This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Hayvanları ile ilgili tüm prosedürler Insancıl Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin Politikasına uygun olarak yapıldı Laboratuvarı Hayvan Refahı Dairesi (NIH) tarafından ve yalnızca Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı ile belirlenen Connecticut Sağlık Merkezi. Karışık Glial Kültürler 1. Hazırlık <ol><li> Kullanmadan önce tüm aletleri sterilize edin. Soğuk muhafaza etmek için buz üzerinde muhafaza üç steril, 60 mm Petri tabaklarına (Mg 2 + ya da Ca +2) herhangi bir katyonları içeren buz soğukluğunda steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 3 ml ilave edilir. </li><li> Daha önce 17,18 açıklandığı gibi, doğum sonrası P0-P2 fare yavrularından korteks izole eder. NOT: Hipokampuslardan gibi subkortikal yapıları, bu kültürlerde dahil değildir. </li><li> Bir pı kullanarak, dikkatlice meninksler kaldırmak ve daha sonra taze HBSS&#39;nin için izole korteks aktarmak ve enzimatik dokuları ayırmaküreticinin protokolüne uygun olarak ural doku diseksiyon kiti. </li><li> Plaka steril, T-175 şişeleri içine hücre ve ortam içinde bir gece boyunca inkübe [Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamı 1 x penisilin / streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu ile (FCS) (FBS)]. </li><li> Taze medya ile ertesi gün tüm medyayı değiştirin. Yaklaşık 3 hafta süreyle veya bir hücresel mono-katman kurulana kadar, normal ortam değişiklikleri ile kültürleri inkübe devam edin. Not: 1 oranında 19: Bu tek-katmanın, yaklaşık 10, astrositler ve mikroglia oluşacaktır. </li></ol> Karışık Glial Kültürlerde 2. Globoid Hücre İndüksiyon <ol><li> ECM-kaplı lamelleri hazırlayın. <ol><li> 30 dakika boyunca Steril bir Petri tabağında steril 1 N hidroklorik asit (HCI) olan dairesel lamelleri ıslatın. Steril su 3x lamelleri yıkayın ve sonra en az 20 dakika boyunca% 95 EtOH içinde bekletin. ve sonra hava kurumaya bırakın. </li><li> Sulandırılmış dışı MATR Yeri damlacıklarıParafilm bir levha üzerine ix (ECM), protein bir kaplama maddesi (ml steril fosfat tampon çözeltisi içinde çözüldü, laminin 10 ug / örneğin, 150-250 ul / damlacık [PBS]). Bu damlacıklar üzerine yerleştirildiğinde lamelleri dokunmaz böylece damlacıkların dağıtın. Yavaşça forseps kullanarak bir damlacık üzerine her kurutulur lamel yerleştirin. </li><li> Yaklaşık damlacıklarının lamelleri bırakın. Kanat ile kültürü kaputu içinde 4-6 saat kapalı. </li><li> 24 oyuklu plakanın oyuklarından her ECM içine kaplı lamelleri (ECM ile kaplanmış tarafı) yerleştirin. Steril PBS içinde 3 kat ile de her bir yıkama, ve gerekli olana kadar, 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol></li><li> Lameller üzerine Kaplama için Glial hücreler hazırlanıyor. <ol><li> Glial kültürlerden ortamı aspire ve yavaşça steril, 10 ml PBS ile glial tek tabaka 3 kez yıkayın. Ardından, T-175 8-10 ml tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C&#39;de 5-10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Tek tabaka en ayrıldıktan sonra, tam bir ortamda 20 ml ekleyinşişeye tripsinizasyon durdurun. 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine müstakil hücreleri ihtiva eden ortam toplayın ve oda sıcaklığında 300 x g&#39;de 10 dakika boyunca dönerler. </li><li> Yavaşça P1000 pipeti kullanılarak çözeltisinin pipetlenmesiyle taze tam ortam, 2 ml hücrelerin yeniden askıya daha sonra pelet bozmadan süpernatanı havalandırın, ve. </li><li> Istenen yoğunluğa (ör: 10 5 hücre / ml) tam ortam içinde hücrelerin askıya ve sonra tekrar bir hemositometre kullanılarak hücre sayısını belirlemek. ECM ile kaplanmış lamelleri (24 oyuklu plakanın her oyuğuna örneğin 500 ul) üzerine hücreleri Plate. 37 ° C&#39;de inkübasyon her bir göze, 3-5 gün boyunca ek taze tamamlanmış ortam ekleyin, ya da hücrelerin istenilen görsel ortak akışa kadar büyümeye kadar. </li></ol></li><li> Psychosine ile tedavi. <ol><li> Bir stok konsantrasyonu dimetil sülfoksit (108,3 mM) içerir (DMSO) psychosine sulandırın. Bir çalışma stoğu elde etmek üzere% 100 EtOH içinde bu stokunu çıkarabilenn, 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ilave edilebilir. </li><li> Psychosine eklenmesi zamanda, kültür ortamı içine yavaşça psychosine karıştırmak için kültür plakası girdap. Bir hafta boyunca 10 uM her gün eşdeğer ekleyerek psychosine Ek. </li></ol></li><li> Psychosine tedaviden 7 gün sonra, ortam ve her kuyuya, soğuk% 4 paraformaldehit (PFA) pipetle 500 ul toplamak. 