This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti in conformità con la politica sulla Humane cura e l&#39;uso di animali da laboratorio esposte dall&#39;Ufficio del Laboratorio Benessere degli Animali (NIH) e solo con l&#39;approvazione da Care and Use Committee Animal Istituzionale (IACUC) dell&#39;Università di Connecticut Health Center. 1 Preparazione delle Culture gliali miste <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell&#39;uso. Aggiungere 3 ml di soluzione ghiacciata sterile di Hank equilibrata sale (HBSS) non contenenti cationi (Mg 2 + o Ca 2 +) a tre sterili 60 millimetri piastre Petri mantenute sul ghiaccio per mantenere il freddo. </li><li> Isolare le cortecce da postnatali cuccioli di topo P0-P2, come descritto in precedenza 17,18. NOTA: strutture sottocorticali, come l&#39;ippocampo, non sono incluse in queste culture. </li><li> Rimuovere con attenzione le meningi e poi trasferire le cortecce isolate di fresco HBSS e dissociare i tessuti enzimaticamente, utilizzando un neural kit di dissezione dei tessuti secondo il protocollo del produttore. </li><li> Piastra le cellule in sterili T-175 palloni e incubare una notte nei media [Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero fetale bovino al 10% (FBS) contenente 1x penicillina / streptomicina]. </li><li> Sostituire tutti i media il giorno successivo con i media fresca. Continuare a incubare le culture, con cambi regolari di media, per circa 3 settimane o fino a quando viene stabilito un monostrato cellulare. NOTA: Questo monostrato sarà composto di astrociti e microglia con uno di circa 10: 1 ratio 19. </li></ol> 2 Globoid induzione delle cellule gliali in Culture misti <ol><li> Preparare i coprioggetti ECM rivestite. <ol><li> Immergere coprioggetto circolari con 1 acido sterile N cloridrico (HCl) in una piastra di Petri sterile per 30 min. Lavare coprioggetto con 3x acqua sterile e poi immergere nel 95% EtOH per almeno 20 min. e poi lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Luogo goccioline di diluito matr extracellularemateriali ix (ECM) rivestimento proteina su un foglio di Parafilm (es 150-250 ml / gocciolina di laminina 10 mcg / ml disciolto in tampone fosfato sterile [PBS]). Distribuire le gocce in modo che vetrini non toccare, quando sono immessi su queste goccioline. Posizionare delicatamente ogni coprioggetto secca su una gocciolina con pinze. </li><li> Lasciare i coprioggetti sulle goccioline per ca. 4-6 hr all&#39;interno della cappa cultura con la fascia chiusa. </li><li> Posizionare i coprioggetti ECM rivestite (lato ECM rivestite up) in ciascuno dei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Lavare ogni pozzetto con PBS sterile 3x e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparazione di cellule gliali per placcatura su vetrini. <ol><li> Aspirare il supporto dalle colture gliali e lavare delicatamente le 3x monostrato gliali con 10 ml di PBS sterile. Successivamente, aggiungere 8-10 ml di soluzione di tripsina-EDTA al T-175, e incubare per 5-10 min a 37 ° C. </li><li> Quando la maggior parte del monostrato è stato staccato, aggiungere 20 ml di completo supportoal pallone per fermare tripsinizzazione. Raccogliere i supporti contenenti le cellule staccate in un tubo conico da 50 ml e centrifugare per 10 minuti a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet, e poi risospendere le cellule in 2 ml di mezzi freschi completo pipettando delicatamente la soluzione con una pipetta P1000. </li><li> Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e poi risospendere le cellule in terreno completo alla densità desiderata (ad esempio 10 5 cellule / ml). Piastra