This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

כל הנהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם למדיניות על צער בעלי חיים טיפול ושימוש בחי מעבדה שנקבע על ידי המשרד למעבדת צער בעלי חיים (NIH), ורק עם אישור מהוועדה המוסדי הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת מרכז לבריאות קונטיקט. .1 הכנת תרבויות גליה מעורבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל המכשירים לפני השימוש. הוסף 3 מ&quot;ל של התמיסה קרה כקרח סטרילי של האנק המאוזן מלח (HBSS) המכילה לא קטיונים (Mg 2 + או Ca 2 +) לשלוש 60 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילי שמרו על קרח כדי לשמור על הקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את קליפת המוח מגורי עכבר P0-P2 לאחר לידה, כפי שתואר קודם לכן 17,18. הערה: מבנים קורטיקליים, כגון hippocampi, אינם כלולים בתרבויות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את קרומי המוח ולאחר מכן להעביר את קליפת המוח המבודדים לHBSS הטרי ולנתק את רקמות אנזימים, באמצעות neערכה לנתיחה רקמות אוראל על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת התאים לתוך T-175 צלוחיות סטרילי ודגירת הלילה בתקשורת [בינוני הנשר (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) המכיל פניצילין / סטרפטומיצין 1x שונה Dulbecco]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את כל אמצעי התקשורת ביום שלמחרת עם תקשורת טרי. תמשיך לדגור תרבויות, עם שינויי מדיה רגילים, למשך כ 3 שבועות או עד monolayer סלולרי שהוקם. הערה: monolayer זה יהיה מורכב מהאסטרוציטים ומיקרוגליה עם כ 10: 1 יחס 19. </li></ol> .2 אינדוקציה סלולארי Globoid בתרבויות גליה מעורבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את coverslips ECM מצופה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים coverslips העגול עם חומצת סטרילי 1 N הידרוכלורית (HCl) בצלחת פטרי סטרילית למשך 30 דקות. לשטוף coverslips עם 3x מים סטריליים ולאחר מכן לטבול ב95% EtOH לפחות 20 דקות. ואז לתת לי אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפות מקום matr תאי המדוללחומרי ix ציפוי (ECM) חלבון על גיליון של Parafilm (למשל 150-250 μl / טיפה של laminin 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל מומס בתמיסת חיץ פוספט סטרילי [PBS]). להפיץ את הטיפות כדי שcoverslips לא לגעת כאשר הניח על גבי הטיפות הללו. מניח בעדינות כל coverslip מיובש על אגל באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את coverslips על הטיפות למשך כ. 4-6 שעות בתוך מכסה המנוע התרבות עם האבנט סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslips ECM מצופה (בצד עד מצופה ECM) לכל אחת מהבארות של צלחת 24 גם. לשטוף היטב עם כל PBS 3x סטרילי ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי גלייה לציפוי על coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מתרבויות גליה ולשטוף בעדינות 3x monolayer גליה עם 10 מ&quot;ל של PBS סטרילית. לאחר מכן, להוסיף 8-10 מ&quot;ל פתרון טריפסין-EDTA לT-175, ודגירה של 5-10 דקות ב37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר רוב monolayer כבר מנותק, להוסיף 20 מ&quot;ל של מדיה מלאהלבקבוק כדי להפסיק trypsinization. לאסוף את המדיה המכילה את התאים מנותקים לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל וספין 10 דקות ב XG 300 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ&quot;ל של מדיה מלאה טרי בעדינות על ידי pipetting הפתרון באמצעות pipet P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן מחדש להשעות תאים בינוניים מלא בצפיפות הרצויה (10 5 תאים / מ&quot;ל לדוגמא). פלייט התאים על coverslips ECM מצופה (למשל 500 μl לבאר כל הצלחת 24 גם). הוסף מדיה שלמה טרי נוספת לכל גם ל3-5 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, או עד שתאים לגדול למפגש החזותי הרצוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בPsychosine. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את psychosine לריכוז המניה (108.3 מ&quot;מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל מניות זה ב100% EtOH לעשות מניית עובדת שיכולn יתווסף לבאר כל צלחת 24 גם כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הוספת psychosine, בעדינות מערבולת צלחת התרבות לערבב psychosine לתקשורת והתרבות. להשלים את psychosine ידי הוספה המקבילה של 10 מיקרומטר בכל יום אחר במשך שבוע אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימי טיפול psychosine, לאסוף את התקשורת ו500 μl pipet של paraformaldehyde הקר 4% (PFA) לתוך כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, לשטוף היטב 3x כל אחד עם PBS ולאחר מכן לשמור