20 dakika sonra, hücrelerin tespit edilmeleri için oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha sonra, her bir göze, PBS ile yıkayın ve 3x (aşağıya bakınız) İmmünositokimya için işlenene kadar 4 ° C&#39;de plakalar tutun. Not: istenirse hücre kültür ortamı, bu noktada enzimatik ya da ELISA tahlili için toplanabilir. </li></ol> 3. İmmünositokimya (ICC) Globoid Hücreleri Visualize&#39;a <ol><li> Buffer [PBS +% 0.3 Tween-20 +% 5 normal keçi serumu (NGS)] bloke PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat için kuluçkalayın. </li><li> InIBA-1 karşı yapılan ilk antisera olarak sabit hücreler cubate [(1: 1000) PBS içinde seyreltilmiş + 0.3 +% 2 NGS% Tween-20], oda sıcaklığında en az 1 saat, daha sonra, PBS ile 5 dakika 3x, her oyuğa yıkama / yıkayın. </li><li> Çekirdekleri tespit etmek: 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI 1000, 1) sahip antikor etiketleme ve karşı leke birincil tanımlamak için uygun bir ikincil floresan-konjuge antikor ekleyin. Oda sıcaklığında 1 st için bir ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe ve PBS ile 5 dakika 3x ile yıkayın. </li><li> Bir montaj orta kullanarak slaytlar mikroskop her coverglass monte edin. Görsel ve kantitatif analizler için bir floresan mikroskop gör slaytlar. </li></ol> 4. Analiz ve İlköğretim Kültür Globoid Hücrelerinin Karakterizasyonu <ol><li> Kültüründe globoid hücreyi tanımlamak için aşağıdaki üç morfolojik kriterleri kullanın: <ol><li> , Mikrogliyal işaretleyici için immünopozitif etiketleme tarafından İba-1 + floresan mikroskobu kullanarak globoid hücreleri tanımlayın. </li><li> Belirlemek-çekirdekli (örneğin iki ya da daha DAPI pozitif çekirdeklerin) halinde globoid hücreleri. </li><li> Mikroglial hücrelerinde dinlenme yüksek ölçüde dallanmış görünümünü farklı yuvarlak bir morfolojisi ile globoid hücrelerin belirlenmesi. Not: Hücreler, aynı zamanda bu kültürlerden akış sitometrisi ile hücre yüzey markör analizi ve miktar tayini için toplanabilir. </li></ol></li><li> Mikroglia ve globoid hücrelerinin fagositik aktivasyonunu ölçülmesi <ol><li> Psychosine ile muamele mikroglia fagositik aktivitesini değerlendirmek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak kuyu FITC ile işaretlenmiş lateks boncuk ekleyin. Önceden PFA ile tespit için flüoresan konjuge edilmiş lateks boncukları 48 saat ekleyin. (3. bölümde açıklandığı gibi) immünsitokimya (2.4 bölümde belirtildiği gibi) boncuklarla işlenmiş hücreleri, ve süreç Fix. </li><li> Bunlar fluorofor etiketli boncukların floresan emisyon spektrumlarına örtüşmeyen böylece fluorofor-konjuge sekonder antikor seçin. </li><li> AnalyzE Bu hücrelerin belirlenmesi ile IBA-1 + mikroglia phagocytotic profilleri floresan etiketli boncuklar ile birlikte lokalize. NOT: Psychosine mikroglianın aktive edecektir. Fagosite boncuk bu kültür ortamında mononükleer ve çok çekirdekli İba-1 + hücreleri içinde tespit edilecektir. </li></ol></li></ol> Saf Mikroglial KÜLTÜRLERİNDEN Globoid Hücreleri 5. İndüksiyon Not: astrosit ve mikroglia arasında hücreler arası sinyal deşifre alternatif bir yolu, in vitro globoid hücre modelinin bir diğer avantajdır. Aşağıdaki adımlardan (Bölüm 5.2) de tarif edildiği gibi ya da ko-şarjı kültür için ana mikroglial hücrelerinin saflaştırılması, kültür içerisinde daha düşük bir yapışma özelliği elde edilebilir. <ol><li> 50 mL konik tüp içine birleşik karışık kültürlerden glial ortamı toplayın ve inkübatör içinde 37 ° C&#39;de korumak. </li><li> İlköğretim Karışık Glial KÜLTÜRLERİNDEN Mikroglial İzolasyon.<ol><li> Konfluent karışık kültür glial T175 şişesi ortamı çıkarılmasından sonra, [+ 25 mM 4-(2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 25 mM + sodyum bikarbonat (Sigma) ile tam bir ortam maddelerini kapsayan] sıcak çalkalama ortamı eklenir. 100 rpm&#39;de (37 ° C) bir yörüngesel karıştırıcıda 3-4 saat boyunca çalkalama. 