le cellule sui vetrini ECM rivestite (ad esempio 500 ml in ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti). Aggiungere ulteriori mezzi freschi completi a ciascun pozzetto per 3-5 giorni di incubazione a 37 ° C, o fino a quando le cellule crescono alla confluenza visivo desiderato. </li></ol></li><li> Il trattamento con psicosina. <ol><li> Ricostituire il psicosina ad una concentrazione magazzino (108,3 mm) in dimetilsolfossido (DMSO). Diluire questo stock in 100% EtOH per fare una scorta di lavoro che può lan essere aggiunti in ogni pozzetto della piastra da 24 pozzetti per ottenere una concentrazione finale di 10 mM. </li><li> Al momento di aggiungere il psicosina, agitare delicatamente la piastra di coltura per mescolare il psicosina nella cultura dei media. Supplemento alla psicosina aggiungendo l&#39;equivalente di 10 micron ogni altro giorno per una settimana. </li></ol></li><li> Dopo 7 giorni di trattamento psicosina, raccogliere i media e pipetta 500 ml di freddo 4% paraformaldeide (PFA) in ogni pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 20 min per fissare le cellule. Poi, lavare i pozzetti 3 volte con PBS e poi tenere le piastre a 4 ° C fino a quando trattati per immunoistochimica (vedi sotto). NOTA: cellule di coltura possono essere raccolti per enzimatici o test ELISA a questo punto se lo si desidera. </li></ol> 3. immunocitochimica (ICC) per visualizzare le cellule Globoid <ol><li> Sostituire PBS con tampone di bloccaggio [+ 0,3% Tween-20 + 5% di siero di capra normale PBS (NGS)], e incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubate le cellule fissate in antisieri primaria contro Iba-1 [(1: 1.000) diluita in PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS] per almeno 1 ora a temperatura ambiente, poi lavare i pozzetti con PBS 3x 5 min / lavare. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo coniugato fluorescenza secondaria opportuno identificare il primario etichettatura anticorpi e anti-macchia con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1: 1.000) per identificare i nuclei. Incubare in soluzione anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente e lavata con PBS 3x 5 min. </li><li> Montare ogni coprioggetti al microscopio diapositive utilizzando un mezzo di montaggio. Lettura dei vetrini su un microscopio a fluorescenza per l&#39;analisi visive e quantitative. </li></ol> 4 Analisi e caratterizzazione di cellule in coltura primaria Globoid <ol><li> Utilizzare i seguenti tre criteri morfologici per identificare una cella globoidi nella cultura: <ol><li> Identificare le cellule globoidi usando la microscopia a fluorescenza, mediante l&#39;etichettatura immunopositive per il marcatore microglia, Iba-1 +. </li><li> Identificarecellule globoidi come polynucleated (cioè che contengono due o più nuclei positivi DAPI). </li><li> Identificare le cellule globoidi da una morfologia arrotondata distinto l&#39;aspetto altamente ramificata di riposo cellule microgliali. NOTA: Le cellule possono essere raccolte anche per la superficie cellulare marcatore analisi e quantificazione mediante citometria a flusso da queste culture. </li></ol></li><li> Misurare l&#39;attivazione fagocitaria della microglia e cellule globoidi <ol><li> Per valutare l&#39;attività fagocitaria della microglia psicosina trattati, aggiungere perline di lattice FITC-etichettati ai pozzetti in accordo con le istruzioni del produttore. Aggiungi sfere di lattice fluorescente-coniugati 48 ore prima della fissazione con PFA. Fissare le cellule trattate con perline (come indicato nella sezione 2.4), e il processo di immunocitochimica (come descritto nella