x10 -8 </td><td> X10 -6 1.60 </td></tr><tr><td> Lys + çerçeve kayması mutasyonu </td><td> 3.00 ± 0.78 x10 -8 </td><td> X10 -6 0.70 </td></tr><tr><td> GCRs </td><td> 0.62 ± 0.10 x10 -8 </td><td> X10 -6 0.30 </td></tr><tr><td> Homolog rekombinasyon </td><td> 5.55 ± 2.74 x10 -6 </td><td> X10 -6 27.00 </td></tr><tr><td> Homeologous rekombinasyon </td><td> 0.12 ± 0.04 x10 -6 </td><td> X10 -6 0.48 </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Kronolojik yaşlanma sırasında vahşi tip hücrelerin tipik mutasyon frekansları (DBY746 ). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg" /> Şekil 1 translesion sentezi (TLS) 20 Sonucu. 3 gün eski sabit yabani tip faz (DBY746) ve sch9 Δ mutant hücreler Nükleer özler, 30 ° C&#39;de 30 dakika için hasarsız ya da abasic site içeren DNA şablonları inkübe edildi. TLS ürünleri katı (hasarsız şablonu ile) veya noktalı (hasarlı şablonu ile) hatları ile belirtilmiştir. Sch9 Δ mutantlar nükleer özü gözlenen hiçbir translesion sentezi vardı. Ücretsiz primerler açık bir ok ile gösterilir.

<ol>
	<li>Longo, V. D., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+medicine:+from+dwarf+model+systems+to+healthy+centenarians.">Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians.</a> Science. 299, 1342-1346 (2003).</li><li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans.">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328, 321-326 (2010).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183, 1751-1752 (1959).</li><li>Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calendar+life+span+versus+budding+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).</li><li>Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+control+and+cellular+life+span.">Replication control and cellular life span.</a> Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).</li><li>Pohley, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formal+mortality+analysis+for+populations+of+unicellular+organisms+(Saccharomyces+cerevisiae.">A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).</li><li>Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+activity+is+essential+for+stationary+phase+survival+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Mitochondrial+production+of+toxic+oxygen+species+in+vivo.">Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.</a> J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).</li><li>Longo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]. , (1997).</li><li>Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+and+stress+resistance+by+Sch9+in+yeast.">Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast.</a> Science. 292, 288-290 (2001).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2, 73-81 (2003).</li><li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer.">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li><li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+extension+by+calorie+restriction+depends+on+Rim15+and+transcription+factors+downstream+of+Ras/PKA,+Tor,+and+Sch9.">Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9.</a> PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).</li><li>Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).</li><li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tor1/Sch9-regulated+carbon+source+substitution+is+as+effective+as+calorie+restriction+in+life+span+extension.">Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension.</a> PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).</li><li>Capizzi, R. L., Jameson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+table+for+the+estimation+of+the+spontaneous+mutation+rate+of+cells+in+culture.">A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture.</a> Mutat Res. 17, 147-148 (1973).</li><li>Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+end+joining+as+an+important+mutagenic+process+in+cell+cycle-arrested+cells.">Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells.</a> Embo J. 22, 2274-2283 (2003).</li><li>Heidenreich, E., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-dependent+and+selection-induced+mutations+in+respiration-competent+and+respiration-deficient+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).</li><li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants.">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li><li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae.">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast.">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2/Msn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li><li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures.">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner/Bloom+model+system.">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sıvı yaşlanma kültürler regrowth / CLS analiz karmaşıklaştırır nefes nefese fenotip 13, bazen sergiler. Nüfusun% 90-99 daha fazla canlılığını kaybetti büyütme genellikle oluşur. Bu fenotip genellikle artmış oksidatif stres ve / veya hücre içinde azalma koruma ile ilişkilidir. Örneğin, bu fenotip frekans uzun ömürlü mutantlar sitozolik süperoksit dismutaz eksik hücrelerinde iki katına daha fazla ve büyük ölçüde azaltır (örneğin, sch9 Δ veya ras2 Δ) veya mutantlar eksprese süperoksit dismutaz 22. Uygulamada, biz regrowth Kronolojik yaşlanma sırasında yüksek mortalite faz 3 ardışık örnekleme için canlılığı canlılığı veya istikrar bir artış olarak tanımlar. Yaşa bağımlı frekansları farklı DNA mutasyonlarının zorlanma arka plan, genetik manipülasyon, kültür koşulları, yanı sıra regrowth / nefes nefese ve son derece düşük sağkalım önemli ölçüde bağlı olarak değişir. Ön deneyler performingthe tam ölçekli ömrü analizden önce mutasyon frekans aralığını belirlemek için mutasyon deneyleri için çeşitli kaplama yoğunluğu ile maksimum ve ortalama sağkalım süresi noktalarında yapılmalıdır. Vahşi tip suşu, her zaman, herhangi bir tedavi ya da genetik mutant ile paralel bir ömrü veya mutasyon sıklığı çalışma dahil edilmelidir deneme arası varyasyonlar için açıklanamayacağı gibi. Çoklu biyolojik kopyaları çalışmaya dahil olmalıdır;, hem sıvı ve yerinde canlılığını / mutasyon deneyleri sonuçları doğrulamak için yapılmalıdır. Yaşa bağlı genomik instabilite birlikte birden fazla testleri kullanarak profil belirli bir DNA mutasyon tipi, odaklanmak yerine, belirli bir DNA hasarı ve DNA hasarı tamir yaşa bağlı genomik istikrarsızlığa katkıda sistem (ler) ışık tutabilir. Örneğin, diğer DNA mutasyonlarının göre brüt kromozom düzenlenmeleri (GCRs) önemli bir artış, vahşi tip maya maya sırasında homolog olmayan sonunda bir elevationof çift iplikli kırmak ve / veya bir değer düşüklüğü katılmadan (NHEJ) düşündüren görülmektedir Kronolojik yaşlanma (Tablo 2). Yabani tip yaşlanma maya elde can1 mutasyon spektrumu (CAN1 gen sıralama) oksidatif hasarı, kronolojik yaşlanma ve hata eğilimli DNA onarım sırasında bir artış önerisi ise, uzun ömürlü sch9 Δ mutantlar, daha az oksidatif DNA hasarı ve çok azaltılmış hata eğilimli translesion sentezi 20 gözlenmiştir. Burada açıklanan yöntemlerden yaşa bağlı genomik istikrarsızlık daha fazla çalışması için harcanan olabilir. Örneğin, sükunet ve non-latent hücrelerin Allen ve ark tarafından tanımlanan yoğunluk gradiyenti yöntemi kullanarak maya sabit faz kültürlerinden izole edilebilir. 23. Burada açıklanan mutasyon deneyleri ile birlikte, yaşa bağlı mutasyonların büyük bir kısmı, bölme hasar görmüş ya da apoptotik hücreleri 20,24 daha ziyade latent hücreleri, ortaya çıktığı bildirdin .

studying age-dependent genomic instability using the s. cerevisiae chronological lifespan model

Saccharomyces cerevisiae yaşlanma modeli kullanılarak yapılan çalışmalar, yüksek ökaryotlar 1-2 kısmen korunmuş ömrü düzenleyici yollarda ortaya çıkarmıştır . Maya yaşlanma modeli sadeliği ve gücü de, DNA hasarı ve genom bakım yanı sıra, yaşlanma sırasında hastalıkları katkıları çalışma araştırılmalıdır. Burada, maya kronolojik ömrü basit bir DNA ile birleştirerek temel yerine, çerçeve kayması mutasyonları, brüt kromozom düzenlenmeleri ve homeologous / homolog rekombinasyon yanı sıra nükleer DNA onarım faaliyetleri de dahil olmak üzere, yaşa bağlı DNA mutasyonlarının, çalışma sistemi tanımlamak hasar ve mutasyon deneyleri. Burada açıklanan yöntemler genomik istikrarsızlık ve memelilerde yaşa bağımlı DNA mutasyonları ve kanser altında yatan mekanizmaları düzenleyen genleri / yollarının belirlenmesini kolaylaştırmak gerekir.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model at JoVE.com

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

15.5K Görüntüleme.  University of Southern California, Los Angeles. Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Video: Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biyoloji

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

MR Genomik - Sıra Desenler Genomik DNA içinde incelenmesi için Kamu Kaynak

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding the pathological processes and evaluating new drugs. Here, we introduced a surgically induced lumbar spine instability (LSI) mouse model that develops IDD starting from 1 week post operation. In detail, the mouse under anesthesia was operated by low back skin incision, L3&#8211;L5 spinous processes exposure, detachment of paraspinous muscles, resection of processes and ligaments, and skin closure. L4&#8211;L5 IVDs were chosen for the observation. The LSI model develops lumbar IDD by porosity and hypertrophy in endplates at an early stage, decrease in intervertebral disc volume, shrinkage in nucleus pulposus at an intermediate stage, and bone loss in lumbar vertebrae (L5) at a later stage. The LSI mouse model has the advantages of strong operability, no requirement of special equipment, reproducibility, inexpensive, and relatively short period of IDD development. However, LSI operation is still a trauma that causes inflammation within the first week post operation. Thus, this animal model is suitable for study of lumbar IDD.

We developed a lumbar intervertebral disc degeneration mouse model by resection of L3&#8211;L5 spinous processes along with supra- and inter-spinous ligaments and detachment of paraspinous muscles.

Bel Omurgası Kararsızlığının Fare Modeli

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...