Funding was provided by the Joint Science and Technology Office &#8211; Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).

Plaka 20,000 farklılaşmış fare ES hücreleri (MES) / bir 96 Poly-D lisin kaplı plakalara ve 5-7 gün süre ile, motor nöron terminal farklılaşma ortam içinde muhafaza. BoNT / A 1. Bileşik İdaresi ve Zehirlenme CDC / NIH kurallarına uyum sağlamak için bir BSL2 kasada aşağıdaki tüm iş gerçekleştirin. <ol><li> Polipropilen 96 oyuklu plakalar içinde,% 100 DMSO içinde her bir kütüphane bileşiğin 10 mM&#39;lik stok çözelti hazırlayın. Arzu edilen tarama konsantrasyonunun daha yüksek 10-kat bir ara seyreltme plaka hazırlanması için 10 mM stok kullanın. 96 oyuklu bir plakaya 10 mM stok tevzi 100 uM&#39;lik bir ara levha hazırlamak ve kültür ortamı ile 100 uM seyreltilmesi. Hücreler 11 ortamın 90 ul üzerinde bileşiklerin 10 ul koyun. 10 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerin test edin ve 0,5 ağırlık% nihai DMSO yüzdesi emin olun. </li><li> Tüm damızlık gerçekleştirinBiyogüvenlik düzeyi 2 şartlar altında canlı hücreleri ve aktif toksin kullanmak ler. Taze terminal farklılaşma ortam 80 ul bir 12 kanal kılavuzu pipet kullanılarak 96 oyuklu plakalar içinde eski medya değiştirin. Aspirasyon yürütmek ve ortam havasına medya olmadan hücrelerin maruz kalmasını önlemek için satırlara göre adımlar dağıtmak. </li><li> (Iki kez) önceden aspirasyon ile karıştırılması ve ardından 12 kanallı pipet kullanılarak kaynak plaka 10x bileşikler 10 ul eklenmesi ile toksin uygulanmasından bileşikleri ile ön işlemden geçirin hücreleri. Her bir 96-delikli plaka için, yüksek bir sinyal ve düşük sinyal kontrol hizmet için bir ortamda seyreltilir 10x DMSO ile 6 kuyu iki sütun tedavi. BoNT, tedavi olmaksızın Kolon tam uzunluğu, SNAP-25 (yüksek sinyal kontrol) en yüksek düzeyi sergiler. Düşük sinyal kontrol olarak (herhangi bir bileşik olmadan) tek başına BoNT&#39;nin ile diğer sütun davranın. (BACS antikor ile SNAP-25 ve algılama BoNT bölünme etkinliğini gözlemlemek için Şekil 2 düşük kontrolünü kullanın). </li><li> Hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de 30 dakika karıştırıldı ve% 6 CO2 bileşikler ile inkübe hücreleri. </li><li> Fosfat içinde 1 mg / ml ticari bir kaynaktan botulinum nörotoksininin A Hazırlama terminal farklılaşma ortamı ile seyreltilerek nihai 10x çalışma stok için serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden önce. </li><li> Bir çok kanallı pipet (Şekil 2) kullanılarak tedavi ve düşük sinyal kontrolleri için belirlenen kuyuların içine 10x BoNT&#39;nin / A stok 10 ul ekleyerek zehirlenmeye başlatın. Tek başına medya ile yüksek kontrol olarak belirlenmiş kuyu davranın. </li><li> En az 20 dakika boyunca suda% 0.825 toplam hipoklorit çözeltisi içine daldırma ile çalışma sırasında, BoNT / A ile temas eden tüm plastik eşya ve diğer tek kullanımlık arındırın. Biyogüvenlik dolapları tüm prosedürleri yerine önce ve böyle MicroChem çözüm olarak% 5 deterjan dezenfektan temizleyici ile deneyler sonrasında çalışma