על צלחות ב 4 ° C. עד מעובד לimmunocytochemistry (ראה להלן). הערה: תקשורת תרבית תאים ניתן לאסוף להאנזימטית או assay ELISA בשלב זה אם תרצה בכך. </li></ol> .3 Immunocytochemistry (ICC) לדמיין תאי Globoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS עם חיץ חסימה [+ 0.3% Tween-20 5 +% עזים בסרום נורמלי PBS (NGS)], ודגירת התאים עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בcubate תאים הקבועים בantisera העיקרי נגד איבא-1 [(1: 1,000) בדילול מלא PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS] במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף היטב עם כל דקות 3x PBS 5 / לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המשני המתאים כדי לזהות את עיקרי תיוג נוגדן ונגד כתם עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1,000) לזהות גרעינים. דגירה בפתרון נוגדנים משני עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר ולשטוף עם דקות 3x PBS 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל coverglass לשקופיות מיקרוסקופ באמצעות הרכבה בינונית. צפה בשקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור ניתוחים חזותיים וכמותית. </li></ol> .4 ניתוח ואפיון של תאי Globoid בתרבות ראשית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשלושה הקריטריונים מורפולוגיים הבאים כדי לזהות תא globoid בתרבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאי globoid באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי תיוג immunopositive עבור סמן microglial, + איבא-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זההתאי globoid כ( כלומר שתיים או יותר גרעינים חיוביים DAPI המכילים) polynucleated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאי globoid ידי מורפולוגיה מעוגלת להבדיל מההופעה מסועפת מאוד של מנוחה תאי microglial. הערה: תאים יכולים להיות גם שנאסף לצורך ניתוח סמן פני תא וכימות על ידי cytometry זרימה מתרבויות אלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת הפעלת phagocytic של מיקרוגליה ותאי globoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את פעילות phagocytic של מיקרוגליה טופל psychosine, להוסיף חרוזים לטקס FITC שכותרתו לבארות בהתאם להוראות היצרן. להוסיף חרוזים לטקס ניאון מצומדות- 48 שעות לפני קיבוע עם PFA. תקן תאים שטופלו בחרוזים (כאמור בסעיף 2.4), ותהליך לimmunocytochemistry (כאמור בסעיף 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נוגדנים משני fluorophore מצומדות-, כך שהם אינם חופפים ספקטרום פליטת הניאון של חרוזים fluorophore שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Analyzדואר פרופילי phagocytotic של איבא-1 + מיקרוגליה על ידי זיהוי אותם התאים שישתפו למקם עם חרוזים fluorescently שהכותרת. הערה: Psychosine יפעיל מיקרוגליה. חרוזים phagocytosed יזוהו בתוך איבא-1 תאים + mononucleated וmultinucleated בהגדרת התרבות זו. </li></ol></li></ol> .5 אינדוקציה של תאי Globoid מתרבויות מזוקקים microglial הערה: גישה חלופית לפענח איתות בין תאית בין astrocyte ומיקרוגליה היא יתרון נוסף של במבחנה globoid מודל זה תא. טיהור של תאי microglial העיקריים לreplating או שיתוף culturing יכולה להיות מושגת על ידי רכוש הדבקות הנמוך שלהם בתרבות, כפי שמתוארת בשלבים הבאים (ראה סעיף 5.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התקשורת מתרבויות גליה מעורבות ומחוברות לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל ולתחזק אותו על 37 מעלות צלזיוס בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד microglial מתרבויות גליה מעורבות ראשית.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת התקשורת מבקבוק T175 מחוברות מעורבת תרבות גליה, להוסיף מדיה רועדת חמה [בהיקף של מדיה מלאה + 25 מ&quot;מ 4 החומצה (2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 סודיום ביקרבונט מ&quot;מ (Sigma)]. לנער את צלוחיות ל3-4 שעות בייקר מסלולית ב100 סל&quot;ד (37 מעלות צלזיוס). לאסוף את המדיה מצלוחיות מזועזעות אלה לתוך 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל. הערה: תקשורת זה תכלול מיקרוגלים פחות חסיד מהצלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התקשורתי XG 300 10 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ&quot;ל של תקשורת מיזוג astrocyte (שנאסף בשלב 5.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים את מספר התאים שנרכש באמצעות hemocytometer ולאחר מכן צלחת תאי microglial על coverslips מצופה מצע (ראה סעיף 2.1) לimmunocytochemistry, או צלחת על גבי צלחות גם דבקות ultralow לאוסף עתידי של תאי globoid לתרבות משותפת עם סוגי תאים אחרים, כגון oligodendrocytes (כיורדribed בסעיף הבא). הערה: ברגע שמצופית המיקרוגלים יכולים להיות מטופלים עם psychosine (10 מיקרומטר) כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 2.