Funding was provided by the Joint Science and Technology Office &#8211; Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).

Plate 20000 différenciées des cellules ES de souris (MES) / puits dans une lysine 96 plaques revêtues de poly-D et ainsi maintenir dans des neurones moteurs milieux de différenciation terminale pour les 7/5 jours. 1. Administration composé et intoxication avec BoNT / A Effectuer tous les travaux suivants dans un boîtier BSL2 pour maintenir la conformité avec les lignes directrices des CDC / NIH. <ol><li> Préparer 10 mM solutions de chaque composé bibliothèque dans 100% de DMSO en polypropylène plaques à 96 puits. Utilisez le 10 mM à préparer une plaque de dilution intermédiaire qui est 10 fois supérieure à la concentration de dépistage souhaité. Préparer 100 uM plaque intermédiaire à raison de 10 mM en plaque de 96 puits et diluer à 100 uM en utilisant des milieux de culture. Distribuer 10 pl des composés sur 90 pi de milieu sur les cellules 11. Tester les composés à 10 uM de concentration finale et assurer le pourcentage final de DMSO ne doit pas excéder 0,5%. </li><li> Effectuer toutes goujons qui utilisent des cellules vivantes et la toxine active sous le niveau de biosécurité 2 conditions. Remplacez les médias dans les plaques à 96 puits avec 80 ul de milieu de différenciation terminale frais à l&#39;aide d&#39;un manuel 12 canaux pipette. Effectuer aspiration et distribuer étapes en lignes pour éviter l&#39;exposition des cellules sans les médias à l&#39;air ambiant. </li><li> Pré-traiter les cellules avec des composés avant l&#39;application de la toxine par l&#39;addition de 10 pl de 10x composés de la plaque de source à l&#39;aide d&#39;une pipette 12 canaux, suivi du mélange par aspiration (deux fois). Pour chaque plaque de 96 puits, traiter deux colonnes de 6 puits avec 10x DMSO dilué dans les médias pour servir de signal élevé et les contrôles de signaux faibles. La colonne sans traitement BoNT présente le plus haut niveau de la longueur SNAP-25 (contrôle de signal haute). Traiter l&#39;autre colonne avec BoNT seul (sans composés) que le contrôle de signal faible. Utiliser une faible contrôle pour observer l&#39;efficacité de clivage BoNT de SNAP-25 et sa détection par l&#39;anticorps BACS (Figure 2). </li><li> Incuber les cellules avec les composés pendant 30 min à 37 ° C et 6% de CO 2 dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> Préparation à partir de neurotoxine botulinique A a 1 mg / ml source commerciale dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à un stock de travail 10x finale par dilution avec un milieu de différenciation terminale. </li><li> Initier intoxication par addition de 10 pl de 10x BoNT / Un stock dans les puits désignés pour le traitement et faible signal commande à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux (figure 2). Traiter les puits désignés comme un grand contrôle avec le milieu seul. </li><li> Décontaminer tous articles en plastique et autres produits jetables qui entre en contact avec BoNT / A au cours de l&#39;étude par immersion dans une solution d&#39;hypochlorite de 0,825% dans l&#39;eau pendant au moins 20 min. Effectuer toutes les procédures dans les armoires de biosécurité et de décontaminer les zones de travail à la fois avant et après des expériences avec 5% de détergent désinfectant nettoyant comme solution MicroChem. </li><li> Étiqueter clairement les plaques d&#39;un usage de la toxine et Incubmangé plaques traitées avec 1 nM / l de BoNT / A pendant 4 heures à 37 ° C et 6% de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire. Afficher une signalisation appropriée pour informer les collègues que la toxine est en usage dans le laboratoire. </li><li> Arrêter BONT / A clivage protéolytique par le méthanol fixation. Retirez le support contenant la toxine et composés à partir de chaque puits avec une pipette multicanaux et jeter dans une solution d&#39;eau de Javel à 10%. Ajouter de la glace du méthanol froid (100 pi) directement à chaque puits. </li><li> Incuber les plaques pendant 15 min à température ambiante (TA) pour permettre la fixation de se produire. </li><li> Après fixation, gérer en toute sécurité les réactifs mis au rebut (considérés comme neutralisés) avec un niveau de biosécurité 1 protocoles et jeter en conséquence. </li><li> Jeter méthanol et utiliser 100 pi de PBS à laver les cellules et les réhydrater avant la coloration immunologique. Effectuer deux lavages PBS supplémentaires. </li><li> Après le lavage final, laisser PBS dans les puits, des plaques d&#39;étanchéité avec un film adhésif de microplaques et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse. plaques de conserver à 4 ° C