Biz yayın maliyetlerini kapsayan bu yayını sponsor için Lonza Group Ltd müteşekkiriz. Biz SL mali destek und Kultur Wissenschaft Deutsche Infarktforschungshilfe Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung ve Thüringer Ministerium für Bildung&#39;u, teşekkür ederim.

THP-1 Makrofagların 1. Predifferentiation <ol><li> Bir CO2 içinde% 10 (h / h) fetal dana serumu (FCS) ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin / L-glutamin (PSG) ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında, THP-1 hücrelerini yetiştirmek (% 5 37 ° C) kuluçka makinesi. </li><li> Transfeksiyondan önce, hücreleri bölme ve daha önce olduğu gibi taze RPMI ortamına aktarabilirsiniz. 24 saat boyunca hücrelerin kültive edilmesi. </li><li> Tohum 1.0-1.5 x 10, 75 cm² doku kültür şişesi içine 7 hücreleri veya 2.5 x 10 7, RPMI-1640 ortam maddesi içinde bir 150-cm² doku kültür şişesi içine hücre ve% 10 (hac / hac) FCS,% 1 (hacim ekleme / 48 saat boyunca hacim) PSG,% 1 (v / v) sodyum piruvat,% 1 (h / h) esas olmayan amino asitleri, 10 ng / ml PMA ve 50 uM β-mersaptoetanol eklenir. </li></ol> Nucleofection 2. hazırlanması <ol><li> 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içine Accutase I ve ortam yerleştirin. </li><li> Şişeden bir kültür ortamı aspire ve 6 ml (75 cm² şişe) veya 12 ml (150 cm² balon) ile değiştirin bölgesininAccutase I ve hücrelerin tam ayrılması için 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. Hücreler yuvarlak bir görünüme sahip olmasını sağlamak için Accutase ben tedaviden sonra hücre morfolojisi gözlemleyin. Bazı hücreler hala bağlı gibi görünüyorsa, dikkatli bir mikropipet ile şişeyi çalkalayın ya da hafifçe dekolmanı tamamlamak için dokunun. Bu hücre canlılığı üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olacak gibi, hücre kazıyıcılar kullanmayın. 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer hücre süspansiyonu. </li><li> Accutase Ben tedavisi sırasında, aşağıdaki ortamları hazırlamak: <ol><li> Transfeksiyon ortamı hazırlayın: ek hücre kültür ortamı,% 1 (h / h) PSG ile,% 1 (h / h) esansiyel olmayan amino asitler,% 1 (v / v) sodyum piruvat ve% 5 (h / h) insan serumu (plazmid DNA), insan serumu (siRNA) veya% 20 (h / h); iki adet 12 oyuklu plakalar için, bir 6-yuvalı plaka ya da 4 ml / numune için, ya 3 ml / numunenin bir son hacim hazırlar. </li><li> Yetiştirme ortamı hazırlayın: ek bir kültür ortamı,% 1 (h / h) PSG ile,% 1 (h / h) temel olmayan amino asitler,% 1 (v / v) sodyum piruvat ve% 5 (h / h), HUinsan (siRNA için), kan ya da% 20 (plasmidi için) (h / h) insan serumu, 2.5 ng / ml PMA ve 50 uM β-mersaptoetanol; iki adet 12 oyuklu plakalar için, bir 6-yuvalı plaka ya da 4 ml / numune için, ya 3 ml / numunenin bir son hacim hazırlar. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje hücre süspansiyonu. </li><li> RPMI ortamında 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış, 1 ml aspire Accutase I ve tekrar süspansiyon hücreleri; hücre sayısını belirlemek için hücreleri saymak. NOT: hızlı otomatik hücre sayım işlemleri kullanıldığında, 2.4 ve 2.5 adımları atlanabilir ve hücreler dekolmanı Accutase I uzun süreli temastan kaçınılmalıdır şartıyla hemen sonra sayabiliriz. </li><li> Her bir numune için transfeksiyon 2.0-2.5 x 10 6 hücre ihtiva eden santrifüj tüplerine alikotları hazırlamak. </li></ol> THP-1 Makrofagların 3. Nucleofection <ol><li> Santrifüj, oda sıcaklığında 250 x g&#39;de 10 dakika boyunca her alikotları. </li><li> Nükleaz serbest plazmid DNA veya siRNA seyreltin, su veya uygun bir tampon. Mümkün olduğu kadar küçük plazmid DNA veya siRNA&#39;nın gerekli hacmi tutun. </li><li> Her bir transfeksiyon için plazmid DNA siRNA 1 ug veya 0.5 ug ya da sadece bir kez Nucleofector