alanlarını temizleyiniz. </li><li> Toksin kullanımı ve inkubasyon göstermek için açık plakaları Etiketyedi plakalar, bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de 4 saat ve% 6 CO2 1 nm / L, BoNT / A ile muamele edilmiştir. Toksin laboratuvarda kullanımda olduğunu meslektaşlarını bilgilendirmek için uygun tabela görüntüler. </li><li> Dur Bont / metanol tespit ile bir proteolitik bölünme. Çok kanallı bir pipet ile, her kuyudan toksin ve bileşikleri ihtiva eden Ortamı çıkarın ve% 10 ağartıcı çözeltisi içinde atın. Her bir oyuğa, doğrudan buz soğukluğunda metanol (100 ul) eklenir. </li><li> Tespit yapılmasına izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Fiksasyon sonra, güvenle biyogüvenlik düzeyi 1 protokolleri ile atılan reaktifleri (nötralize sayılır) idare ve buna göre atın. </li><li> Metanol atın ve hücreleri yıkayın ve immunosteyn önce onları rehydrate PBS 100 ul kullanın. İki ek PBS yıkama yapın. </li><li> Son yıkamadan sonra, analiz zamanına kadar 4 ° C&#39;de mikro-yapışkan film ve mağaza ile kuyular, conta plakalarında PBS bırakın. 4 ° C Piazz saklayın plakalarbirkaç gün r. </li></ol> 2. immün İmmünoboyama prosedür önemli Levha içi ve açıklarda oluşan değişkenlik potansiyel tanıtım yol açabilir tekrarlayan reaktif dağıtıcı / aspirat döngüleri ve geniş plaka yıkama içeren bir emek-yoğun, çok aşamalı bir işlemdir. Bir yarı-otomatik bir yaklaşım, laboratuar personelinin zamandan tasarruf tahlil verimi artırmak ve değişkenliği immünboyama en aza indirmek için uygulanır. <ol><li> Bu protokol için modüler güvertede farklı yerlerde (Malzeme ve Ekipmanları bakınız) içine laboratuar aletlerinin taşımak için bir robot tutucu kol ile 250 ul ve entegre hacimleri transfer edebilecek 96-de kafa ile donatılmış otomatik bir iş istasyonu kullanın. <ol><li> Modüler güverte laboratuvar donatımı farklı türde ev sahipliği için ve herhangi bir anda 11 öğelere destekleyebilir tasarlanmıştır. Otomatik mikrolevha işleyicisi tutmak için bir çift dergi mikrolevha istifleyici ile donatılmıştır vedöngü başına 50 kalıba kadar manipüle. </li><li> Otomatik iş istasyonu kısırlığa ve güvenliğini sağlamak amacıyla laboratuvar otomasyon cihazları için tasarlanan Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde yer almaktadır. Gerektiğinde ve insan müdahelesi olmaksızın reaktif erişim sağlamak için, Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi otomatik immün için, güverte düzenlenmiştir. </li></ol></li><li> Sıvı elleçleme operasyonları için gereken şekilde güverte plaka dergi ve transfer içine sabit hücreler içeren ön-yük plakaları. Aşağı 10 ul kuyulardan PBS aspire 250 ul ipuçları ile donatılmış 96 pipet başını kullanın. Permeabilizasyon tampon maddesi (% 0.1 Triton-X 100) kullanılarak hücre içi hedefleri antikor bağlanmasını kolaylaştırmak için hücre zarlarını geçirgenliği. De oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkalama için mikroplaka istif bölmesine ikinci depolama dergisi plakaları dönmeden önce her birine permeabilizasyon