for plusieurs jours. </li></ol> 2. Immunocoloration La procédure de coloration immunologique est une opération en plusieurs étapes de main-d&#39;œuvre qui comprend répétitives réactifs cycles distribution / aspirer et un lavage intensif de plaque qui peut conduire à l&#39;introduction potentielle de variabilité significative intraplaque et interplaque. Une approche semi-automatique est appliqué pour enregistrer le temps du personnel de laboratoire, d&#39;augmenter le débit essai, et minimiser la variabilité immunomarquage. <ol><li> Utiliser un poste de travail automatisé équipé d&#39;une tête de 96 bien capable de transférer des volumes allant jusqu&#39;à 250 pi et intégré avec un bras de préhension robotisé pour déplacer du matériel de laboratoire en différents endroits sur le pont modulaire (voir Matériel et équipement) pour ce protocole. <ol><li> La plate-forme modulaire est conçu pour accueillir différents types de matériel de laboratoire et peut supporter jusqu&#39;à 11 articles en tout temps. Le gestionnaire de microplaques automatisé est équipé d&#39;un magasin à double empilement de microplaques pour maintenir etmanipuler jusqu&#39;à 50 plaques par cycle. </li><li> Le poste de travail automatisé est situé à l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique de classe II conçus pour l&#39;équipement d&#39;automatisation de laboratoire pour assurer la stérilité et de la sécurité. Par immunomarquage automatique, le pont est disposé comme représenté sur la figure 3 afin de permettre l&#39;accès des réactifs en fonction des besoins et sans intervention humaine. </li></ol></li><li> Plaques pré-charge contenant des cellules fixes dans le magasin de la plaque et le transfert de la plate-forme en tant que nécessaire pour les opérations de manipulation de liquides. Utilisez la tête 96 de la pipette équipée avec 250 pi conseils pour aspirer PBS dans les puits jusqu&#39;à 10 pi. Perméabiliser les membranes cellulaires pour faciliter la liaison à des cibles intracellulaires avec le tampon de perméabilisation (0,1% de Triton-X 100) anticorps. Distribuer tampon de perméabilisation (100 ul) dans chaque puits des plaques avant de revenir à la deuxième magasin de stockage de l&#39;empileur de microplaques pendant une incubation de 15 min à température ambiante (RT). </li><li> Retirer le tampon de perméabilisation et perform lavage de la plaque avec du PBS (deux fois), comme décrit précédemment à l&#39;étape 1.13. </li><li> Après la dernière étape de lavage, éliminer le tampon PBS et dispense 100 pi de tampon de blocage contenant 1% de sérum de cheval et 0,1% de Tween 20 dans du PBS dans tous les microplaques avant de les retourner au magasin de plaques pendant 1 heure d&#39;incubation à la température ambiante. </li><li> Utilisez deux anticorps primaires pour immunomarquage: un anticorps anti-souris BACS polyclonaux de lapin, pour la détection de SNAP-25 et un anticorps monoclonal de souris pleine longueur anti-III anticorps de la tubuline pour la détection de neurones (voir Matériel et équipement). Après 60 min d&#39;incubation, éliminer le tampon de blocage et dispenser 50 pi de 4ug / ml d&#39;anticorps BACS et 0,5 pg / ml de III-tubuline dans un tampon de blocage dans les plaques. </li><li> Incuber pendant 1 heure à la température ambiante éliminer les anticorps primaires et laver trois fois avec 100 ul de PBS contenant 0,05% de Tween (PBST). </li><li> Utilisation d&#39;une IgG anti-souris marqué avec Alexa Fluor 647 de visualiser le -III tubuline et anti-IgG de lapin marqués avec Alexa FLuor 568 pour visualiser les anticorps BACS. Préparer les anticorps en tant que 2 ug / ml de la dilution dans du tampon de blocage et distribuer 50 pi du mélange dans chaque puits. REMARQUE: Les anticorps secondaires sélectionnés pour immunomarquage sont marqués avec des fluorophores différents pour permettre la détection de leur lumière fluorescente émise à des longueurs d&#39;onde distinctes en utilisant différents canaux à l&#39;intérieur du détecteur de l&#39;imageur à haute contenu. </li><li> Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer les anticorps secondaires et laver 3 fois avec 100 pi de PBST. </li><li> Après le lavage final, ajouter 100 ul de PBS contenant du colorant Hoechst (32 uM) pour colorer l&#39;ADN pour la détection des noyaux. </li><li> Sceller les plaques avec un film imperméable lumière pour protéger les fluorophores de photoblanchiment. Les plaques peuvent être conservées à 4 &#160; ° C pendant plusieurs semaines sans perte significative de signaux. </li></ol> 3. Imaging REMARQUE: Effectuer l&#39;acquisition d&#39;images à l&#39;aide de haut contenu Imaging Syssystème (Voir matériel et