küvet hazırlayın. </li><li> Her seferinde bir transfeksiyon gerçekleştirin. Hücre bölenin aspire süpernatant. </li><li> DNA / siRNA ve Nucleofector çözeltisi 100 ul toplam hacim elde etmek üzere çözelti içinde topak Nucleofector süspansiyon hücreleri. En az saf Nucleofector çözeltisine maruz kalma süresi 15 dakika tutmak ve aşmamasını maruz kalma süresi sağlamak. </li><li> Hafifçe vurmak suretiyle Nucleofector küvet içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ve DNA / siRNA karıştırın. </li><li> Nucleofector 2b Aygıt program-Y-001 gerçekleştirerek transfekte hücreler. </li><li> Tek kullanımlık plastik pastör pipet kullanılarak bir reaksiyon şişesine transfekte hücrelerin aktarın. </li><li> Hemen hazırlanan transfeksiyon ortamı 500 ul ilave edin. </li><li> Tekrar 3.4 Her transfeksiyon numune için 3.9 için yineleyin. </li></ol><ol><li> Transfekte edilmiş hücreler, 6-ya da 12-kuyucuklu plakalar ya hazırlayın. Pipet 2,5, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna transfeksiyon ortamı (1 de / transfeksiyon) ml ya da 12 oyuklu plakanın her oyuğuna transfeksiyon aracı 1.75 ml (2 kuyu / transfeksiyon). </li><li> Bir mikropipet ile iyice hücre süspansiyonları karıştırın. </li><li> Hazırlanan kuyu içine transfekte edilmiş hücrelerin aktarın (bir ya da 12 oyuklu bir plaka içerisinde bir 6 yuvalı plaka ya da iki). </li><li> Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde (% 5 CO2, 37 ° C) 4 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Mikroskobik hücrelerin yatıştırıldı edin. NOT: hücrelerin çoğunluğu yine yapışık olmalıdır. Zaman zaman, 1 saat ile kuluçka süresinin uzatılması yeterli yeni yapışma durumunda yapışan hücrelerin sayısını artırır. </li><li> Dikkatlice bir mikropipet ile transfeksiyon orta aspirat ve yetiştirme ortamında eşit miktarda değiştirin. Her seferinde sadece bir aspire de. </li> &lt;li&gt; plazmid veya siRNA&#39;nın (24-72 saat) maksimum etki için gerekli süre boyunca inkübe hücreleri. Inkübasyon süreleri 48 saat aşarsanız, 48 saat sonra orta yerine. </li><li> Efektör ek tedavisi için (örneğin,., Sitokinler, agonistler, antagonistler ve inhibitörler), PMA olmadan serum içermeyen ortamda ve β-merkaptoetanol kullanın. Saat plazmid veya siRNA&#39;nın maksimal etkinin süresi ile bir effektör İnkübasyon süresinin sonunda, orta ve buna göre efektör eklenmesi değişikliği planı. Daha uzun, 24 saat boyunca serum serbest koşullar altında hücreleri korumak etmeyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer.">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li><li>Mae&#223;, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages.">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li><li>Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+C-X-C+chemokine+receptor+type+7+(CXCR7)+switches+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+and+phagocytic+activity+in+macrophages+linked+to+atherosclerosis.">Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis.</a> J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation.">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li><li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47,+a+lipid+cargo+protein+involved+in+macrophage+triglyceride+metabolism.">TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).</li><li>Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+proteins+visualized+by+freeze-fracture+immuno-electron+microscopy:+A+new+tool+in+cellular+and+molecular+medicine.">GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine.</a> J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).</li><li>Guh, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators.">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates:+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b.">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li></ol>

Bu video-makale için yayın masrafları Lonza Group Ltd tarafından sponsor

Burada özetlenen protokolü genellikle geçiştirilmesi için oldukça zor THP-1 makrofaj geçiştirilmesi için güvenilir ve verimli bir yol sunuyor. Transfeksiyon hücre canlılık önemli bir azalma olmadan siRNA için% 90 ve üzerinde transfeksiyon verimliliği ile elde edilebilir. Plazmidler için verimlilikleri genellikle elde edilebilir% 70 civarında kendi boyutu ancak transfeksiyon verimliliği nedeniyle daha az olabilir. SiRNA aracılı Nakavt verimi, uygulanan siRNA bağlı olarak 80-90% ulaşabilir. Bu protokolün önemli bir avantajı, hücre farklılaşması müdahale etmemesidir. Transfeksiyondan sonra hücreler yine 12 farklılaşma madde PMA (1B ve Şekil 4 Şekil 1A) karşı normal cevap veremez. Bu da transfeksiyon a sonra ekimi için seçilen ortama kuvvetle bağlıdır, ancak bu IL10 veya LPS gibi sitokin uyaranlar tarafından eklenmesi hücresel kutuplaşma / IFNy, etkilenmez 12&#39;dirŞekil 4&#39;te gösterilen s. Özel gereksinimlere protokolünü uyarlamak için modifiye edilebilir prosedür dahilinde çeşitli seçenekler vardır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, hücreler, transfeksiyondan sonra, seçilen kültür ortamına bağlı olarak aynı IL10 uyarana farklı şekilde etkiler. Bu ortam kompozisyon, hücresel davranışı üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğunu gösterir. Çeşitli deneysel uyarıcılar için farklı olabilir ortam tarafından uygulanan etki olarak, bu optimum ortamı değişebilir ve bu nedenle bağımsız olarak farklı deneyler için vasatın uygun olduğunu doğrulamak için bir ihtiyaç olduğu mümkündür. Ancak THP-1 hücrelerinin kültivasyonu için kullanılan varsayılan ortamı olan RPMI-1640 ortamı, hücre canlılığını önemli bir kayıp gözlendi olarak transfeksiyondan sonra kültivasyonu için kötü uygun olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca protokol, aynı zamanda önceden PMA-kaynaklı farklılaşma olmadan, THP-1 monosit uygulanabilir, butabii ki, işlem sırasında hücre ayrılması ihtiyacını ortadan kaldırır, fakat geri kalan bütün adımları ayarlanması gerekmez. Gerekirse, THP-1 monosit sonra ayırt edilebilir. Protokolün en kritik elemanlar ilk olarak ayrılması ve ikinci transfeksiyon için gerekli olan zaman vardır. Dekolmanı yüksek hücre canlılığını muhafaza edilmesi amacıyla, yavaşça mümkün olduğu kadar gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle Accutase Ben üzerinde bu tür tripsinizasyon oldukça agresif yöntemler ile karşılaştırmalı olarak yumuşak enzimatik dekolmanı öneririz. Lidokain gibi ya da kazıma ile işlenmesi gibi başka ayırma yöntemleri oldukça zararlı olduğu bulunmuştur ve kullanılmamalıdır. Accutase Tedaviden 30 dakika tüm hücreleri ayırmak için yeterli olmaması gerektiğini durumda doğru bu genellikle yanlış olarak depolanır ya da süresi dolmuş Accutase Ben çözümün ya da çok sayıda donma-çözülme döngüleri bir göstergesidir. Bu -20 ° C&#39;de Accutase I az miktar depolayarak iyi sonuçlar elde ettikC dondurma-çözme döngüsü sayısını azaltmak için. Yetersiz dekolmanı olduğu ancak zaman taze Accutase ile Accutase I değiştirmek veya 1 saat inkübasyon süresi kadar artar ya. Ilave nazik dokunarak veya dekolmanı yardımcı olabilir şişesi veya plaka durulama. Transfeksiyon için gerekli süre konusunda saf Nucleofector çözüm hücrelerin maruz kalma süresi mümkün olduğunca kısa olmalıdır ve böylece hücre canlılığı yüksek etki var ve gelmiştir. Bunu başarmak için en iyi yolu bir süre paralel (adım 2,10-2,15) çok değil transfeksiyonlardan her transfeksiyonunu yapmaktır. Demonte verimliliği düşük ise, bu genellikle düşük transfeksiyon verimliliği neden değil, ama bu kolayca akım sitometri veya floresan mikroskopi kullanılarak doğrulandı ve floresan siRNA&#39;nın veya GFP kodlama plazmid etiketli olabilir. Çoğunlukla nedeni verimsiz bir SiRNA veya plazmid DNA. Bu koşullar altında (2-3 ug kadar) siRNA miktarını artırmak için değerlendirilmesi gereken veyaDNA (kadar 1-2 mg) veya varsa farklı bir SiRNA veya ifade vektörü kullanın. Seçenek olarak ise, tatmin edici sonuçlar, aynı hedefe yöneltilmiş birçok farklı siRNA&#39;lar bir havuz kullanılarak elde edilebilir. Ayrıca, süre ders deneyler doğru genellikle transfeksiyonundan sonra 24 ila 72 saat sonra ulaşılır maksimal etkisi dönemini belirlemek için gerekli olabilir. Yanı sıra transfeksiyon, elektroporasyon ile memeli hücrelerin transfeksiyonu için iyi bilinen teknikleri daha vardır. Sık uygulanan sistemler, yük nükleik asit ile kompleks oluşturulmasına ve daha sonra hücrelere taşınmasını kolaylaştırmak için kimyasal nakil maddelerdir. En sık kullanılan ayıraçlar farklı lipit türlere dayanmaktadır veya katyonik polimerlerin 3 bir dizi seçilebilir. Her iki farklı bir seçim yaklaşımlar için ticari olarak temin edilebilir. Bu transfeksiyon reaktifler bunlar genellikle avantajı sunuyoruzBöylece dekolmanı için gerekliliğini ortadan kaldıran, çok zaman gerektirir ve de yapışık hücreleri ile işe yaramazsa, kullanımı kolay. Ne yazık ki, makrofajlar onlar in vitro belirgin çoğalırlar ve yabancı sitozolik DNA&#39;ya 13-15 yöneltilen savunma mekanizmalarını sahip olmayan yok gibi, bu yöntemlerle geçiştirilmesi için oldukça zordur. Bu durumda, kimyasal nakil teknikler sıklıkla hücre canlılığının bir ciddi azalma ile sonuçlanır. Geçmişte başarıyla makrofajlara siRNA aktarabilir kimyasal nakil maddeleri, ancak akış sitometrik (Şekil 2A) ve floresan mikroskobik olarak (Şekil 2B) analizleri, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, ancak bunlar hücreleri içindeki siRNA ile aynı homojen dağılımı elde etmek için başarısız göstermektedir nucleofection ile elde edilmiştir. Aslında, akış sitometrik veriler, transfekte edilmiş hücrelerin iki popülasyon meydana gelmesi Nucleofecti sonra hücreler olarak benzer floresan ile ilk önce bir nüfus olduğunuüzerinde tespit edilir ve ikinci daha yoğun floresan bir nüfus bulunmaktadır. Kesin onay hala gereklidir ancak ilk popülasyon ikinci popülasyon muhtemelen çok parlak aglomeratlar ile hücrelerin tekabül ederken, sitoplazmada içinde floresan siRNA homojen bir dağılımını gösteren bu hücreler ile aynı olan floresan mikroskopi olduğunu varsayalım. Şekil 2A&#39;da gösterilen bir akış sitometrik veriler göstermektedir ki, alternatif lipofeksiyon yaklaşıma göre, hücre başına daha az siRNA Nucleofection sonuçlanır. Bununla birlikte Şekil 3&#39;te veri nucleofection ile bu buluşa katılan siRNA bile nispeten küçük miktarı zaten, hedef genin 80-90% demonte için yeterli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, kimyasal transfeksiyondan sonra ikinci popülasyonuna ile bu buluşa katılan siRNA ek miktarı çok fazla ve muhtemelen daha da artmasına, yok etme etkisi için daha arzu edilmeyen yan etkilere neden olduğu, böylece daha olasıdır. Bunun dışındaBu SiRNA molekülleri olası değil fonksiyonel veya serbest siRNA&#39;nın moleküllere göre en azından daha az verimli ve hedef etkilerini kapalı neden olabilir hücre içi aglomeralarının oluşumu zaten kendi içinde istenmeyen bir durumdur. Ayrıca bu aglomeraların gerçek doğası henüz belli değil. Bu noktalar, siRNA hücreler tarafından ancak endozomlar başarısız oldu ve siRNA tutulacağı ve bu yüzden etkisiz kalır, daha sonra ikinci serbest olduğunu gösteren endozomlar temsil mümkündür. Alternatif olarak, hücre lekeleri oluşur topaklar olabilir. Kimyasal transfeksiyonunun Fonksiyonel değerlendirmeler nedenle devirme verimliliği üzerinde hiçbir kesin ifadeler hala iki ayrı nüfus varlığı bu tüm sonuçlar, hem nüfus ortalamasını tarif demektir zaten elverişsiz olduğu, henüz yapılabilir, bekleyen, bu yüzden uyuşmuyor ya popülasyonlarının. Bu nedenle Nucleofection üstün bir yaklaşımdır. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; Bununla birlikte, aynı zamanda burada tarif edilen transfeksiyon prosedüre sınırlamalar vardır. Hücreler Nucleofection yapışan hücreler, hücrelere ilave bir stres faktörü sunduğu, müstakil gereken karışımın içinde olmak zorunda beri. Ayrıca tüm protokol de oldukça zaman alıcı. Deney başına 10 - Transfeksiyonlar aynı anda gerçekleştirilir, ancak hücre hasarı önlemek için hızlı bir şekilde yapılması gereken olabilir ve bu, numune sayısı 8 ile sınırlıdır. Böylece, bu protokol, yüksek veri akışı tarama projeler için uygun değildir. Yüksek hacimli uygulamalar için farklı Nucleofector sistemleri mevcuttur. Birincisi, 16 de şerit biçimini sunan 4D-Nucleofector sistemi vardır. Daha büyük verim için, 96 gözlü Servisi sistemi ve 384 de HT Nucleofector sistemi mevcuttur. Bu şekilde yeni sistemler yerine alüminyum iletken polimer elektrot ve bu nedenle elektrik koşullarda, yani programları ve kompozisyonunun çalışma Ancak olarakNucleofector çözeltisi TV&#39;nizi yerleştirmeden, bizim, bu sistemlerin protokol aktarılabilir halinde tespit edilmesi gerekir, buna göre değişti. Ancak, bu sınırlamalara rağmen protokolü bütün diğer viral olmayan yaklaşımların üstün THP-1 hücrelerinin güvenilir ve etkili bir transfeksiyonunu verim vermez burada sundu. Bu protokol, tüm diğer yönden birbirinden ayrılması ve normal olarak ve böylece mümkün olduğu kadar az transfeksiyon yan etkiler gösterdikleri için polarize, THP-1 hücrelerinde gen ekspresyonu değişimlerinin etkileri inceleme sağlar.

İnsan bağışıklık sisteminin hücresel bileşenleri arasında, makrofajlar, doğal immun cevabın için büyük önem taşımaktadır. Onların görevleri çeşitlidir; onlar genelde patojenlere ve nekrotik malzeme fagositozu katılan, doku homeostazında önemli bir rol oynayabilir ve düzenleyen ve bağışıklık yanıtı düzenlemek için 1 sitokinlerin çok sayıda üretmek ve salgılamak. Bu nedenle bütün olarak makrofajlar, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik süreçler koşullarda katılmaktadırlar. Nedeniyle görevlerinin çeşitliliği, makrofajlar çok heterojen ve çok yönlü hücre tipi vardır. Bu, farklı polarizasyonlar ile elde edilmektedir; dış uyaranlara makrofajlar bağlı olarak farklı fenotipleri 2 dönüşebilir. Immün yanıta makrofajlar &#39;değişkenliği ve etki onlara çok ilginç bir araştırma konusu yapmak. In vitro bir model, karmaşık metabolik ve düzenleme işlevini uygun makrofajlar aydınlatmak amacıyla Shawnee Nationaledinilmiş doğru makrofaj karışıklığını ve değişkenliği yansıtmaktadır. Hücresel bir gen ekspresyonunu değiştirmek için plazmid DNA vektörleri ya da küçük müdahale edici RNA&#39;lar (siRNA&#39;lar) ile hücrelerin transfeksiyonu gen regülasyonu ve gen işlevini hem de incelemek için, hücre biyolojisi yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir araç haline gelmiştir. Şu anda ökaryotik hücrelerin transfeksiyonu için mevcut farklı araçlar büyük bir seçim var. Bu araçlar hücrelere 3, viral vektörler, (örneğin, bir gen tabancası gibi) mekanik yöntemlerle, (nükleik asit ile kompleksler oluşturabilir polimerler veya lipitler dayanan) kimyasal yaklaşımlar uygulanmasını ve elektroporasyon yer alır. Bu yaklaşımların hepsinin avantajları ve dezavantajları vardır ve belirli bir hücre tipi ve uygulama için, bu geniş diziden en uygun seçimi zor ve zaman alıcı bir süreç olabilir. Makrofajlar hemen hemen tüm