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף תרבות עם ראשוני Oligodendrocytes לניתוח רעיל. הערה: אוסף של מיקרוגליה טופל psychosine מצלחות ההיענות הנמוכה לתרבות משותפת שלאחר מכן על תרבויות עיקריות של oligodendrocytes, או תאי אב oligodendrocyte, יכולה לשמש כדי לבחון את התפקוד ציטוטוקסיות הפוטנציאל של תאים דמויי globoid אלה במבחנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח תרבויות של oligodendrocytes העיקרית בשיטות הוקמו 18,20. כדי לאסוף את מיקרוגליה טופל psychosine, בעדינות pipet לנתק את התאים חסיד רופף מהחלק התחתון של הבארות. לאסוף את התאים, צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות, ולאחר מכן resuspend בזהירות בתקשורת בידול oligodendrocyte [מורכבת מתקשורת Neurobasal, L-גלוטמין (1x), B-27 תוספת (1x), וtriiodothyronine (T3, 10 ng / ml )]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן זרע מיקרוגליה על תרבות oligodendrocyte ב1 x 10 5 תאים / מ&quot;ל, וכתוצאה מכך 1 משוער: 2 מיקרוגליה / יחס oligodendrocyte. דגירה כשיתוף תרבות לתקופה של עד 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים לimmunocytochemistry (ראה סעיף 2.4). אסוף תקשורת תרבית תאים לELISA או בדיקות כימיות לפי צורך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease.">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease:+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12.">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, 450-454 (2008).</li><li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hunter's+Hope+Krabbe+family+database.">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+screening+for+Krabbe+disease:+the+New+York+State+model.">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li><li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+familial,+infantile+form+of+brain+sclerosis.">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li><li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globoid+cell+leukodystrophy:+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging.">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li><li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li><li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy.">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation.">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li><li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia.">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li><li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microglial+cytoskeleton:+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ.">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li><li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li><li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+globoid+cell+leukodystrophy.">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li><li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases.">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li><li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation:+Implications+for+leukodystrophy+pathology.">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li><li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem/progenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage/microglia+activation.">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li><li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells.">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures:+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia.">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li><li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+(TIMP-1)+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination.">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li><li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation.">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק מערכת מודל חדשה שבו ללמוד פיתוח ואפיון פונקציונלי של מיקרוגליה מופעלים ותאים globoid. עבודה מוקדמת של אל Im et. באמצעות שורת תאי HEK293 סיפק תבנית לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי לחקר תא globoid היווצרות 21. כמו כן, חשוב להצביע על כך שתאי globoid...