équipement). <ol><li> Spécification de haute teneur Définitions Imager: <ol><li> Sélectionnez le type de plaque, mise en page, le nombre de champs, objectif: Greiner u clair, le format 96 puits, 16, respectivement 20X eau. </li><li> Sélectionnez les canaux: noyau excitation EX: 405 nm comme canal 4; cytoplasme EX: 644 nm comme canal 2; antigène spécifique canal d&#39;anticorps EX: 561 nm comme canal 3 et Configurer la puissance d&#39;excitation de chaque laser, expérience d&#39;installation comme deux expositions, exposition 1 avec une excitation à 644 nm, exposition 2 avec deux excitations à 405 nm et 561 nm. Sélectionnez binning comme Bin2. </li><li> Utilisez les puits de contrôle élevés pour l&#39;optimisation de l&#39;exposition avec une intensité maximale SNAP-25 canaux et puits de faible contrôle de l&#39;intensité minimale. </li><li> Réglez l&#39;exposition, de sorte que l&#39;intensité de chaque canal est d&#39;environ la moitié du niveau de saturation (2000-2500 unités relatives). </li><li> Identifier le plan optimal de Z sur le canal de masque de cellule à l&#39;aide delta script de correction. Voir Figure 5 pour les résultats après immunomarquage et d&#39;imagerie. Exporter des données vers le serveur où le logiciel d&#39;analyse d&#39;image réside. </li></ol></li></ol> 4. Analyse d&#39;image (Figure 6) REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent l&#39;application des algorithmes logiciels Columbus. <ol><li> Sélectionnez un algorithme approprié pour segmenter les objets primaires (noyaux). Si nécessaire, ajuster les seuils de fond et les paramètres de contraste. Le logiciel Columbus propose 4 méthodes de détection des noyaux. Sélectionnez la méthode que les noyaux des segments avec précision par une inspection visuelle noyaux segmentés (en F igure méthode 6a M est sélectionné). </li><li> Sélectionnez l&#39;algorithme de neurites (CSIRO Neurites Analyse 2) de segmenter les neurites Si nécessaire, ajuster les paramètres de seuil de fond et de contraste pour enlever fond. Voir Figure 6b pour les paramètres utilisés pour détecter les neurites. </li><li> Identifier les régions de neurites (segments de neurites) de based sur des objets secondaires (neurites) en utilisant une extension de pixel de -3 de la tubuline β-canal III (Alexa farine 640) comme masque (Figure 6c). </li><li> Calculer l&#39;intensité des canaux de signaux (SNAP-25, (568) Alexa farine pour la région des neurites et le canal de la tubuline β-III (Figure 6d et 6e). </li><li> Sélectionnez les paramètres souhaités pour l&#39;exportation, telles que la longueur des neurites, des intensités moyennes de SNAP-25, la tubuline β-III, le nombre de noyaux, numéro de segment neurites, etc. (figure 6f). </li><li> plaques de transfert de gerbeurs de plaques à l&#39;aide du robot et la charge dans le Haut-Imager contenu pour l&#39;acquisition de l&#39;image. </li></ol> 5. Analyse des données: Pour évaluer la robustesse de l&#39;essai conçu, calculer les paramètres suivants de l&#39;expérience en fonction de plaque. <ol><li> Signal (S) à fond (B): S / B = intensité du contrôle du signal haute moyenne) / moyenne intensité de faible contrôle du signal </li> &lt;li&gt; coefficient de variation (CV) de signal et de fond (pour mesurer l&#39;uniformité du signal spécifique): CV = (écart-type (SD) / moyenne de l&#39;échantillon) * 100 (%), pour déterminer la variabilité dans la manipulation de liquides, réactifs, etc. </li><li> Signal to Noise: S = (intensité de signal de dire - l&#39;intensité de faible contrôle de signal moyenne) / SD de faible contrôle <ol><li> Calculer le facteur Z &#39;avec ivresse de la moitié d&#39;une plaque de 96 puits et une intoxication maquette de l&#39;autre moitié. Z &#39;= 1 - 3 * (SD de contrôle de signal haute + SD de faible contrôle du signal) / (moyenne de contrôle de signal haute - moyenne faible contrôle de signal). Pour une analyse plus approfondie des données de dépistage, de normaliser certains des paramètres premières primaires sur une base de plaque pour permettre la comparaison entre les plaques et entre les différents jours d&#39;expériences. </li></ol></li><li> Pour cent de clivage, ce qui reflète la réduction du signal associé à la longueur totale de SNAP-25 détectée par un anticorps spécifique (BACS): Clivage% = 100% * (mean intensité de contrôle de signal haute - l&#39;intensité de l&#39;échantillon) intensité de contrôle de signal de haute / moyenne. </li><li> Pour cent de l&#39;inhibition de clivage:% d&#39;inhibition = 100% * (intensité de l&#39;échantillon - intensité de faible contrôle de signal moyenne) / (intensité de commande de signal haute moyenne - faible intensité de contrôle de signal moyenne). </li></ol>