sezione 3). </li><li> Selezionare anticorpi secondari fluoroforo coniugato in modo che non si sovrappongano gli spettri di emissione a fluorescenza del fluoroforo etichettato perline. </li><li> Analyze i profili phagocytotic di Iba-1 + microglia di individuare le cellule che co-localizzano con le perline fluorescenza marcata. NOTA: psicosina attiverà microglia. Perline fagocitati saranno definiti nell&#39;ambito mononucleate e multinucleate Iba-1 + cellule in questa impostazione cultura. </li></ol></li></ol> 5. induzione di Globoid Le cellule ottenute da colture purificate microgliali NOTA: Un approccio alternativo per decifrare la segnalazione intercellulare tra astrociti e microglia è un altro vantaggio di questo vitro globoidi modello cellulare in. Purificazione di cellule microgliali primarie per replating o co-coltura può essere ottenuto mediante la loro proprietà aderenza minore nella cultura, come descritto nei passaggi seguenti (vedi Sezione 5.2). <ol><li> Raccogliere il supporto dalle confluenti colture gliali miste in tubo da 50 ml e mantenerla a 37 ° C in incubatore. </li><li> Isolamento microglia da primari Culture gliali miste.<ol><li> Dopo aver rimosso il supporto da un pallone T175 cultura gliali miste confluenti, aggiungere i media si stringono caldi [comprensivi di supporti completi + 25 mm 4-(2-idrossietil) -1 acido-piperazineethanesulfonic (HEPES) + bicarbonato di sodio 25 mM (Sigma)]. Agitare i flaconi per 3-4 ore in un agitatore orbitale a 100 rpm (37 ° C). Raccogliere i media di questi flaconi scosso in 50 ml provette coniche. NOTA: Questo supporto include la microglia meno aderente dai fiaschi. </li><li> Spin media a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 2 ml di media-astrociti condizionata (raccolte nella fase 5.1). </li><li> Stabilire il numero di cellule acquisiti utilizzando un emocitometro e poi piastra le cellule microgliali su vetrini substrato rivestito (vedi sezione 2.1) per immunocitochimica, o piastra su piastre aderenza e Ultralow per la futura raccolta di cellule globoidi per co-coltura con altri tipi di cellule, come oligodendrociti (come described nella sezione seguente). NOTA: Una volta placcato la microglia può essere trattata con psicosina (10 mM) come descritto sopra (vedi sezione 2.3). </li></ol></li><li> Co-coltura con oligodendrociti primari per l&#39;analisi di citotossicità. NOTA: Collezione di psicosina trattati microglia dalle piastre di aderenza bassi per la successiva co-coltura su colture primarie di oligodendrociti, o cellule progenitrici degli oligodendrociti, può essere utilizzato per esaminare la funzione potenziale citotossico di queste cellule globoidi simili in vitro. <ol><li> Sviluppare colture di oligodendrociti primarie che utilizzano metodi stabiliti 18,20. Per ritirare la microglia psicosina trattati, pipettare delicatamente per staccare le cellule aderenti liberamente dal fondo dei pozzetti. Raccogliere le cellule, centrifugare a 300 xg per 10 minuti, e poi risospendere con attenzione nella differenziazione degli oligodendrociti dei media [composto Neurobasal supporti, L-glutammina (1x), B-27 supplemento (1x) e triiodotironina (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e poi seminare le microglia sulla cultura oligodendrociti a 1 x 10 5 cellule / ml, con un conseguente approssimativa 1: 2 microglia / rapporto oligodendrociti. Incubare come co-coltura per un massimo di 3 giorni. </li><li> Fissare le cellule per immunocitochimica (vedere paragrafo 2.4). Raccogliere coltura cellulare supporti per ELISA o analisi chimiche a seconda delle necessità. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