50 ml konik tüpler içine bu sarsıldı matara medyayı toplayın. NOT: Bu ortam şişelerden daha az yapışık mikroglianın içerecektir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de ortamı Spin. Astrosit-işlemi görmüş ortam 2 ml hücrelerin yeniden askıya sonra süpernatan aspire ve (adım 5.1 toplanmıştır). </li><li> Bir hemasitometre kullanarak ve daha sonra alt-tabaka ile kaplanmış kapak slipleri üzerine mikroglial hücreleri plaka elde edilen hücre sayısını belirlemek için imünosito kimyasal olarak (bakınız bölüm 2.1), ya da diğer hücre tipleri ile ko-kültür için globoid hücre gelecek toplanması için, ultra yapışma gözlü levhalar üzerine plaka, Böyle oligodendrositlerin gibi (azalan olarak) Aşağıdaki bölümde ribed. NOT: Bir kez mikroglia (2.3 bölümü) yukarıda tarif edildiği gibi psychosine (10 uM) ile muamele edilebilir kaplama. </li></ol></li><li> Sitotoksisite Analizi için birincil oligodendrositler ile aynı kültür. Not: Primer oligodendrosit kültürleri, veya oligodendrosit progenitör hücreler üzerine takip eden ko-kültür için düşük yapışkan plakalardan psychosine ile muamele edilmiş mikroglia toplanması, bu in vitro globoid benzeri hücrelerin sitotoksik potansiyel işlevini incelemek için kullanılabilir. <ol><li> Kurulmuş yöntemleri 18,20 kullanılarak primer oligodendrositlerin kültürlerini geliştirme. Psychosine ile muamele mikroglia toplamak için, hafifçe kuyu altından gevşek bir biçimde bulunan hücreler ayırmak için pipetleyin. 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de, santrifüj hücreleri toplamak, ve daha sonra dikkatli bir şekilde, Neuro temelli ortam oluşan oligodendrosit farklılaşma medya [tekrar süspansiyon, L-glutamin (1x), B-27 ek (1x) ve triiyodotironin (T 3, 10 ng / ml )]. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını ve daha sonra yaklaşık 1 ile sonuçlanır, 1 x 10 5 hücre / ml oligodendrosit bir kültüre mikroglia tohum: 2 mikroglia / oligodendrosit oranı. En fazla 3 gün boyunca ko-kültür olarak inkübe edin. </li><li> Immünsitokimya hücreleri saptamak (bölüm 2.4). ELISA için hücre kültürü ortamı toplayın ya da gerektiği gibi kimyasal analizler. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease.">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease:+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12.">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, 450-454 (2008).</li><li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hunter's+Hope+Krabbe+family+database.">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+screening+for+Krabbe+disease:+the+New+York+State+model.">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li><li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+familial,+infantile+form+of+brain+sclerosis.">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li><li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globoid+cell+leukodystrophy:+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging.">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li><li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li><li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy.">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation.">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li><li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia.">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li><li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microglial+cytoskeleton:+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ.">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li><li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li><li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+globoid+cell+leukodystrophy.">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li><li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases.">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li><li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation:+Implications+for+leukodystrophy+pathology.">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li><li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem/progenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage/microglia+activation.">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li><li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells.">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures:+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia.">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li><li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+(TIMP-1)+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination.">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li><li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation.">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