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Krishna P Kota is an employee of Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, that produces instruments and software used in this manuscript. The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the U.S. Department of Health and Human Services, the U.S. Department of Defense, the U.S. Department of the Army, or the institutions and companies affiliated with the authors.

La puissance élevée de neurotoxines botuliques et la facilité relative de leur armement a abouti à leur classification dans la catégorie A (priorité) les agents de bioterrorisme par les US Centers for Disease Control and Prevention. Malheureusement, il n&#39;y a pas approuvé par la FDA thérapeutiques pour contrer BoNT intoxication après la toxine a été intériorisée par les neurones moteurs. Tout mécanisme druggable qui favorise la récupération neuronale de BoNT intoxication pourrait conduire à l&#39;él...

La bactérie Clostridium botulinum produit une neurotoxine botulique, l&#39;une des toxines biologiques les plus puissants connus à l&#39;homme 1. Il ya 7 sérotypes distincts de neurotoxines botuliques (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induire une paralysie à la jonction neuromusculaire due à la protéolyse complexe SNARE 2,3. SNARE protéolyse empêche neurotransmetteur vésicule-membrane fusion et donc blocs neurotransmetteur exocytose 4. La cible SNARE spécifique dépend du sérotype BoNT notamment impliqué dans le processus d&#39;intoxication. BoNT / A et BoNT / E clivent la SNAP-25 alors que BoNT / C clive les deux SNAP-25 et syntaxine 5. Le sérotypes restants synaptobrévine Cleave (appelé aussi associée à la vésicule protéine membranaire (VAMP). BoNT / A a été choisi pour le développement de tests car il est responsable d&#39;une forte proportion de botulisme d&#39;origine naturelle et a la plus longue durée d&#39;action 6. Développement de la petite molécule thérapeutique contre BoNT / A est un objectif majeur pournotre programme de découverte de médicaments et a utilisé des méthodes à base de cibles traditionnelles pour identifier des inhibiteurs place protéolytiques actives 7, 8-10. Cependant, la création d&#39;inhibiteurs de site actif avec une activité à large spectre contre plusieurs sérotypes et post-exposition efficacité sera probablement difficile. Nous avons donc mis en place une approche novatrice, phénotypique découverte de médicaments qui utilise BoNT SNAP-25 clivage comme critère d&#39;évaluation fonctionnelle pour identifier les petites molécules qui peuvent bloquer BoNT médiation intoxication des neurones moteurs. SNAP-25 est nécessaire pour la libération de neurotransmetteurs, comme la dégradation de SNAP-25 est un facteur prédictif de la paralysie et de la létalité in vivo. Par exemple, le criblage cellulaire pourrait conduire à la découverte de nouveaux modulateurs de facteurs cellulaires responsables de l&#39;inactivation de la toxine ou l&#39;inhibition des voies de toxines dans les cellules ciblées. Un facteur important dans le développement de tests phénotypiques est la sélection de modèles biologiques physiologiquement pertinents. We et d&#39;autres ont décrit la souris souches embryonnaires (ES) motoneurones dérivés de cellules qui récapitulent le caractère immunologique de neurones moteurs primaires, y compris l&#39;expression de SNAP-25 11- 13. Fait important, ces systèmes cellulaires sont très sensibles à la BoNT / A et démontrent l&#39;intoxication clivage dépendant de la dose de SNAP-25 en réponse à des concentrations de toxine 11,12 croissant. Les neurones moteurs différenciés sont également produites en quantités suffisantes pour l&#39;analyse comparative de la plaque à haut débit et a permis la conception d&#39;un ensemble de tests cellulaires. Le test phénotypique est une méthode d&#39;immunofluorescence utilisant deux anticorps distincts à quantifier clivage de pleine longueur exprimé de manière endogène SNAP-25 au cours de la BoNT / A ivresse de la culture souris du motoneurone. Un terminal carboxyle de BoNT / A (BACS) de clivage anticorps qui reconnaît sensible seulement longueur SNAP-25 permet l&#39;évaluation de la BoNT / A à médiation par protéolyse de SNAP-25expression dans le moteur de la souris 10 neurones. Un schéma de principe du dosage du HCl est représenté sur la figure 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:280px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Botulinum neurotoxin A&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;">No catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microtitre plates</td>
			<td style="width:180px;">Greiner&#160;</td>
			<td style="width:119px;">655946</td>
			<td style="width:280px;">Poly-D-Lysine 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BACs antibody</td>
			<td style="width:180px;">Lampire Biological</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microchem</td>
			<td style="width:180px;">National&#160;</td>
			<td style="width:119px;">0255</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Methanol</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-20</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Horse serum</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16050</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PE JANUS MDT Mini Automated Workstation</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">AJMDT01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opera</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td>OP-QEHS-01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BIII tubulin antibody</td>
			<td style="width:180px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">BAM1195</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween 20</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342dye&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">3570</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antimouse IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21236</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Anti rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10042</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Columbus Image analysis software</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 2.4</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Spotfire</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 5.5</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Clorox bleach</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18-861-284</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PlateStack</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high content imaging assay for identification of botulinum neurotoxin inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Les données de contrôle hautes et basses créés deux populations distinctes de la différence de deux valeurs médianes supérieures à trois écarts-types (figure 7A). Le but du processus de sélection est de trouver des composés sein de la population de l&#39;échantillon avec des valeurs plus proches de la population de contrôle positif, en supposant une distribution normale au sein de la population de l&#39;échantillon (figure 7B, (i)). Les points de données qui sont 3 écart...

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A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Une teneur élevée test d&#39;imagerie pour l&#39;identification des inhibiteurs de la neurotoxine botulique

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

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Neuroscience

8.5K vues.  Perkin Elmer Inc.. Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

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An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

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Neurosciences

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Haute résolution magnétique fonctionnelle Méthodes d&#39;imagerie par résonance mésencéphale humain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imagerie fonctionnelle du cortex auditif chez chats adultes à l&#39;aide de haut-champ IRMf

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

L&#39;isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Haute résolution<em&gt; In Vivo</em&gt; Protocole de segmentation manuelle pour les sous-zones de l&#39;hippocampe humain Utilisation 3T imagerie par résonance magnétique

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Parenchymateuse, vasculaire et métabolique haute fréquence non-invasive par ultrasons et Photoacoustique Rat imagerie cérébrale profonde

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Haute résolution structurelle Imagerie par résonance magnétique de la sous-cortex humain<I&gt; In Vivo</I&gt; Et Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Analyse de haut-débit du comportement locomoteur dans le dosage de l’île de drosophile

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Développement de dosage pour une Quantification contenue élevée de Formation globale de protéine mutante Sod1 dans les cellules vivantes

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.