leukodystrophy Globoid התא (GLD), המכונה גם מחלת Krabbe, היא מחלה demyelinating קטלנית כתוצאה מאובדן של מוטציות פונקציה בgalatocerebrosidase הגן (galc) 1. הצורה השכיחה ביותר של GLD היא הגרסה הילדותית המתאפיינת בהתפרצות בילדות מוקדמת ומאופיינת במהלך קליני אגרסיווי של מנוע וירידה קוגניטיבית שמובילה למוות בטרם עת לעתים קרובות לפני חמש שנים בגיל 2,3. בדיקות גנטיות משמשות לאימות אבחנה של 4 GLD. נוירופתולוגיה של GLD חושפת פגיעה במיאלין נפוצה, ניוון עצבי, astrogliosis ונוכחות של מיקרוגליה רב גרעיניים צבה נקרא תאי globoid 5-7. זיהוי של תאי globoid, לעתים קרובות המכיל תכלילים tubulous בהציטופלסמה שלהם, היה תכונה מגדירה של GLD ל97 השנים האחרונות, למרות שהתפקיד הספציפי של תאים הבולטים אלה נותר חמקמק. מעורבותם של הלא myelגליה (מיקרוגליה ואסטרוציטים) inating בפתוגנזה של GLD כבר מזמן נחשבים תגובה משנית לפגיעה במיאלין העמוקה במחלה זו 8. מעניין לציין, כי התיאור הראשון של מחלה זו, שנעשה על ידי Knud Krabbe 1916 5, היווצרות מדווחת של phagocytes multinucleated המכיל פסולת שומנים שכבר בשם &#39;globoid תאים&#39; והוא מאפיין מגדיר של מחלה זו. תאי Globoid הם תכונת סימן ההיכר של פתולוגיה GLD, למרות שהתפקיד שלהם בGLD זכה להתעלמות ארוכה. מעניין, תאים אלה הם בין השינויים האופייניים המוקדמים ברקמת מערכת העצבים המרכזית של GLD. זה חוסר הידע אולי היה בשל ההנחה כי ההיווצרות של phagocytes multinucleated, תאים ענק הנקראים במחלות אחרות, נחשבות בדרך כלל כתוצאה של פתולוגיה ולא כוח פתוגניים ראשוני נהיגה 9. לכן, היו מעט מחקרים החוקרים את המנגנון שבאמצעות WHIתאי globoid ch נוצרים מphagocytes, במיוחד במערכת העצבים המרכזית של GLD. ההליך המתואר בדוח זה מתמקד בחשיבות של היווצרות תאי globoid במערכת העצבים המרכזית וההפגנה הקודמת שלנו שmultinucleation המושרה psychosine של מיקרוגליה במבחנה ותאים אלה הציג רמות גבוהות יותר של פעילות phagocytic. עולה בקנה אחד עם תצפיות אלה, תאי globoid במוח Twitcher לעתים קרובות מכילים פסולת PAS-חיובי, המצביעים על רמות גבוהות של פעילות phagocytic. תאי Globoid גם הם מצאו להיות immunopositive לפריטין (סמן מיקרוגליה) 10, KP-1 / CD68 (סמן מונוציטים), וחלקם גם חיובי עבור vimentin (חלבון ביניים נימה וסמן של האסטרוציטים ומיקרוגליה הופעלו) 11, HLA-DRA (קולטן משטח MHCII), וTNF-α 7, וייבא-1 (חלבון קושר סידן המשמש לזיהוי מיקרוגליה) 12. בהתבסס על אוסף זה של סמנים, תאי globoid מקורן מיקרוגליה המתפתחיםהפנוטיפ ייחודי. למרות הייחוד שלהם, את הפונקציה ותרומתו של GCS לפתוגנזה GLD הספציפיים הוזנחה. תאי Globoid כבר חשבו להיות תוצאה משנית של פגיעה במיאלין הכרונית. עם זאת, המחקרים האחרונים שבחנו את הקשר הזמני של תאי globoid לפתולוגיה בחומר הלבן של GLD זיהו הנוכחות של תאי globoid בסוף העוברי לתקופות לאחר לידה מוקדמת; פעמים הקודמות אפופטוזיס oligodendrocyte ופגיעה במיאלין הגלוי 13. כך, הרצף הזמני של פיתוח בנוירופתולוגיה של GLD מצביע על כך שתאי globoid נוצרים מראש של פגיעה במיאלין במחלה זו 14. זה הוביל להשערה שלנו כי ההיווצרות המוקדמת של תאי globoid בGLD עשויה לייצג אירוע פתוגניים הגדרה ולא תגובה משנית, תגובתי לנזק oligodendrocyte 15. בנוסף, חוסר ויסות של פעילות microglial בGLD כבר נחשב פקטוr הגבלת היעילות ארוך הטווח של טיפולים בתאי גזע hematopeotic לטיפול במחלה זו 16. כך, חוקר את התפקודים התאיים ורגולציה של מיקרוגליה, ותאי globoid, בתגובה לpsychosine צפוי לספק תובנות חדשות בפתוגנזה של GLD. עד לאחרונה, חוסר המודל מתאים שבו תוכל ללמוד היווצרות תא globoid הגביל את ההבנה של התפקיד והתרומה של תאים אלה לפתולוגיה של GLD המדויקים. במחקרים שנעשה לאחרונה, נקבע כי יכולים להיווצר תאי globoid-כמו בתגובה ישירה לpsychosine, רעלן שומנים פתוגניים שמצטבר בGLD. מצאנו מיקרוגליה את זה, אבל לא מקרופאגים, מופעלים ולהפוך לתאי globoid בתרבויות גליה עיקריות בתגובה לpsychosine 15. השינוי הזה לתאי globoid נמצא להיות מתווך על ידי פרוטאז תאי, metalloproteinase מטריקס (MMP) -3 15. לאחרונה, אנוהרחיבו את הממצאים הללו וקבע כי תאי מיקרוגליה וgloboid מופעל psychosine פותחו במבחנת מערכת מודל זה הם בעצמה רעילה לoligodendrocytes ובתאי oligodendrocyte. לפיכך, כאשר נחשבו בהקשר של GLD, ההצטברות המוקדמת של psychosine והיווצרות של תאי globoid לפני הפגיעה במיאלין יתמוך תפקיד עיקרי ואולי פתוגניים המתעוררים למיקרוגליה במחלה זו. אנו מציעים מחקר שהיווצרות תא globoid יחשפו מידע חדש על הפתוגנזה של GLD שיתרום להבנה של מחלה זו שלנו. יתר על כן, מודל הסלולרי החדש של GLD עשוי לספק פורמט חדש שממנו הגישות טיפוליות חדשניות לטיפול בשינויים פתולוגיים במחלה זו יכולים להיבדק. לפיכך, בדוח זה אנו מספקים פרוטוקול מפורט לפיתוח במבחנה של תאי globoid מושרה psychosine מתרבויות עיקריות של גליה myelinating שאינו.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

הפונקציה המדויקת של מיקרוגליה רב גרעיניים, הנקראת תאי globoid, כי הם ייחודיים בשפע במערכת העצבים המרכזית של leukodystrophy תא globoid (GLD) אינה ברורה. פער בידע זה התעכב בשל חוסר מתאים במודל חוץ גופית למחקר. במסמך זה, אנו מתארים מערכת תרבות העיקרית עכברית גליה שבו טיפול עם תוצאות psychosine בmultinucleation של מיקרוגליה הדומים לתאי globoid האופייניים שנמצאו בGLD. שימוש במערכת הרומן הזה, שהגדרנו את התנאים ומצבים של ניתוח למחקר של תאי globoid. פוטנציאל השימוש של מערכת מודל זה קבל תוקף במחקר הקודם שלנו, שזיהה את התפקיד פוטנציאלי לmetalloproteinase מטריקס (MMP) -3 בGLD. רומן במערכת מבחנה זה עשוי להיות מודל שימושי שבו ללמוד את המבנה ותפקוד, אלא גם מניפולציה הטיפולית הפוטנציאלית, של תאים הייחודיים אלה.

פרוטוקול זה, כפי שנכתב, צפוי להימשך כ 36 ימים כדי להשלים מהתחלה ועד הסוף (ראה איור 1: ניסיוני זרימת העבודה Scheme). זה היה הניסיון שלנו כי התפתחותם של תאים &#39;כמו globoid&#39; במערכת התרבות העיקרית זה היא גם אמינה ושחזור: ההיווצרות של תאי multinucleated בתגובה לpsychosine הוא ציינה ב...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy at JoVE.com

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Views.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

Video: An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Developmental Biology

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are still important because they offer an efficient cellular alternative for studying cellular and molecular events. Though C2C12 myoblast cells have been widely used to study myogenesis, resistance to gene transfection, or viral transduction, hinders research in C2C12 cells. Here, we describe an optimized protocol that includes daily maintenance, transfection and transduction procedures to introduce genes into C2C12 myoblasts and the induction of myocyte differentiation. Collectively, these procedures enable best transfection/transduction efficiencies, as well as consistent differentiation outcomes. The protocol described in establishing DM1 myoblast cell models would benefit the study of myotonic dystrophy, as well as other muscular diseases.

In this protocol, we present the procedures in establishing myotonic dystrophy 1 myoblast models, including optimized C2C12 cell maintenance, gene transfection/transduction, and myocyte differentiation.

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Medicine

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Explant של עכבר למבוגרים DRG הפומבית תא מודלים לחקור והנוירולוגיה הפלסטית ואת התגובות עלבונות סביבתי כולל זיהום ויראלי

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biology

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל