This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

Tüm işlemler Federal Almanya Cumhuriyeti tarafından verilen hayvan deneyleri için kurallarına uygun olarak yürütülmüştür. NOT: retinal doku bu prosedürün uzun aşamalarında oksijen yoksun olacağı için, tüm adımları olabildiğince hızlı yapılmalıdır. Fareler koyu adapte diseksiyon önce en az 3 saat olmalıdır. Retina, hazırlama adaptasyona önlemek ve dilimleme sönük kızıl ışık altında gerçekleştirilmelidir. Medya ve Diğer Kimyasallar 1. Hazırlık <ol><li> Ames Orta 6 hazırlayın. Diseksiyon sonra, her zaman Ames &#39;Orta retina dokusu batırmayın. <ol><li> Ames Ortama 2.2 g ve damıtılmış su, 250 ml 298 mg HEPES içinde çözülür. HEPES konsantrasyonu 5 mM olacaktır. Tüm parçacıkların çözünene kadar hafifçe karıştırın. </li><li> karbojen, oda sıcaklığında kabarcık Ames Orta (% 95 oksijen,% 5 araçen az 5 dakika boyunca bon dioksit). çözümün bir cam Pasteur pipeti ile Tedarik carbogen. Gaz regülatör çıkışına uygun boru aracılığıyla Pasteur pipeti bağlayın. </li><li> çözeltiye 475 mg sodyum-bikarbonat ekleyin. köpüren sonra bikarbonat eklenmesi kalsiyum karbonat çökmesini önler. </li></ol></li><li> Düşük jelleşme sıcaklığı agaroz hazırlayın. Agaroz vibratome kesit sırasında retina dokusunun gömmek için gereklidir. <ol><li> 9 mi Ames Ortamda 180 mg agaroz ve damıtılmış su, 1 ml içinde çözülür. tüm katılar çözülene kadar yavaşça agaroz çözeltisi ısıtmak için bir mikrodalga kullanarak. 5 Isı - 10 sn aralıklarla taşmasını önlemek için. Çözelti berrak ve saydam olmalıdır. </li><li> Mağaza prosedür süresince 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde agaroz eritilir. </li></ol></li></ol> 2. Vibratome kurma Not: tüm kesit ile gerçekleştirilmiştirVibratome Malzeme tabloda listelenmiştir. Verilen ayarlar yalnızca vibratome bu tür bakın. Nöral doku vibratome kesit ilgili daha fazla ayrıntı için 7 başvurmak bakınız. <ol><li> bıçak tutucu içine vibratome enjektör bıçağı yerleştirin. </li><li> &quot;Vibrocheck&quot; cihazı ile bıçak dikey sapmayı ölçün. o kesim düzlemine paralel olana kadar bıçak yatırmak için bıçak tutucu ayar vidasını kullanın. bıçağın gerçek konumlama bölümü yüzeyi üzerinde jaluzi etkilerini önlemek için ve yüzeyi üzerinde yaşayan hücreleri içeren düz bölümü üretilmesi için gereklidir. </li><li> Aşağıdaki ayarlara vibratome ayarlayın: genlik, 1.00; hız, 0.20; kalınlık, 180-200 um. </li></ol> Fare Retina 3. Diseksiyon <ol><li> hava geçirmez bir kapta yaklaşık 1 ml izofluran buharlaşma yoluyla yetişkin C57BL / 6 fare uyuşturan. Anestezi işlemi tamamlandığında, servikal dislokasyon ile hayvan euthanize.Fare, aksi takdirde dilim kalitesi bozulacaktır, daha eski 3 ay olmamalıdır. </li><li> göz altında kavisli bir forseps koyarak göz topu çıkarın. Yavaşça optik sinir gösterecektir göz topu yukarı kaldırarak. Bir bahar makas ile optik siniri kesip ve 2 ml Ames Orta içeren 35 mm petri göz topu aktarın. </li><li> Stereo mikroskop sahnede tüm sonraki adımları uygulayın. Aşağıdaki prosedürler (- 3.9 3.4 adım) için en uygun görsel kontrol sağlayan bir değere büyütme ayarlayın. </li><li> sivri forseps ile sklera veya 20 G iğne geçiş de kornea delinme. Bu adım sırasında, başka bir forseps ile göz topu sabitleyin. delme cihazı ile retinaya zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> Adım 3.3 yapılan küçük deliğe yaylı makas yerleştirin ve korneanın etrafında bir daire kesip. keserken Yine, forseps ile göz topu sabitleyin. c amacıyla yüzeye çok yakın değil kesi tutunretina içine ut. </li><li> Dikkatle forseps ile kornea, lens, vitreus cismin çıkarılması. vitreus gözün arka kısmına sadece ince şeffaf bir tabaka ihtiva eder. Bununla birlikte, camsı cisim tamamen kaldırılır kesit vibratome için gereklidir. </li><li> Petri kabı, bir aşağı retina üzerine delik bakar bir şekilde göz yuvasını yerleştirin. açıklığın jantının skleral doku, sadece oluşmalıdır. Dairesel kesim (adım 3.4) Göz yuvası ekvatora çok yakın yapılmış ise, retina dokusu da kesi mevcut yakın olacaktır. Adım 3.8 retinayı zarar vermemeye sonra dikkatli olun. </li><li> forseps ile sklerasına tut ve dikkatli bir şekilde birbirinden doku gözyaşı. Aşama sırasında retina yırtılmasına değil esastır. Gerekirse, forseps ile doku skleral kısmını steadying ve özenle diğer forseps ile retina soyularak ora serrata retina ayırın. forseps kapalı tutun; yeniden ele asladokuya beri forseps ile tina çok yumuşak ve yolu hemen verecektir. NOT: Bu aşamada, retina ve Göz yuvası geri kalanı sadece optik sinir başında bağlanacaktır. </li><li> yaylı makas ile optik sinir başında eki sitesini kesin. Retina artık serbestçe Ames Ortama doku tek parça olarak kayan olmalıdır. </li><li> pozisyon içine işlemek için, forseps ile kenarları boyunca retina tutarak kavisli bir neşter bıçak kullanarak yaklaşık 23 mm 6 küçük dikdörtgenler - 4 içine retina kesti. dikdörtgenler içinde retina dokusunun sıkışmaması. retina, çok uzak olmayan çevre orta kesimlerinde parçalara ayırın. </li><li> 35 mm plastik petri büyük çaplı plastik bir Pasteur pipeti ile Retinal parçalar, transfer alt olan 1 mm den daha az ızgara boyutu olan bir gözlü yapı ile ikame edilmiştir. Bir bardak ya da Erlenin üst üçte içinde Petri kabı düzeltmek ve Ames Orta met retina parçaları daldırınkarbojen bbled. </li></ol> Agaroz Retina Adet 4. gömülmesi <ol><li> Ames Orta bazı ile birlikte 35 mm plastik Petri kabı içine 3 retina adet - dikkatle 2 transfer. Transfer için büyük çaplı plastik Pasteur pipet kullanın en uygundur. Bu adımda, Retinal parçalar tam yönelimi önemli değildir. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti kalan Ames Orta mümkün olduğu kadar çıkarın. En kısa sürede sıvı kaldırıldı olarak adım 4.3 ile devam edin. retinal doku kuru izin vermeyin. </li><li> Hemen agaroz eritilir, 2 ml (37 ° C) Retinal parçalar içermektedir. Adım 3.10 belirtilen büyüklüğü göz önüne alındığında, parçalar agaroz içinde kıvrılıp olmayacaktır. </li><li> Sıvı agaroz içinde yavaşça petri alt retina parçaları itin. Ganglion hücre tabakası aşağı dönük olmalıdır. Tam konumun yargı için bir stereo mikroskop kullanın. Konumlandırma için, retina pi koluKüçük bir spatula ile eces. Agaroz hızla katılaşır çünkü mümkün olduğunca hızlı ve hassas retina yerleştirin. <ol><li> Retinal parçalar, cam çanak tabanına paralel düzenlemek; Aksi takdirde bölümler teğet veya eğik olacaktır. Bireysel parçalar birbirine temas etmemelidir, ama aynı zamanda çok uzak olmamalı. Aynı yatay seviyede retina adet veya daha az yer çalışın. </li></ol></li><li> en az 2 dakika süreyle - (6 ° C 4) buzdolabı içine gömülü retina adet cam petri koyun. Bu hızla daha sonraki işlemler için agaroz donacaktır. En kısa sürede agaroz polimerize olduğu gibi bir sonraki adıma geçin. </li></ol> Retina Adet 5. montajı <ol><li> Dikkatle petri retina parçaları içeren agaroz bloğu kaldırmak. camdan agaroz blok kaldırmak için bir spatula veya benzeri bir cihazı kullanın. Nedeniyle yapışkan kuvvetleri, bu oldukça zor olduğu ortaya açabilirsiniz. Ancak, kırılma önlemekagaroz blok. Oda sıcaklığında bu ve sonraki tüm adımları uygulayın. </li><li> Bir cam lamel üzerinde agaroz blok yerleştirin ve bir neşter bıçağı ile boyutunu ayarlayın. Retinal parçalar, her bir yanı üzerinde agaroz 2 mm - 1 bırakın. bloğun son boyutu yaklaşık 1.066 mm olmalıdır (10 mm&#39;lik bir blok olarak, kenar uzunluğu 6 mm yüksekliğine karşılık gelir). </li><li> bir anlık yapıştırıcı kullanarak vibratome numune tutucu agaroz blok Tutkal. alt tutucu yapıştırılmıştır ise Retinal parçalar, yüzeyi 10 mm yüksekliğinde bloğun üst ve yönlendirilmiş paralel yer almalıdır. </li><li> vibratome tampon tepsisine önce kabarmış Ames &#39;Orta dökerek hemen bloğu örtün. </li></ol> Yatay Vibratome Bölüm 6. hazırlanması <ol><li> kesit başlayın. retina dokusunun parçaları dilim görünür kadar ilk başta, elle dilimleme kalınlığı ayarlayın. Sonra adım 2.3 ayarlara değiştirin. BeriAgaroz blok başına 3 dilim - fare retina en fazla 2 olacak, sadece yaklaşık 200 mikron kalınlığındadır. </li><li> bir cam çubuk ile tampon tepsisinden bölümleri çıkarın ve 35 mm petri 2 ml Ames Orta aktarabilirsiniz. </li><li> Hemen 37 ° C (% 5 CO 2/55% O 2) bir kuluçka makinesi içinde deposu bölümleri. bölümleri çevreleyen agaroz inkübatör katı kalacak ve retina zarar vermeden bölümleri işlemek için kullanılabilir. Oda sıcaklığında oksijenli Ames &#39;Orta kıyasla ilgili bir atmosfer içinde 37 ° C&#39;de muhafaza ederken daha dilim kalitesi elde edilir. Bölümler hemen kullanılabilir ya da iyi fizyolojik sonuçlar inkübatör 4 saat kadar saklanabilir. </li><li> 6 - agaroz ve tekrar Bölüm 4 sonraki retina parçaları göm. </li></ol>

<ol>
	<li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse.">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response.">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li><li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods.">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li><li>Singer, J. H., Lassov&#225;, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li><li>Peichl, L., Gonz&#225;lez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae:+a+comparison+of+rat,+mouse,+gerbil,+and+guinea+pig.">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+and+function+of+mammalian+horizontal+cells.">Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells.</a> Development of the Retina. , (1998).</li><li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light/dark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina.">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li><li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slice+preparation+of+the+retina.">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).</li><li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses.">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li><li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+(Commentary+on+Feigenspan+&amp;+Babai).">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan &amp; Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dikey dilimleri tersine, yatay bir hücre ve amacrine hücreleri gibi radyal olarak yönlendirilmiş nöronların dendritik morfolojisi iyi korunmuştur. Bütün retina hazırlıkları ile karşılaştırıldığında, bu hücre tipleri Mikroelektronlar için kolayca erişilebilir ve her ikisi de elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri ile ele alınabilir. Burada, dış retina üzerinde duruldu; Bununla birlikte, benzer bir yaklaşım, özellikle iç retina 10 amacrine hücreler için rapo...

Görsel bilgi fotoreseptör aktivasyon dinamik bir uzay-zamansal desen olarak kodlanmıştır, ve fotoreseptör ve ikinci dereceden nöronlar arasındaki şerit sinaps görsel bilgilerin aşağı transferini belirler. Memeli retina dikey dilim hazırlama yani fotoreseptör ve bipolar hücreler arasında, ve bipolar hücre ve amacrine hücre, 1, 2, 3, 4, bazı tipleri arasında dikey yollardaki sinyal işleme incelemek için çok değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yatay kesit her sinaptik temasların ölçüde kaybına yol açan bir çok retina nöronlarının dendritik alanlarının ciddi kesme neden olur. Özellikle dış retina, yatay hücreler nedeniyle yanal yayılan genişletilmiş dendritik alanları ve akson terminali sistemlerine 5 etkilenir. dikey olarakDilim Hazırlık, yatay bir hücrenin dentritlere konik fotoreseptör terminalleri yüzlerce sinaptik girişi böylece bir kaç seyrek temas düşürülür. Bu bireysel sinaps özelliklerini incelemek için yeterli olabilir, ancak hiçbir şekilde fotoreseptör şerit sinaps senkronize aktivasyonu altında yatan sinyal işleme yetenekleri temsil tarafından öyle. Bu nedenle sağlam ve fonksiyonel yatay hücre dendritler hemen hemen tüm koni fotoreseptör sinaptik girdi bırakır yatay dilim hazırlık geliştirdi. Kesit çalışır düzlemi ideal yatay hücreleri ve amacrine hücreleri arasındaki iç nükleer tabaka ile kesme, retina yüzeyine paraleldir. Bu nedenle dış retina yatay dilim içeren oluşturulur, presinaptik sahada, postsinaptik sahada, iç ve dış bölümlerin yanı sıra sinaptik terminallerinden ve yatay hücrelerin ve bipolar hücrelerle fotoreseptörler. Bu preparat, ayrıca t uygunduro kendi dendritik alanında tüm koni fotoreseptör yatay hücre dendritler içine koordineli sinaptik girişleri araştırmak. Böylece daha iyi bir postsinaptik tepki içine fotoreseptör aktivasyon matris görsel bilgi aktarımı için çok önemlidir fotoreseptör şerit sinaps, işleyişini anlamak yararlı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ames&#39; Medium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1420</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbogen</td>
			<td style="width:125px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35-mm petri dish (plastic)</td>
			<td style="width:125px;">Nunc Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:125px;">Chemoline</td>
			<td style="width:119px;">50-1470-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:125px;">Dispensary university hospital</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome injector blade</td>
			<td style="width:125px;">Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">39053250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vibratome</td>
			<td style="width:125px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">VT1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vibrocheck</td>
			<td style="width:125px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20-gauge needles</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Curved scalpel blades</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic Pasteur pipette</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies

Dikey dilim hazırlıkları iyi yetişkin memeli retina devresi ve sinyal iletimi incelemek için kurulmuştur. Bu hazırlıklar içinde kesit düzlemi fotoreseptör ve bipolar hücreler gibi radyal yönelimli nöronların çalışma için idealdir, retina yüzeyine dik. Ancak, yatay hücreler, geniş alan amacrine hücreleri ve ganglion hücrelerinin büyük dendritik milleri bu hücrelerde belirgin azalma sinaptik aktivite bırakarak, çoğunlukla kesiliyor. ganglion hücrelerinin ve yerinden amacrine hücreleri retina bir bütün monte hazırlanmasında incelenebilir ise, yatay bir hücre ve iç nüklear tabakada bulunan amacrine hücreleri sadece zayıf bütün retina dokusu elektrotlar için erişilebilir. Maksimum erişilebilirlik ve sinaptik bütünlüğünü sağlamak için, biz fare retinanın yatay dilim hazırlık geliştirdi ve fotoreseptör ve yatay arasındaki sinaps sinyal iletimi okuduHücreler. Yatay kesit yatay hücre dendritler bozulmamış ve fonksiyonel koni sinaptik girişi için bir ön koşul olarak, elektrot hedefleme yatay hücre gövdeleri (1) kolay ve açık görsel kimlik ve genişletilmiş yatay hücre dendritik alanları (2) korunmasını sağlar. yatay dilimler arasından yatay hücrelerin karanlıkta tonik sinaptik aktivite göstermiştir, ve bunlar içe akım ve azalmış sinaptik aktivitenin bir azalma ile ışık çakmaları yanıt vermiştir. İmmünositokimyasal kanıtlar yatay hücrenin dendritik alanında hemen hemen tüm kozalakları onun çevresel dendritler ile sinaps kurmak olduğunu gösterir. Yatay dilim hazırlık nedenle de seçilmiş sinaps boyunca genişletilmiş retinal nöronların fizyolojik özelliklerini yanı sıra duyusal sinyal aktarımını ve entegrasyonu incelemek için uygundur.

<html> Fare retina yatay dilim, yatay hücre gövdeleri kolayca çokgen hücre gövdesi (Şekil 1A) çıkan çok sayıda primer dendritler ile eşsiz bir morfolojiye göre tespit edilebilir. dilim yüzeyine yakın yatay hücre gövdeleri patch-kelepçe elektrotlar için rutin erişilebilir. Kayıtları sırasında, hücreler yakın sağlam fare retina 8 (Şekil 1B) akson taşıyan yatay hücrelerin morfolojisi andıran Komplike den...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K Görüntüleme.  Friedrich-Alexander-University (FAU) Erlangen-Nürnberg.  Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil. 

Video: Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Tam kalınlıkta Yetişkin Domuz Retina Organotipik Kültür

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Uzun vadeli potansiyelize bir çok Kararlı ve tekrarlanabilir Kayıt için geliştirilmiş Hazırlık ve Hipokampal Fare Dilimleri korunması

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the clear majority have been performed on dissociated primary cells. To improve our understanding of how teleost pituitary cells, behave in a more biologically relevant environment, this protocol shows how to prepare viable brain-pituitary slices using the small freshwater fish medaka (Oryzias latipes). Making the brain-pituitary slices, pH and osmolality of all solutions were adjusted to values found in body fluids of freshwater fish living at 25 to 28 &#176;C. Following slice preparation, the protocol demonstrates how to conduct electrophysiological recordings using the perforated whole-cell patch-clamp technique. The patch-clamp technique is a powerful tool with unprecedented temporal resolution and sensitivity, allowing investigation of electrical properties from intact whole cells down to single ion channels. Perforated patch is unique in that it keeps the intracellular environment intact preventing regulatory elements in the cytosol from being diluted by the patch pipette electrode solution. In contrast, when performing traditional whole-cell recordings, it was observed that medaka pituitary cells quickly lose their ability to fire action potentials. Among the various perforation techniques available, this protocol demonstrates how to achieve perforation of the patched membrane using the fungicide Amphotericin B.

The article describes an optimized protocol for making viable brain-pituitary tissue slices, using the teleost fish medaka (Oryzias latipes), followed by electrophysiological recordings of pituitary cells using the patch-clamp technique with the perforated patch configuration.

Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...