Burada tarif edilen protokol geliştirilmesi ve aktif mikroglia ve globoid hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu incelemek için olan yeni bir model sistemi sağlar. Im ve arkadaşları tarafından önceki iş. Bir HEK293 hücre hattı kullanılarak globoid hücre oluşumu 21 çalışma için mevcut protokol geliştirilmesi için bir şablon sağladı. Bu modelde elde edilen hücreler globoid GLD tanımlanabilir doğal globoid hücrelerden farklı olduğuna işaret etmek de önemlidir. GLD yılın...

Ayrıca, Krabbe hastalığı olarak da bilinir globoid hücre lökodistrofi (MP), galatocerebrosidase (galc) geni 1 mutasyonlar işlev kaybı olmasından kaynaklanan öldürücü bir demiyeline eden bir hastalıktır. GLD en yaygın şekli, erken çocukluk döneminde başlayan verebiliriz ve genellikle yaş 2,3 beş yaşından önce motor ve erken ölüme yol açan bilişsel gerileme agresif bir klinik seyri ile karakterizedir infantil çeşididir. Genetik test GLD 4 tanısını doğrulamak için kullanılır. GLD Nöropatoloji globoid hücreler 5-7 adlandırılan yaygın demiyelinasyon, nöronal atrofi, ve astrogliyozun tıkanmış çok çekirdekli mikroglia varlığını ortaya koymaktadır. Bu göze çarpan hücrelerinin spesifik işlevi belirsiz kalmıştır rağmen bunların sitoplazmalarında tubulous inklüzyonları içeren globoid hücrelerin tanımlanması, son 97 yıldır GLD belirleyici bir özelliğidir. Olmayan MYEL katılımlarıGLD patogenezinde bertaraf eder glial (mikroglia ve astrositler) bu kadar uzun süre hastalık 8 derin demiyelinasyon ikincil yanıt olarak kabul edilmiştir. İlginçtir, 1916 5 Knud Krabbe tarafından yapılan bu hastalığın ilk açıklama, adını almış lipit enkaz içeren çok çekirdekli fagositlerin bildirdi oluşumu &#39;hücreleri GLOBOID&#39; ve bu hastalığın belirleyici bir özelliği vardır. GLD rollerini uzun ihmal edilmiş olsa Globoid hücreleri, GLD patoloji damgasını özelliğidir. İlginç bir şekilde, bu hücreler GLD CNS dokusunun bir erken karakteristik değişikliklere arasındadır. Bu bilgi eksikliği nedeniyle çok çekirdekli fagositler, diğer hastalıklar olarak adlandırılan dev hücrelerin oluşumu, tipik olarak, bir ilk patojenik itici gücü 9 daha patoloji sonucu olarak kabul edilir olduğu varsayımına olabilir. Bu nedenle, WHI tarafından mekanizmasını araştıran az sayıda çalışma vardırkanal globoid hücreleri özellikle GLD CNS&#39;de, fagositoz oluşturulur. Bu raporda açıklanan prosedür CNS&#39;de globoid hücre formasyonunun önemi ve fagositik aktivite daha yüksek seviyede sergilediği in vitro mikroglia ve bu hücrelerin bu psychosine kaynaklı multinükleasyon önceki gösteri odaklanmaktadır. Bu gözlemlerle tutarlı olarak, titrek beyinlerinde globoid fagositik hücreleri sıklıkla yüksek düzeyde aktivite gösteren, PAS pozitif kalıntı içermektedir. Globoid hücreler de ferritin için immünopozitif bulunmuştur (Mikroglia işaretleyici) 10, KP-1 / CD68 (bir monosit işaretleyici), ve biraz da vimentin için pozitif (bir ara filament proteini ve astrositlerde işaretleyici ve aktif mikroglia) 11, HLA DRA (MHC II bir yüzey reseptörü) ve TNF-α 7 ve IBA-1 12 (mikroglia tanımlamak için kullanılan bir kalsiyum bağlayıcı protein). Belirteçlerin bu koleksiyon dayanarak, globoid hücreleri geliştirmek mikrogliada kaynaklananeşsiz bir fenotip. Onların teklik rağmen, belirli bir işlevi ve GLD patogeneze GClerin katkısı büyük ölçüde gözardı edilmiştir. Globoid hücreleri kronik bir demyelinizasyon ikincil sonucu olarak düşünülmektedir. Ancak, GLD beyaz cevher patoloji globoid hücrelerin zamansal ilişkiyi ele geçmiş çalışmaların erken doğum sonrası dönemlere geç embriyonik içinde globoid hücrelerin varlığını tespit ettik; olgodendrosit apoptoz ve aleni demiyelinizasyonu 13 önceki kez. Böylece gld içinde nöropatolojinin gelişme zamansal dizisi globoid hücreleri bu hastalığın 14 demyelinasyon önceden oluşturulmuş olduğunu göstermektedir. Bu GLD içinde globoid hücrelerin erken oluşumu olgodendrosit hasar 15 ikincil reaktif tepki yerine tanımlayan bir patojenik olayı temsil edebilir bizim hipoteze. Ayrıca, GLD mikrogliyal aktivite düzensizliği facto bir kabul edilmiştirR, bu hastalığın tedavi edilmesi için 16 hematopeotic kök hücre tedavilerinin uzun vadeli etkisini azaltır. Böylece, psychosine yanıt hücresel fonksiyonları ve mikroglianın düzenleme ve globoid hücreleri, soruşturma GLD patogenezinde yeni anlayışlar sağlaması bekleniyor. Yakın zamana kadar, globoid hücre oluşumunu incelemek için uygun bir modelin eksikliği kesin fonksiyonu ve GLD patolojiye bu hücrelerin katkı anlayış olamadı. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, bu globoid benzeri hücreler gld biriken patojenik toksin lipit psychosine doğrudan tepki olarak oluşturulabilir olduğu belirlenmiştir. O mikroglia değil, ancak makrofajlar, aktive edilmiş ve 15 psychosine karşılık olarak birincil kültürde globoid glial hücrelere transforme edilir. Globoid hücrelere Bu dönüşüm, hücre dışı proteaz, matris metaloproteinaz (MMP) -3 15 aracılık ettiği bulunmuştur. Daha yakın zamanlarda,Bu in vitro model sisteminde geliştirilen psychosine-aktif mikroglia ve globoid hücreler genişletilmiş ve bu bulguları belirledikten oligodendrosit ve oligodendrosit projenitör hücreler için potansiyel olarak toksik değildir. Bu nedenle, GLD, psychosine ve bu hastalıkta mikroglia için, ortaya çıkan ilk ve muhtemelen patojenik bir rol destekleyecektir demiyelinasyon önce globoid hücrelerinin oluşumunun erken birikimi bağlamında dikkati çekmektedir. Biz bu hastalığın anlaşılmasına katkıda bulunacaktır GLD patogenezi hakkında yeni bilgiler ortaya çıkacaktır globoid hücresi oluşumu bu çalışmayı öneriyorum. Dahası, GLD bu yeni hücresel modelin yeni tedavi yaklaşımları, bu hastalığın patolojik değişiklikler test edilebilir hitap hangi yeni bir biçimi sağlayabilir. Bu nedenle, bu raporda non-myelinating glia primer kültürlerinde psychosine kaynaklı globoid hücrelerinin in vitro olarak geliştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

Globoid hücre lökodistrofi (GLD) merkezi sinir sisteminde benzersiz bol miktarda globoid hücreler olarak adlandırılan, çok-çekirdekli mikroglia işlevi tam, açık değildir. Bilginin bu boşluk çalışma için bir in vitro model uygun olmaması ile engellenmiştir. Bu yazıda, bir ilköğretim kemirgen glial kültür sistemi açıklanmaktadır GLD bulunan karakteristik globoid hücrelerini andıran mikroglianın multinükleasyon içinde psychosine sonuçları ile hangi tedavi olarak. Bu roman sistemi kullanarak, biz globoid hücrelerin çalışması için koşulları ve analiz modları tanımlanır. Bu model sisteminin potansiyel kullanım matriks metalloproteinaz (MMP) için potansiyel bir rol tespit önceki çalışmamızda, geçerliliği -3 GLD içinde. Vitro sistemde bu yeni bu eşsiz hücrelerin oluşumu ve işlevi, hem de potansiyel tedavi edici işleme, çalışılacak yararlı bir model olabilir.

Bu protokol, yazılı olarak, bitirmek (: Deneysel Akışı Şeması Bkz: Şekil 1) baştan tamamlamak için yaklaşık 36 gün sürmesi bekleniyor. Bu, birincil kültür sisteminde &#39;globoid benzeri&#39; hücrelerin gelişimi, güvenilir ve tekrarlanabilir bir nitelikte olduğu deneyim olmuştur: psychosine yanıt olarak çok çekirdekli hücrelerinin oluşumu sürekli tedaviden 7 gün ile görülmektedir. Büyük bir tespit edilmesine olanak verecektir nükleer karşı-...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy at JoVE.com

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Görüntüleme.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

Video: An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Gelişim Biyolojisi

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Nörobilim

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modelleme Astrositom Patogenez<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are still important because they offer an efficient cellular alternative for studying cellular and molecular events. Though C2C12 myoblast cells have been widely used to study myogenesis, resistance to gene transfection, or viral transduction, hinders research in C2C12 cells. Here, we describe an optimized protocol that includes daily maintenance, transfection and transduction procedures to introduce genes into C2C12 myoblasts and the induction of myocyte differentiation. Collectively, these procedures enable best transfection/transduction efficiencies, as well as consistent differentiation outcomes. The protocol described in establishing DM1 myoblast cell models would benefit the study of myotonic dystrophy, as well as other muscular diseases.

In this protocol, we present the procedures in establishing myotonic dystrophy 1 myoblast models, including optimized C2C12 cell maintenance, gene transfection/transduction, and myocyte differentiation.

C2C12 Miyoblast Hücrelerde Myotonik Distrofi 1 Modelleme

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Tıp

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Yetişkin fare DRG Explant ve nöroplastisite ve Viral enfeksiyon da dahil olmak üzere çevre hakaret yanıtlar araştırmak için hücre modelleri ayrışmış

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biyoloji

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için