tamponu (100 ul) koyun. </li><li> Permeabilizasyon tamponu ve pe KaldırPBS (iki defa) ile rform plaka yıkaması, daha önce adım 1.13 tarif edilmiştir. </li><li> Son yıkama aşamasından sonra, PBS tampon ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilmek üzere plaka dergisi bunları dönmeden önce mikroplakalara PBS içinde% 1 at serumu ve% 0.1 Tween 20 içeren blokaj tampon 100 ul dağıtmak çıkarın. </li><li> Immün için iki primer antikorlar kullanın: bir tavşan poliklonal anti-fare BACS antikoru, tam uzunlukta, SNAP-25 ve bir fare monoklonal anti-III tubulin antikor tespiti için nöronların (malzeme ve teçhizat bakınız) tespit edilmesi için. Kuluçkadan 60 dakika sonra, bloklama tamponunu çıkarın ve tüm plakalar halinde, bloke edici tampon içinde 4UG / ml BACS antikorun ve III-tubulin, 0.5 ug / ml, 50 ul dağıtmak. </li><li> RT% 0.05 Tween (PBST) içeren 100 ul PBS ile 3 kez primer antikorlar çıkarın ve yıkama de 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Alexa F ile etiketlenmiş III tübülin ve anti-tavşan IgG görselleştirmek için Alexa Fluor 647 ile etiketlenmiş bir anti-fare IgG kullanınluor 568 BACS antikor görselleştirmek için. Bloke edici tampon içinde bir 2 ug / ml dilüsyon olarak antikorları hazırlamak ve her oyuğa, karışımın 50 ul dağıtmak. Not: immün için seçilen ikincil antikorlar Yüksek İçerik Imager detektör içinde farklı kanal kullanılarak farklı dalga boylarında salınan fluoresan algılanmasına izin vermek için, farklı flüorofor ile etiketlenir. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. İkincil antikorlar aspire ve PBST içinde 100 ul 3 kez yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, çekirdekler tespiti için DNA leke içeren PBS Hoechst boya (32 uM) 100 ul ilave edin. </li><li> Işıkla ağartma gelen florofor korunması için bir ışık geçirmeyen film tabak mühürleyin. Plakalar 4 ° C&#39;de saklanabilir &#160; Sinyalin önemli bir kayıp olmadan haftalarca ° C. </li></ol> 3. Görüntüleme NOT: Yüksek İçerik Görüntüleme Sys kullanarak görüntü alımı gerçekleştirintem (Malzeme ve Ekipmanları bakınız). <ol><li> Yüksek İçerik Görüntüleyici Tanımlar Şartname: <ol><li> Seç Plaka tipi, düzen, alan sayısı, amacı: Greiner u berrak, 20X su sırasıyla 96 kuyu biçimi, 16. </li><li> Kanalları seçin: nukleus uyarma EX: kanal 4 olarak 405 nm; sitoplazma EX: Kanal 2 olarak 644 nm; antijen spesifik antikor kanal Ex: 561 kanal 3 olarak mil ve her bir lazer ayarlama uyarım gücü, 2 etkisi başlıkları Ayar deney, 644 nm&#39;de bir eksitasyon, 405 nm ve 561 nm&#39;de iki uyarımları olan Pozlama 2 Pozlama 1. Bin2 olarak binning seçin. </li><li> SNAP-25 kanal ve minimal yoğunluğu düşük kontrol kuyuları gibi maksimum yoğunlukta maruz optimizasyonu için yüksek kontrol kuyuları kullanın. </li><li> Her kanalın yoğunluğu doyma seviyesi (2,000-2,500 göre ünite) yaklaşık yarısı olacak şekilde maruz kalma ayarlayın. </li><li> Delta düzeltme script kullanarak hücre maske kanalda optimum Z uçağı tanımlayın. See Fiimmünoboyamayla ve görüntüleme sonra