Il protocollo qui descritto fornisce un nuovo modello di sistema in cui studiare lo sviluppo e la caratterizzazione funzionale di microglia attivate e cellule globoidi. Lavoro preliminare da Im et al. utilizzando una linea cellulare HEK293 ha fornito un modello per lo sviluppo del presente protocollo per lo studio della formazione delle cellule globoidi 21. E &#39;inoltre importante sottolineare che le cellule derivate globoidi nel modello differiscono dalle cellule globoidi native identificabili in ...

Leucodistrofia cellule Globoid (GLD), nota anche come malattia di Krabbe, è una malattia demielinizzante mortale derivante dalla perdita di funzione mutazioni nel galatocerebrosidase (GALC) gene 1. La forma più diffusa di GLD è la variante infantile, che è caratterizzata da esordio nella prima infanzia e caratterizzata da un decorso clinico aggressivo del motore e del declino cognitivo che porta alla morte prematura, spesso prima di cinque anni di 2,3 anni. Il test genetico viene utilizzato per verificare una diagnosi di GLD 4. Neuropatologia di GLD rivela demielinizzazione diffusa, atrofia neuronale, astrogliosis e la presenza di microglia gonfie multi-nucleate chiamato cellule globoidi 5-7. L&#39;identificazione delle cellule globoidi, spesso contenenti inclusioni tubulosi nel loro citoplasma, è stata una caratteristica distintiva della GLD negli ultimi 97 anni, anche se la specifica funzione di queste cellule cospicui è rimasta inafferrabile. Il coinvolgimento di non-myelnari glia (astrociti e microglia) nella patogenesi della GLD è stata a lungo considerata una risposta secondaria alla profonda demielinizzazione in questa malattia 8. È interessante notare che la prima descrizione di questa malattia, realizzato da Knud Krabbe nel 1916 5, la formazione riferito fagociti multinucleate contenenti lipidi detriti che sono stati chiamati &#39;Globoid cellule&#39; e sono una caratteristica di questa malattia. Cellule globoidi sono la caratteristica segno distintivo di GLD patologia, anche se il loro ruolo nella GLD è stata a lungo ignorata. È interessante notare che queste cellule sono tra i primi cambiamenti caratteristici CNS tessuto GLD. Questa mancanza di conoscenza può essere dovuto al presupposto che la formazione dei fagociti multinucleate, dette cellule giganti in altre malattie, sono tipicamente considerati come conseguenza della patologia piuttosto che una forza trainante patogeno iniziale 9. Pertanto, ci sono stati pochi studi che hanno valutato il meccanismo attraverso il whicellule globoidi ch sono formate da fagociti, soprattutto nel SNC di GLD. La procedura descritta in questo rapporto si concentra sull&#39;importanza della formazione delle cellule globoidi nel sistema nervoso centrale e la nostra precedente dimostrazione che psicosina indotta multinucleazione della microglia in vitro e queste cellule esposte livelli più elevati di attività fagocitaria. Coerentemente con queste osservazioni, globoidi cellule nel cervello twitcher spesso contengono residui PAS-positivo, suggerendo elevati livelli di attività fagocitaria. Globoidi cellule si trovano anche ad essere immunopositive di ferritina (un marcatore microglia) 10, KP-1 / CD68 (un marcatore monociti), e alcuni sono anche positivi per vimentina (una proteina intermedia filamento e marker di astrociti e microglia attivata) 11, HLA-dra (un recettore di superficie MHCII), e TNF-α 7, e Iba-1 (una proteina legante calcio-antagonista usato per identificare microglia) 12. Sulla base di questa collezione di marcatori, cellule globoidi provengono da microglia che si sviluppanoun fenotipo unico. Nonostante la loro unicità, la funzione e il contributo di GC a GLD patogenesi specifico è stato ampiamente trascurato. Cellule globoidi sono stati pensati per essere una conseguenza secondaria di demielinizzazione cronica. Tuttavia, studi precedenti che esaminano l&#39;associazione temporale delle cellule globoidi alla materia patologia bianco di GLD hanno identificato la presenza di cellule globoidi nel tardo embrionale ai primi periodi post-natale; tempi precedenti l&#39;apoptosi degli oligodendrociti e demielinizzazione conclamata 13. Così, la sequenza temporale di sviluppo della neuropatologia in GLD suggerisce che le cellule globoidi sono formate in anticipo di demielinizzazione in questa malattia 14. Ciò ha portato alla nostra ipotesi che la precoce formazione di cellule globoidi in GLD può rappresentare un evento patogeno che definisce piuttosto che una risposta reattiva secondaria a danno degli oligodendrociti 15. Inoltre, disregolazione delle attività di microglia in GLD è stato considerato un fattor limitando l&#39;efficacia a lungo termine di terapie con cellule staminali hematopeotic per il trattamento di questa malattia 16. Così, indagando le funzioni cellulari e regolazione della microglia e cellule globoidi, in risposta a psicosina dovrebbe fornire nuove intuizioni nella patogenesi della GLD. Fino a poco tempo, la mancanza di un modello appropriato in cui studiare la formazione delle cellule globoidi aveva limitato la comprensione della funzione e il contributo di queste cellule alla patologia di GLD preciso. In studi recenti, è stato stabilito che le cellule globoidi-come possono essere formati in risposta diretta a psicosina, una tossina lipidi patogeno che si accumula in GLD. Abbiamo scoperto che la microglia, ma non macrofagi, vengono attivati ​​e trasformati in cellule gliali globoidi in colture primarie in risposta a psicosina 15. Questa trasformazione in cellule globoidi è risultato essere mediata dalla proteasi extracellulare, metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 15. Più di recente, abbiamohanno esteso questi risultati e determinato che la microglia e cellule globoidi psicosina attivati ​​sviluppate in questo sistema modello in vitro sono potentemente tossico per gli oligodendrociti e le cellule progenitrici degli oligodendrociti. Quindi, se considerato nel contesto della GLD, la precoce accumulo di psicosina e la formazione di cellule globoidi prima di demielinizzazione sosterrebbe un ruolo primario ed eventualmente patogeni emergenti per microglia in questa malattia. Noi proponiamo che lo studio della formazione delle cellule globoidi rivelerà nuove informazioni sulla patogenesi della GLD che contribuiranno alla nostra comprensione di questa malattia. Inoltre, questo nuovo modello cellulare di GLD può fornire un nuovo formato da cui nuovi approcci terapeutici per affrontare i cambiamenti patologici in questa malattia potrebbero essere testati. Quindi, in questa relazione forniamo un protocollo dettagliato per lo sviluppo in vitro di cellule globoidi psicosina indotta da colture primarie di cellule gliali non-mielinizzanti.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

La precisa funzione di microglia multi-nucleata, chiamate cellule globoidi, che sono unicamente abbondanti nel sistema nervoso centrale di leucodistrofia cellulare globoidi (GLD) è chiaro. Questo divario nella conoscenza è stato ostacolato dalla mancanza di un adeguato modello in vitro per lo studio. Qui, descriviamo un sistema di coltura gliale murino primario in cui il trattamento con risultati psicosina in multinucleazione della microglia che ricordano le caratteristiche cellule globoidi trovate in GLD. Con questo nuovo sistema, abbiamo definito le condizioni e le modalità di analisi per lo studio delle cellule globoidi. L&#39;uso potenziale di questo sistema modello è stato validato nel nostro studio precedente, che ha individuato un potenziale ruolo di metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 in GLD. Questo nuovo sistema in vitro può essere un modello utile per studiare la formazione e funzione, ma anche il potenziale manipolazione terapeutica di queste cellule uniche.

Questo protocollo, come scritto, è prevista per circa 36 giorni per completare dall&#39;inizio alla fine (vedere Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale). E &#39;stata la nostra esperienza che lo sviluppo delle cellule globoidi-like &quot;in questo sistema di coltura primaria sia affidabile e riproducibile: la formazione di cellule multinucleate in risposta a psicosina è costantemente osservata con 7 giorni di trattamento. Colorazione immunocitochimica della mic...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Views.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Produzione e l&#39;uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi mielinizzazione

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Derivazione di precursori gliali limitati dalla E13 topi

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Neuroscienze

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello di un attacco T-Cell Oligodendrocyte-diretto nel acute cervello fette

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Immunologia e infezioni

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are still important because they offer an efficient cellular alternative for studying cellular and molecular events. Though C2C12 myoblast cells have been widely used to study myogenesis, resistance to gene transfection, or viral transduction, hinders research in C2C12 cells. Here, we describe an optimized protocol that includes daily maintenance, transfection and transduction procedures to introduce genes into C2C12 myoblasts and the induction of myocyte differentiation. Collectively, these procedures enable best transfection/transduction efficiencies, as well as consistent differentiation outcomes. The protocol described in establishing DM1 myoblast cell models would benefit the study of myotonic dystrophy, as well as other muscular diseases.

In this protocol, we present the procedures in establishing myotonic dystrophy 1 myoblast models, including optimized C2C12 cell maintenance, gene transfection/transduction, and myocyte differentiation.

Modellazione Distrofia miotonica 1 nelle cellule dei mioblasti C2C12

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Medicina

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Topo adulto DRG Explant e dissociato modelli cellulari per studiare neuroplasticità e risposte agli insulti ambientali, compreso l'infezione virale

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellazione del genoma umano Morbid utilizzando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biologia

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Un

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Produzione e l'uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore