The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

NOT: Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Paw Pedleri dövme yapılması kullanma Fareler 1. Uzun süreli Kimlik <ol><li> Deneyci bakan pençe ped (plantar yüzeyi) ile bir pençe hareketsiz. Başparmak ve işaret parmağı ile pençe tutun. Pençe sıkmamaya özen gösterin. NOT: Kararlı immobilizasyon dövme pigmenti pençe pad dermis içine yerleştirilir sağlamak için önemlidir, ve bu nedenle 7 kalıcıdır. </li><li> Bir gazlı bez sünger veya bez üzerinde% 70 etanol ile pençe pedi çubukla. </li><li> Bir pamuk uçlu aplikatör cilt yağı uygulayın ve nazikçe pençe ped birkaç kez yüzeyine karşı ucunu basın. Cilt yağ çok az miktarda kullanmak; mevcut olduğunda büyük miktarlarda, cilde ulaşmasını dövme pigmenti önleyecektir. </li><li> Hemen önce dövme mürekkebi içine dövme iğneleri ipuçları Dipdövme için. Ağrı ve enfeksiyon olasılığını azaltmak için, ve aynı zamanda dövme verimliliğini artırmak için, temiz, aseptik ve keskin dövme iğne kullanın. </li><li> Pençe ped yüzeyi cilt yağı ile kaplı iken, pençe pad merkezinde cilde karşı dikey ve hafifçe dövme iğne ipuçları basın ve mürekkep birden çok kez enjekte edilir. Elektrik dövme sistemi hakkında bilgi almak için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. </li><li> Yavaşça, bir gazlı bez sünger üzerinde% 70 etanol Sprey cilt yüzeyinde ekstra dövme pigmenti kaldırmak için pençe karşı basın ve dövme kalitesini kontrol edin. Pençe pad orta normal deri pigmentasyonu farklı bir karanlık, yuvarlak nokta olduğunu kontrol edin. Dövme koyu veya kolay görüntüleme için yeterince büyük değilse, önce dövme adımları tekrarlayın. </li></ol> Fast PCR Genotipleme Kit kullanarak 2. Genotipleme Yenidoğan Fareler <ol><li> % 70 etanol ile bir fare kuyruk distal ucunu dezenfekte kuyruk 5 mm ya da daha az kesimipucu ve PCR için kullanılan tipte 8 boru şeridin bir tüpe aktarın. Örneklerin arasında çapraz bulaşmayı önlemek için her yavru için bir un-kullanılan jilet kullanın. Seçenek olarak ise, bir makas kullanımı, ancak bu durumda, dikkatli bir şekilde ve iyice% 70 etanol kullanılarak bıçaklar üzerinde kalan doku çıkarın. Kanama kontrol edin. Kanama oluşursa kanama durana kadar, bir gazlı bez sünger ile kuyruk kesme kısmına basınç uygulayın. </li><li> Bir örnek ihtiva eden her bir PCR tüpü DNA ekstraksiyon çözeltisinden 200 ul ekle. Kit hakkında kompozisyonu ve bilgi Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. </li><li> PCR termal döngü içine boru şeridi yerleştirin ve aşağıdaki programı kullanılarak DNA çıkarma işlemini başlatmak: 1 döngü, 55 ° C&#39;de 10 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 1 döngü için, ve 4 ° C&#39;de tutma. Not: Bu, daha sonra, PCR için kullanılan aynı PCR termal döngü cihazı olup. </li><li> DNA ekstraksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, termal döngü a gelen tüp şeridi çıkarınnd 5 kez ters çevirin. </li><li> Bir un-kullanılan bir 8-tüp şerit tüp, ve ile karıştırmak için her numunenin Transfer çözüm (DNA özü) 4 ul: 2X PCR Hazır II 10 ul, ileri ve geri primerler karışık 2 ul (tavsiye edilen 0.5 uM, her numune için nükleazsız H 2 O dizileri için Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız), ve 4 ul. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak Spin kısaca (örneğin, 3 sn). Işlerken dışında her zaman buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Termal bisiklet gerçekleştirin. Görmek Termal program Malzemeleri / Ekipman Tablosu. </li><li> Çoğaltılan DNA ürünleri algılar. Doğrudan bir agaroz jel, bir kuyu içine PCR&#39;dir (20 ul), toplam reaksiyon çözeltisinin yerleştirin. Ayrı bir kuyuya moleküler ağırlık belirteçleri yükleyin. Bir elektrik alanı uygulanır. </li><li> Ultraviyole ışık altında floresan bantları görüntülerini elde edin. </li></ol> Fare Beyin Neuron 3. İlköğretim KültürüGlial Besleyici Layer s NOT: Beyin diseksiyon ve hücre ayrışma (3.1) için prosedürler izleyen tüm prosedürler için ortaktır. Fare glial kültürlerinden prosedürleri (3.2), sıçan glial kültürleri (3.3) ve fare nöronal kültürlerinde (3.4) daha sonra ayrı ayrı açıklanmaktadır. <ol><li> Beyin Diseksiyon ve Hücresel Dissocaiation <ol><li> Hızla beyin kaldırmak ve Hanks solüsyonu içine yerleştirmek, başı kesilerek bir fare veya sıçan yavrusuna Kurban (bileşim için tablo 1 e bakınız) +% 20 (buz üzerinde tutulur), bir 35 mm çanak fetal sığır serumu (FBS). </li><li> İki hemisfer içine orta hat boyunca beyin kesin. Beynin her yarımkürede ilgi bölgeyi (örneğin, serebral korteks, striatum ve hipokampus) sökün. Yüzeyden meninksler ve büyük kan damarları çıkarın. Cerrahi bıçak kullanarak 4-10 ince dilimler halinde beyin bölgesini kesin. </li><li> Zekâ, bir kez 15 ml&#39;lik santrifüj tüp içinde beyin dilimleri durulayınh Hanks çözeltisi +% 20 FBS, Hanks ile sonra da 3 defa &#39;(serumsuz örneğin) bir (4 ° C). , Durulama 5-10 ml solüsyon ekleyin, dilim tüpün dibinde yerleşmek beyin, üst çözüm aspirat, izin ve taze bir çözüm eklemek için. Çözüm aspire durulama işlemi bitirin. </li><li> 3 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak tripsin içeren sindirim çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin dilim içeren tüp içine doğrudan filtrat ekleyin. Trypsinization oda sıcaklığında 13 dakika devam edelim. </li><li> En iyi şekilde aspire ve 7-10 mi Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C) ilave etmek suretiyle tripsin solüsyonu nötralize. </li><li> Hanks ile iki kez, beyin dilimleri yıkayın &#39;çözeltisi +% 20 FBS ve Hanks daha sonra üç kez&#39; solüsyonu (yani serumsuz) (4 ° C). Solut aspire durulama işlemi bitirmekiyonu temsil etmektedir. </li><li> 3 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak ayrışma çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin kesitleri ile doğrudan boruya filtrat ekleyin. </li><li> Mekanik görünür doku parçaları kaybolana kadar hafifçe, 10-20 kez öğütülerek hücreleri ayırmak. Bir pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanın ve triturasyonun sırasında kabarcıkları yapmaktan kaçınmak. </li><li> Küçük parçalar yerleşmek için 3 dakika bekleyin. </li><li> Çözeltisi çoğunluğu aktarın (~ 1.5 mi, altındaki bir bir solüsyon) kullanılarak, 3 mi Hanks solüsyonu +% 20 FBS çözeltisi (4 ° C) ihtiva eden bir 15 mL santrifüj tüpüne pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti. Altındaki herhangi bir tortu dahil tipik kültür bozulması ile sonuçlanır, çünkü tüm çözüm transferi yapmayın. </li><li> 4 ° C&#39;de ~ 185 g (~ 1100 rpm) 13 dakika santrifüj uygulayın. </li><li> Yavaşça süpernatant aspire,eklemek 1 ml önceden ısıtılmış pelet orta (37 ° C) kaplama ve hafifçe pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanarak birkaç kez pipetleme bunu tekrar süspansiyon. NOT: Ortamı kaplama Üç farklı farklı kültür amaçlı kullanılır: fare nöronları orta-2 kaplama, fare glial hücreler orta-1 kaplama, ve sıçan nöronlar ve glial hücreler orta-3 kaplama (kompozisyonlar için Tablo 1&#39;e bakınız) . </li><li> Hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanılarak, hücre süspansiyonu 10 ul çıkarın% 0.4 tripan mavisi çözeltisi 10 ul ile karıştırarak, ve canlı hücrelerin yoğunluğunu ölçmek. </li></ol></li><li> Fare Glial Kültürleri <ol><li> Fare hücreleri sağlıklı kültürleri kurulmasına yardım etmek lamelleri yıkayın. <ol><li> Cam bir Petri kabı içinde% 70 nitrik asit içinde cam lamelleri (yuvarlak, 12 mm çapında) daldırın. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun ve bir yörünge çalkalayıcı O / N üzerine yerleştirin. </li><li> Cam coversli durulayındamıtılmış su ile Petri kabındaki PS en az üç kez. Distile su onları bırakın. Bir yörünge çalkalayıcı O / N çanak yerleştirin. </li><li> Biyolojik güvenlik kabininde bir Whatman 150 mm filtre kağıdı üzerinde lamelleri kurulayın. </li><li> Lamelleri otoklavlayın. </li><li> 24-çukurlu kültür kabına lamelleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Adım 1 ve 2&#39;ye göre etiket ve genotip doğan farenin. </li><li> Adım 3.1 göre fare yavrular beyin hücreleri elde. Not: serebral kortekste fare glial besleyici tabakanın hazırlanması için tipiktir. Bununla birlikte, bu hipokampus ve striatum gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi için hücre yoğunluğu, uygun ayarlamadan sonra çalışır. </li><li> Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 1: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi). Ön ısınma kültür ortamı için, kültür inkübatör çözümü (% 5 CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, yerleştirmeksıcaklık ve pH değerleri, stabilize olmasına izin verin. </li><li> Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, bir kaplanmamış T25 kültür şişesine hücre süspansiyonu aktarın. Kültür inkübatör içine yerleştirilir. </li><li> Nitro (DIV), 1 gün içinde iki defa kaplama ile T25 şişesi içinde kültürlenmiş hücrelerin durulama orta 1 (4 ° C). Geri kuvöz içine balon yerleştirin. Bir girdap hareket birkaç kez taze ortamın ~ 5 ml ekleyerek, tamamen Pasteur pipeti şişeye içinde orta aspire ve yavaşça şişeyi eğerek durulama yapınız. </li><li> 6-9 DIV anda, (yani, bir trypsinization gün önce ve 3.2.8-3.2.13 adımda, lamelleri kaplama), (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplama malzemesinin 100 ul yer hakkında yorumlar için Malzemeleri / Ekipman bkz: İçindekiler Kaplama bir kültür kabı içinde cam lameller üzerine bir malzeme) ve kültürü inkübatöründe kültür kaplarına yerleştirin. </li><li> 7-10 DIV, at hücreleri 20-4 olduğunda0% konfluent (mekansal sürekli), onları trypsinize. <ol><li> Bir şişe içinde tüm solüsyonu aspirasyon ve ~ Hanks solüsyonu (4 ° C) 13 ml ilave etmek suretiyle, bir kez balon yıkayın, yumuşak bir dönme hareketi bir şişe içinde bir kaç kez tilt ve tamamen çözelti aspire. </li><li> 4 mi tripsin-EDTA çözeltisi DNaz çözeltisi (nihai konsantrasyon, 750 birim / ml) 40 ul ekle 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir çözeltisinin, ve şişe hücreler doğrudan filtrat ekleyin. </li><li> Tripsinizasyon kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 13 dakika sürmesine izin verin. </li><li> Şişeye 100% FBS (4 ° C) 2 ml ekleyerek tripsin solüsyonu nötralize. </li><li> Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C), santrifüj ~ 4 ml, bir 5- ila 10-mi bir pipet kullanarak 15 ml santrifüj tüpüne tripsinize hücreleri transfer ~ 185 g ve 13 dakika süre ile 4 ° C ve süpernatant aspire. </li></ol></li><li> Ön Warme 1 ml pelletinid kaplama orta-1. </li><li> Aşama 3.1.13 göre hücre yoğunluğu ölçülür. </li><li> Lamelleri ~ yeniden süspanse glial hücreler 50 ul kaplama cam lamelleri tamamen malzeme, ve plaka aspire. NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak. </li><li> Inkübatör lamelleri kültür çanak yerleştirin. </li><li> 20-60 dakika sonra, önceden ısıtılmış her kuyuya orta-1 kaplama 1 ml ekleyin ve inkübatör geri çanak yerleştirin. Not: kaplama ortam ilave edilirken, lamel ortamda yüzer olmayacak şekilde, (hayır kaplama hücreler vardır) lamel çevresini aşağı basın başka bir pipet kullanmak yararlı olacaktır. </li><li> (Cam lamel üzerinde, yani,), glial besleyici tabakanın 1 DIV içinde 1 ml orta yerine önceden ısıtılmış kaplama orta 1, bir kuyu içinde çözelti her aspirasyon ve daha sonra taze aracı ile doldurarak. </li><li> Glial besleyici tabakasının 2-3 DIV at zaman celher bir oyuğa, bundan dolayı DNA replikasyonu ve inhibe etmek için, Ls mitotik durdurucu (81,2 ve 204,8 uM nihai konsantrasyonlar, sırasıyla 5-floro-2&#39;-deoksiüridin + üridin karışımı 10 ul) ekleyin,% 80-100 konfluent Glial hücre çoğalmasını bastırmak. </li><li> Hücreler% 90-100 sıklıkta (glial besleyici tabaka nöronlar kaplama önce 1-2 saat) zaman 7-9 DIV de, kültür ortamı yerine önceden ısıtılmış kaplama, orta-2 (37 ° C). Not: Nöronlar adım 3.4 kullanarak, aynı gün kaplama olacaktır. </li></ol></li><li> Sıçan Glial Kültürleri <ol><li> Kaplama aynı kaplama malzemesi ile T25 kültür şişesi. NOT: Bu adımda 3.3.5 içinde yapışkan olmayan hücreler daha sonra çıkarılması için gereklidir. <ol><li> Şişeye kaplama malzemesinin 2.0 ml ilave edilir, ve kültürü inkübatöründe balon yerleştirin. </li><li> 2-3 saat sonra, şişenin taban kurur, böylece, tam olarak kaplama malzemesini aspire. </li></ol></li><li> Hücreler elde edilirsıçan yavrularından, 3.1 adım göre yöntem. NOT: hipokampus CA3-CA1 bölgesi sıçan glial besleyici tabaka hazırlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu tür beyin bölgelerinden gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi hücre yoğunluğunda farklılıklar için ayarlama yapıldıktan sonra çalışacaktır. </li><li> Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 3: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi). </li><li> Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, kaplamalı T25 kültür balona hücre süspansiyonu aktarın. Kültürü inkübatöründe (% 5 CO2 -95% O 2, 37 ° C) tutulur. </li><li> 2-3 DIV hücreler% 20-40 konfluent olduğunda, kapağı sıkıca kapama balonu çalkalamak, yapışkan olmayan ya da zayıf biçimde yapışmayan hücreler giderilmiş kuvvetli bir şekilde ~ 10 kat çözeltisi, aspirasyon ile kaplama 4-5 mi ekleme Orta-3 (4 ° C&#39;de). Bir kez bu işlemi tekrarlayın. (Örn tüm şişe zemin üzerinde kültür hücreleri incelemek,tamamen kaldırılır) hücre vücudun dış kenar faz parlak görünen o ki için, yani nöronal (görünür olanlar onaylamak için faz-kontrast mikroskobu) kullanılarak. Bu hücreleri kaldırmak ve daha sonra inkübatör şişeyi geri dönmek için gerektiği kadar işlemi tekrarlayın. NOT: gücü ve bireysel deneyci arasında farklılık olabilir gerekli &#39;sallar&#39; toplam sayısı. Önemli olan bir dizi sayıya sallar toplam sayısını tutmak, ancak nöron benzeri hücreler ortadan kalkar onaylamak değildir. </li><li> 6-8 DIV hücreler% 90-100 sıklıkta olduğu, geçiş adımı 3.2.8 olduğu gibi bunları trypsinizing glial hücreler olduğunda. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, bir kaplanmamış T75 şişeye tripsinize hücreleri transferi, orta-3 (4 ° C), kaplama 10 mi ekleyin ve kültür onları orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelletini inkübatör. NOT: Sıçan glial hücreler iki kez geçişli olacak; Buna fare glial hücreler arbirden çok pasajlar sonra sağlıksız hale çünkü e sadece bir kez pasajlanır. Sıçan, glial hücreler, herhangi bir kaplama malzemesi ile kaplanmıştır değildir T75 şişeleri içinde pasajlanmağa devam edilecektir. Kaplama sıçan glial hücreler çok hızlı büyür ve daha sonra nöronal kültür durumunu bozulacaktır birçok kirpikli hücreler (varsayılan ependimal hücreler), verim sağlar. </li><li> Bir şişe içinde, glial kültür 17-19 DIV de (örneğin, 11 gün pasaj ve tripsinleme bir gün önce ve 3.3.9-3.3.14 adımlarla lamelleri üzerine kaplama sonrası), (yıkanmamış cam lameller üzerine kaplama malzemesinin 100 ul koyun yuvarlak, 12 mm çapında) bir kültür çanak ve kültür inkübatör kültür çanak yerleştirin. NOT: sıçan glial kültürler için, bir fark ile veya lamelleri yıkama olmadan kültür sonuçlarında fark edildi. </li><li> Bir şişede glial kültür 18-20 DIV anda (yani, Pasajlanması sonra 12 gün), st göre, kültür hücreleri trypsinizing glial besleyici tabaka hazırlamakep 3.2.8. </li><li> Santrifüj sırasında, cam lamelleri tamamen kaplama malzemesi aspire. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, adım 3.1.13 göre, orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelet tekrar süspansiyon ve hücre yoğunluğunun ölçülmesi. </li><li> 10 4 canlı hücre / ml glial yoğunluğunu ayarlayın ve kaplamalı cam lamelleri glial hücre süspansiyonu 100 ul plaka. NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak. </li><li> 20-60 dakika süreyle kuvöz içine lamelleri ile kültür çanak yerleştirin. </li><li> Her bir orta-3 (4 ° C) kaplama için 1 ml ilave edilir, ve inkübatör çanak yerleştirin. </li><li> Lamel hücreleri% 40-80 konfluent olduğunda, glial besleyici tabaka 3-4 DIV, içinde önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı, 1 ml ilave (sitosin β-D-arabinofuranosid içeren (bileşim için tablo 1 e bakınız) Araç, 4 uM nihai konsantrasyon), glial hücre çoğalmasını durdurmak için. Plaka nöronGlial besleyici tabakasının 7-9 DIV s at hücreleri adım 3.4 kullanarak,% 60-80 konfluent olduğunda. </li></ol></li><li> Fare nöronal kültürlerinde <ol><li> Adım 1 ve 2&#39;ye göre etiket ve genotip doğan farenin. </li><li> Adım 3.1 için fare yavrular kullanın. </li><li> Canlı hücre süspansiyonu yoğunluğunu ayarlamak için ~ kullanılarak, 2.0 x 10 5 hücre / ml önceden ısıtılmış orta 2 fare, glial hücreler üzerinde kaplama ya da kullanımı için kaplama kaplama orta 3 sıçan glial hücreler üzerine kaplama için. </li><li> Yavaşça her kültür ortamı hücre süspansiyonuna eklenmeden tarafından iyi glial besleyici tabaka, hücreler plaka. Not: eklenecek hücre süspansiyonu hacmi de bir kültürde hücrelerin hedef numarası ile belirlenecektir. Örneğin, plakasının hücre süspansiyonu 60 ul / kuyucuk 12,000 hücre elde etmek için. </li><li> Nöronlar kaplama sonra hiçbir çözüm değişiklikler gerekli olduğunu unutmayın. Kültür boyunca, iç o nemlendirerek kuyulardan çözümün buharlaşmasını önlemek için dikkatli olunkültürü inkübatöründe f. </li></ol></li></ol>

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Burada sunulan protokol kuyruk ipuçları fareler genotiplemeye, / etiket fareler tanımlamak için dövme prosedürlerini içerir ve düşük yoğunlukta kültür fare beyin nöronları için. 6-8 yavrular kullanıldığı deneylerde bir turunda, bu işlemler genellikle 6-7 saat toplam sırasıyla ~ 0.5 saat, ~ 4 saat ve ~ 2 saat, gerektirir. (Glial besleyici katmanlar önceden hazırlık hariç) tek bir çalışma günden kısa bir sürede - Bu nöronal kültürlerin kaplama için pups &#39;doğum sırasında gerekli ...

Genetik hastalıkların kemirgen modelleri, normal protein ve nükleik asit, aynı zamanda, bu kusurların patofizyolojik fizyolojik işlevleri açısından yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Örnekler önemli hücresel fonksiyonlara yer alan proteinleri eksikliği olan fareler, aynı zamanda, Alzheimer hastalığı gibi hastalıkların fare modelleri yer alır. Ancak, bazı genetik manipülasyonlar kısa bir süre yenidoğan öldürücülüğü veya doğumdan sonra birkaç gün yol açabilir. Bu gibi durumlarda, birincil hücre kültürleri, canlı hücrelerin ölümünden önce embriyonik veya neonatal yavrular elde edilebilir, çünkü önemli bir araç olup, bu in vitro en az birkaç hafta muhafaza edilebilir, ve bu süre içinde, erken nöronal gelişimi ile takip edilebilir , biyokimyasal, fonksiyonel ve morfolojik deneyler. Birincil kültürler için, bu düşük yoğunluklu nöronlar plaka için yararlı olabilir; Bu bireysel somata, dendrit, akson milleri ve sinir TERMI görselleştirmek mümkün kılaryüksek uzaysal çözünürlükte rken,. Bununla birlikte, düşük yoğunlukta nöron sağkalım ve farklılaşma, tipik olarak bir glial besleyici tabaka kaplama gerektirir, ko-kültür glia 1 şartlandırılmış fiziksel bunlarla temas üzerine ya da ortam içinde kültürlenen yokluğunda glial hücreler. Glial besleyici katmanlar üzerinde düşük-yoğunluklu nöronal kültürlerin kurulması önceden hızlı ve güvenilir genotipleme bağlı olabilir - bir kaç gün aksine bir kaç saat içinde. Nöronal genotip daha önceden hazırlanmış bir glial besleyici tabakanın edilene uyumlu olması gerekir, hız özellikle önemlidir. Daha pratik bir örnek olarak, genotip arasında yavrular bir deney etkinliğini optimize etmek için, oluşturma kültürlerinde kullanmadan karar vermek için gerekli olabilir. Burada önceki yayınlarda 2-6 hızlı, basitleştirilmiş ve güvenilir bir fare genotip için kullanılır olmuştur çalışma protokolü göstermektedir. Fare kuyrukları veBir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. Bu protokol, doku nükleik asitlerin tek aşamalı ekstraksiyon ve (&#39;durdurma çözeltisi&#39;), bir nükleik asit saflaştırma adımı veya bir sonlandırma tamponu kullanılmasını gerektirmez. Bu genotipleme yönteminin güvenilirliği farkları örneklerin başlangıç ​​miktarı, hayvanların yaş ve PCR amplikonlarının uzunluğuna göre sokulduğunda bir dizi test sonuçlarını gösteren açıklanmaktadır. Bu kit otomatik çıkarma ve güvenilirlik avantajlar sunuyor. Kapsamlı olma uğruna, genotip farelerin uzun vadeli belirlenmesi için dövme kullanımı da gösterilmiştir. Dövme (epidermisin altında) derinin dermiş için dövme mürekkep uygulanarak elde edilir 7. Bir prosedür dövmeler gibi kuyrukları ve ayak gibi vücudun diğer bölgelerine uygulanabilir olmasına rağmen, yeni doğan ya da 1 gün eski farelerin pençe yastıkları dövme için tarif edilir ve Anim içinHer yaştan als. Buna ek olarak, yöntemler, glial besleyici tabakalarının 2,8 farklı optimize hazırlanması göre, bir düşük yoğunlukta fare nöronlar kaplama ve kültür olması gerekmektedir. (; P.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 gen TOR1A bir mutasyon nedeniyle otozomal dominant hareket bozukluğu - Biz miras nörolojik bozukluk DYT1 distoni bir genetik fare modeli kullanın. Protein açılımı, protein kompleksi demontaj, membran kaçakçılığı ve vezikül füzyon: kodlanan protein, Torsina, üyeleri genellikle, hastabakıcı gibi işlevleri yerine yardımcı (AAA +) proteinlerin ailesi, &quot;çeşitli hücresel faaliyetler ile ilgili ATPazların&quot; aittir 10-13. Mutasyon glutamik asit için bir kodonun bir çerçeve içi silme ile sonuçlanır, ve erken başlangıçlı genel izole distoni &#39;14,15 ortaya konulmasına neden olur. Bununla birlikte, yolBu bozukluk sorumlu ophysiological mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Bir knock-fare modelinde, mutant alel Tor1a AE olarak, burada bahsedilen Tor1a tm2Wtd vardır. Heterozigot AE-Torsina knock-farelerin DYT1 distoni ile canlı ve genetik taklit insan hastalar, oysa homozigot knock-fareler genetik kökenli 18 etkilenen doğum sonrası ölüm gecikme ile, doğumdan 16,17 sonra ölürler. homozigot knock-farelerin erken ölüm hayvanların genotipleme ve nöronal kültürlerin kurulması hem hızla tamamlanmasını gerektirmektedir. Genotipleme başka örnek olarak, Tfap2a (transkripsiyon faktörü, AP-2α, arttırıcı protein 2α bağlanma geçirmek için) kullanılır. Bu gen tarafından kodlanan bir protein, proliferasyon, diferansiyasyon, hayatta kalma ve apoptoz 19 gibi çok sayıda hücresel işlemleri düzenleyen önemlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS - tattooing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Cleanser</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NMCR3</td>
			<td>This is used to clean the needles and the holder after tattooing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Drying Agent</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NDAR4</td>
			<td>This is used to dry the needles and holder after cleaning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Tattoo Black Pigment</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NBP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep Applicator</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSPA1</td>
			<td>Q-tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep solution</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSP01</td>
			<td>This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage &#8211; the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing &#8211; softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - genotyping</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Ready Mix II</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution A</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution B</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH 3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose optimized grade, molecular biology grade</td>
			<td>rpi</td>
			<td>A20090-500&#160;</td>
			<td>We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 &#181;g/ml gel volume).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG104-96RS&#160;</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2020-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2812-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1001</td>
			<td>We use either of these three molecular weight markers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, Ultraflux Individual&#160;</td>
			<td>rpi</td>
			<td>145660</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>rpi</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tor1a gene in &#916;E-torsinA knock-in mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3&#39; (forward) and 5&#39;-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3&#39; (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/&#181;l (~0.16 &#181;M) (reference 2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3&#39; (forward), 5&#39;-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3&#39; (reverse) for the 498-bp amplicon, 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3&#39; (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3&#39; (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>See comments section of uridine for more information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, polypropylene, 15 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess (cell number counter) chamber slides</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6645-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish, Petri glass 100 x 15 mm</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>15230-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527-200KU</td>
			<td>Stock solution is prepared at 1500 units/20 &#956;l = 75000 units/ml in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10569-010, 500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09&#8211;0.12 mm, No. 0</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>633017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387-10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-100 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4&#8226;(7H2O), BioUltra, &#8805;99.5% (Fluka)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20&#176;C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4&#176;C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MITO+ Serum Extender, 5 ml</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>bdh 3044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS (Neuronal Supplement) 21&#160;</td>
			<td>prepared in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Source: reference 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 5 &#190;&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>Use this cotton-plugged 5 &#190;&#8221; Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 9&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 2 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 25 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 50 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480878-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4&#8226;(7H2O)), &#8805;99.99%, Aldrich</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431478-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, SigmaUltra, &#8805;99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, sterile, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin, Holo, bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain, 0.4%</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, type XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1005-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution, 0.25%&#160;</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - immunocytochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons

Memeli nöronların yapısının ve fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü analizi genellikle nöronlarının birincil kültürleri analizi ve ardından tek tek hayvanların genotipleme gerektirir. Genotyped için yenidoğan fareler, hızlı genotiplendirmesi etiketleme, ve bu farelerin beyin nöronları düşük yoğunluklu kültürleri kurulması: Biz prosedürlerin bir dizi tarif. Bireysel fareler yetişkinlikte süren uzun süreli kimlik sağlar dövme, tarafından etiketlenir. Açıklanan protokol tarafından Genotipleme hızlı ve verimli ve iyi güvenilirlik ile nükleik asitin otomatik çıkarılması için izin verir. Bu yenidoğan letalitesinin muzdarip farelerde, örneğin geleneksel genotiplemede için yeterli zaman mevcut değildir şartlar altında yararlıdır. Primer nöronal kültürlerin yüksek uzaysal çözünürlükte görüntüleme deneyleri sağlayan düşük yoğunlukta, oluşturulur. Bu kültür yöntemi öncesinde nöronal kaplama için glial besleyici katmanlar hazırlanmasını gerektirir. protocol hareket bozukluğu DYT1 distoni (AE-Torsina knock-in fareleri) bir fare modelinde bütünüyle uygulanır ve nöronal kültürler, bu farelerin hipokampus, serebral korteks ve striatum hazırlanır. Bu protokol, diğer türlere ait hayvanlar için, hem de diğer genetik mutasyonlar olan farelere de uygulanabilir. Ayrıca, protokol bireysel bileşenleri izole alt projeler için kullanılabilir. Böylece bu protokol nörobilim hem de biyolojik ve tıbbi bilimlerin diğer alanlarında değil, sadece geniş bir uygulama, sahip olacaktır.

Bu protokolün uygulanmasında bir örnek olarak, temsili sonuçlar çeşitli deneysel koşullar altında dövme, güvenilir genotiplemede tarafından fareler etiketleme, ve glial besleyici katmanlar birincil nöronal kültürlerin kurulması için gösterilmiştir. Dövme Yenidoğan yavrular (Şekil 1 &#39;Yenidoğan&#39;) bir dövme sistemi kullanılarak pençe yastıkları etiketli bulundu. etiketler 3 haftada açıkça görü...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons at JoVE.com

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

rapid-genotyping-animals-followed-establishing-primary-cultures-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Görüntüleme.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır. 

Video: Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Nörobilim

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Küçük Hayvanlar Kronik Sinir Kayıtlar için Ultra-hafif Motorlu Microdrive Tasarımı ve Montajı

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

SerbestÇe Hareket Eden Hayvanlarda Nöral AktiviteYi Kaydetmek Için Çoklu Fiber Fotometri

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...