sonuçları için saat&#39;in 5. Görüntü analiz yazılımı ikamet ediyor sunucuya İhracat verileri. </li></ol></li></ol> 4. Görüntü Analizi (Şekil 6) NOT: Aşağıdaki adımlar Columbus yazılım algoritmalarının uygulamasını açıklar. <ol><li> Birincil nesneler (çekirdekleri) segmentine uygun bir algoritma seçin. Gerekirse, arka plan eşiği ve kontrast parametrelerini ayarlamak. Columbus Yazılım 4 çekirdekler algılama yöntemleri sağlar. Görsel Parçalara çekirdekleri incelenerek doğru kademeli çekirdekleri (F igure 6a yöntem M seçili) olduğunu yöntemini seçin. </li><li> Gerekirse, segment nevritlerle nörit algoritması (CSIRO Neurite Analizi 2) seçmek arka planı kaldırmak için arka plan eşik ve kontrast parametrelerini ayarlamak. Nevritlerle tespit etmek için kullanılan bir parametreler Şekil 6b. </li><li> Nevrit bölgeleri (nevrit segment) bas tespited β-III tubulin kanal maskesi (Şekil 6c) olarak (Alexa Un 640) bir -3 piksel açılımı kullanılarak ikincil nesneler (nevrotiler) üzerine. </li><li> Nevritler bölge ve β-III tubulin kanalı (Şekil 6d ve 6e) için sinyal kanallarının (SNAP-25, (Alexa unu 568) yoğunluğunu hesaplar. </li><li> Böyle bir nevrit uzunluğu, SNAP-25 ortalama yoğunlukları, β-III tubulin, çekirdekler numarası, nevrit segmenti numarası vb (Şekil 6f) gibi ihracat için istenen parametreleri seçin. </li><li> Görüntü alımı için Yüksek İçerik Imager içine robot ve yük kullanılarak plaka istifleyicilerden transfer plakaları. </li></ol> 5. Veri Analizi: Tasarlanan tahlilin sağlamlığını değerlendirmek için, plaka bazlı deney, aşağıdaki parametrelerin hesaplanması. <ol><li> Arka sinyal (S) (B): Düşük sinyal kontrolü S / B = ortalama /) yüksek sinyal kontrolü ortalama yoğunluğu yoğunluğu </li> &lt;sıvı işlemedeki değişkenliği belirlemek, CV = (Standart Sapma (SD) / numunenin ortalama) * 100 (%): li&gt; sinyal ve arka Değişimi (CV) Katsayısı (özel sinyalinin tekdüzelik ölçmek için) reaktifler, vb </li><li> Gürültü Sinyal: S = - düşük kontrol / SD (sinyalin ortalama yoğunluğu düşük sinyal kontrolü ortalama yoğunluğu) <ol><li> Bir 96-yuvalı plaka yarısı ve diğer yarısı bir sahte zehirlenme zehirlenmesi ile Z &#39;faktör hesaplayın. Z &#39;= 1 - 3 * (yüksek sinyal kontrol + düşük sinyal kontrolü SD SD) / (yüksek sinyal kontrolü anlamına - düşük sinyal kontrol ortalamasını). Eleme verilerinin daha fazla analiz için, bir plaka olarak, primer ham bazı parametrelerin karşılaştırılması plakaları arasında ve deneyler, farklı gün arasında izin vermek için normalize edilecektir. </li></ol></li><li> % Yarılması =% 100 * (MEA: Tam uzunlukta olan SNAP-25&#39;in spesifik antikor ile tespit (BACS) ile bağlantılı sinyalinin azalan yansıtan bölünme yüzdesi,yüksek sinyal kontrolü n yoğunluğu - numune yoğunluğu) / yüksek sinyal kontrolü ortalama yoğunluğu. </li><li> Parçalanmasının inhibisyonu yüzdesi:% İnhibisyon =% 100 * - / (- düşük sinyal kontrol ortalama yoğunluğu yüksek sinyal kontrol ortalama yoğunluğu) (örnek yoğunluğu düşük sinyal kontrol ortalama yoğunluğu). </li></ol>

<ol>
	<li>Lamanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+most+poisonous+poison.">The most poisonous poison.</a> Science. 130, 763-772 (1959).</li><li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene.">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> J. Infect. Dis. , (2013).</li><li>Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+ground:+assays+for+therapeutics+against+botulinum+neurotoxin.">Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin.</a> Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).</li><li>Yersin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+synaptic+vesicle+fusion+proteins+explored+by+atomic+force+microscopy.">Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).</li><li>Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+sensors+to+detect+botulinum+neurotoxin+activity+in+vitro+and+in+living+cells.">Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).</li><li>Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+botulism+therapeutic+product+development+in+the+Department+of+Defense.">Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense.</a> Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).</li><li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+to+measure+botulinum+neurotoxin+serotype+A+activity+using+cleavage-sensitive+antibodies.">Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies.</a> Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).</li><li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemotype+that+inhibits+three+unrelated+pathogenic+targets:+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+light+chain,+P.+falciparum+malaria,+and+the+Ebola+filovirus.">A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus.</a> Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).</li><li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene+derivatives+providing+submicromolar-range+inhibition+of+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+metalloprotease.">The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease.</a> European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).</li><li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacophore+Refinement+Guides+the+Rational+Design+of+Nanomolar-Range+Inhibitors+of+the+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Metalloprotease.">Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease.</a> ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).</li><li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem cell research. 6, 195-205 (2011).</li><li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+targeting,+internalization,+and+biological+activity+of+a+recombinant+atoxic+derivative+of+botulinum+neurotoxin+A.">Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).</li><li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel,+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research.">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+modulation+of+the+botulinum+neurotoxin+protein-conducting+channel.">Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).</li></ol>

Krishna P Kota is an employee of Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, that produces instruments and software used in this manuscript. The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the U.S. Department of Health and Human Services, the U.S. Department of Defense, the U.S. Department of the Army, or the institutions and companies affiliated with the authors.

Botulinum nevrotoksinlere ve silahlandırılması göreli kolaylığı, yüksek kuvvette Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri ABD tarafından Kategori A (en yüksek öncelik) biothreat maddeler olarak sınıflandırılması sonuçlandı. Ne yazık ki, hiçbir FDA toksin motor nöronlar tarafından içselleştirilmiş sonra BoNT&#39;den zehirlenmelere karşı terapötikleri onaylanmış bulunmaktadır. BoNT zehirlenme nöronal iyileşme teşvik Herhangi druggable mekanizması bu biyolojik tehdide karşı silahlı hizm...

Clostridium botulinum Botulinum nörotoksin, 1 adam bilinen en güçlü biyolojik toksinlerin birini üretir. 7 farklı BoNT serotipleri (BoNT / AG) vardır. BoNT / A-Safra nedeniyle tuzak karmaşık proteoliz 2,3 için nöromüsküler kavşakta felce neden. Tuzak proteoliz nörotransmitter vezikül membran füzyonu önleyen ve bu nedenle blok eksositoz 4 nörotransmitterlerle. Belirli bir tuzak hedef zehirlenme işlemde söz konusu olan belirli, BoNT serotip bağlıdır. BoNT / A ve BoNT / E cleave SNAP-25 BoNT / C yararak hem SNAP-25 ve sintaksin 5 oysa. Ayrıca veziküllü bağlı zar proteini (VAMP) olarak adlandırılan kalan serotipler, yarılma sinaptobrevin (., BoNT / A, doğal olarak oluşan bir botulizm yüksek bir kısmından sorumlu olduğu gibi tahlil geliştirme için seçilmiş ve küçük bir molekülün eylem 6. Geliştirme en uzun kalış süresine sahip olan BoNT / A&#39;ya karşı terapatikler için önemli bir hedeftirBizim ilaç keşfi programı ve 8-10 aktif sitesi proteolitik inhibitörleri 7 tanımlamak için geleneksel hedef tabanlı yöntemler kullanmıştır. Ancak, çoklu serotipleri ve maruziyet sonrası etkinliğine karşı geniş spektrumlu aktiviteye sahip aktif sitesi inhibitörlerinin oluşturulması muhtemel zorlu olacak. Bu nedenle BoNT-aracılı motor nöron zehirlenmeye engelleyebilirsiniz küçük molekülleri tanımlamak için fonksiyonel bir son nokta olarak BoNT SNAP-25 bölünme kullanan yenilikçi, fenotipik ilaç keşif yaklaşımı hayata geçirdik. SNAP-25 in vivo felç ve letalitesinin öngörü olduğunu SNAP-25 bozulması gibi, nörotransmitter salınımı için gereklidir. Örneğin, hücre bazlı tarama toksin ya da etkisiz hale hedef hücreler içinde toksin yollarının engellenmesi için sorumlu hücresel faktörlerin yeni modülatörlerinin bulunması beklenmektedir. Fenotipik tahlil gelişiminde önemli bir faktör, fizyolojik olarak uygun biyolojik modeller seçimidir. WE ve diğerleri, SNAP-25 11 13 ekspresyonu dahil olmak üzere, primer motor nöron immünolojik karakterini özetlemek fare embriyonik kök (ES) hücresinden türetilmiş motor nöronları, tarif edilmiştir. Önemli olarak, bu hücresel sistemler, BoNT / A zehirlenmesine karşı oldukça duyarlıdır ve toksin 11,12 konsantrasyonlarının artmasına tepki olarak SNAP-25 doza bağlı olarak bölünmesini göstermektedir. Farklılaşmış motor nöronlar, aynı zamanda yüksek miktarda levha göre analiz için yeterli olan ve hücresel tahlillerde bir dizi tasarıma izin verilen miktarlarda üretilmektedir. Bir fenotipik tahlil, BoNT / fare motor nöron kültürü bir zehirlenmesi sırasında endojen olarak ifade edilen tam uzunlukta SNAP-25 bölünmesini ölçmek için iki farklı antikor kullanılarak bir imüno-yöntemdir. Sadece tüm uzunluğu boyunca SNAP-25 tanıyan bir karboksil terminal, BoNT / bir bölünme duyarlı (BACS) antikoru SNAP-25&#39;in BoNT / A proteolizinin aracılı değerlendirilmesine olanak sağlamaktadırFare motora ifade 10 nöronlar. HCI deneyinin şematik bir diyagramıdır, Şekil 1 &#39;de tasvir edilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:280px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Botulinum neurotoxin A&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;">No catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microtitre plates</td>
			<td style="width:180px;">Greiner&#160;</td>
			<td style="width:119px;">655946</td>
			<td style="width:280px;">Poly-D-Lysine 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BACs antibody</td>
			<td style="width:180px;">Lampire Biological</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microchem</td>
			<td style="width:180px;">National&#160;</td>
			<td style="width:119px;">0255</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Methanol</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-20</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Horse serum</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16050</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PE JANUS MDT Mini Automated Workstation</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">AJMDT01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opera</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td>OP-QEHS-01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BIII tubulin antibody</td>
			<td style="width:180px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">BAM1195</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween 20</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342dye&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">3570</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antimouse IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21236</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Anti rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10042</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Columbus Image analysis software</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 2.4</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Spotfire</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 5.5</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Clorox bleach</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18-861-284</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PlateStack</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high content imaging assay for identification of botulinum neurotoxin inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Yüksek ve düşük kontrolleri Veri 3 standart sapma (Şekil 7A) aşan iki medyan farkı ile iki ayrı popülasyonları yarattı. Tarama işleminin amacı, örneklem (Şekil 7B (i)) içerisinde normal dağılımı varsayılarak, daha yakın pozitif kontrol popülasyonuna değerleri ile örnek popülasyon içindeki bileşikler bulmaktır. Ortalama ötesinde 3 standart sapma veri noktaları gürültü istatistiksel olarak farklı kabul edilir ve aktif bir &quot;hit&quot; olarak sınıfla...

Watch this Scientific Journal Video about A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors at JoVE.com

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Botulinum nörotoksininin önleyicilerinin tanımlanmasına daha yüksek bir miktarda Görüntüleme Deneyi

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

a-high-content-imaging-assay-for-identification-botulinum-neurotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Görüntüleme.  Perkin Elmer Inc.. Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Video: A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Nörobilim

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Yüksek alan fMRI kullanılarak Yetişkin kedilerde işitme korteksi Fonksiyonel Görüntüleme

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Yüksek çözünürlük<em&gt; İn Vivo</em&gt; 3T Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanma İnsan hipokampal alanlar için Manuel Segmentasyon Protokolü

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Non-invaziv parankim, Vasküler ve Metabolik Yüksek frekanslı ultrason ve foto akustik Sıçan Derin Beyin Görüntüleme

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

İnsan Subcortex yüksek çözünürlüklü yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme<I&gt; İn Vivo</I&gt; Ve Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.