köklü transfe transfect oldukça zorduravranış yaklaşımlar büyük ölçüde makrofajlar &#39;canlılığı azaltmak ya da davranışları, yani farklılaşma ile ve özellikle polarizasyon müdahale. Bu yüzden, burada DNA düşük miktarda gerektiren optimum bir elektroporasyon yaklaşımı temsil elektroporasyon bazlı Nucleofector teknolojisi kullanılarak insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkili bir viral-olmayan protokol mevcut. Nucleofection, monositler ve makrofajlar gibi hassas hücrelere için çok uygundur. Bu protokol daha önce yayınlanmış sürümleri 4,5 bir uyarlamasıdır. Kısaca, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA), önceden siRNA veya plazmit DNA ile transfeksiyondan erken makrofajlara 48 saat boyunca insan monositleri, THP-1 ayırt etmek için kullanılır. Transfeksiyon için predifferentiated makrofajlar Accutase Ben tedavi ile enzimatik ayrılır. Transfeksiyon hücrelerin elektroporasyonu için Nucleofector 2b cihazı kullanılarak gerçekleştirilir. Transfeksiyondan sonra, farklılıkayırt edilmesi gereken şekilde bir 24-48 saat boyunca devam edilir. Son olarak, olgun transfekte edilmiş makrofaj fonksiyonel çalışmalarda bileşiklerin çeşitleri ile inkübe edilir. Bu yaklaşım, insan THP-1 monosit ve makrofajlar gibi hücre çizgilerinin transfeksiyonu için izin verir ve gecen 6-10 uygulanmıştır. En çok kimyasal nakil yaklaşımların aksine, erken makrofajlar kullanılarak Modifiye Nucleofection işlem, viral vektörlerin kullanılması veya bilinmeyen yan etkiler ile daha fazla taşıyıcı madde bileşikleri eklemek gerek kalmadan, zarar görmemiş hücre yaşayabilirliği ile kombinasyon halinde, yüksek transfeksiyon verimi elde edilir. Buna ek olarak, makrofajlar ve böylece, aşağıdaki transfeksiyon 11 engelsiz işlevsel incelemeleri sağlayan tam farklılaşması için potansiyel olarak polarizasyon saklayın. Ayrıca, nucleofection sonra uygulanan hücre kültürü ortamı şiddetle fonksiyonel çalışmalar aşağıdaki tran etkilersfection; Özellikle, polarizasyon için makrofajların kapasite uygulanan kültür ortamına bağlı olarak etkilenebilir. Hücre kültür ortamının Burada, dört farklı tipte (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 ve fare T hücresi Nucleofector ortamı) ile interlökin devreden çıkartma şartları altında test edilmiştir (İL), THP-1 10. makrofajlar kullanarak, IL10 hücre tepkisi olduğu görülmüştür Fare T hücresi Nucleofector ortamı, yukarıda sözü edilen diğer kültür ortamı ile karşılaştırıldığında kullanıldığı zaman güçlü. Bu sonuçlar, önemli ölçüde deney sonuçlarını geliştirmek şekilde tüm hücre kültürü koşullarının optimizasyonu uygun transfeksiyon başarı und daha sonra fonksiyonel çalışmalar için gerekli olduğunu göstermektedir. Makrofajlar çeşitli insan hastalıklarında rol gibi, çok daha fazla araştırma makrofaj davranışı ve makrofajlar tarafından kontrol makrofaj veya sırayla etkileyen düzenleyici mekanizmaların tanıtılması odaklanmıştır. Dolayısıyla, bu protokol geçerliliğini korumaktadırbirçok farklı araştırma alanları.

<table><tbody><tr><td>Accutase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids, nonessential</td><td>PAA</td><td>M11-003</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (15 ml)</td><td>TPP</td><td>TPP91015</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS gold)</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Human Monocyte Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VPA-1007</td><td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes, and Pasteur pipettes</td></tr><tr><td>Human serum off the clot</td><td>Lonza</td><td>C11-020</td><td></td></tr><tr><td>Isove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td><td>Lonza</td><td>CC-3211</td><td></td></tr><tr><td>Mouse T Cell Nucleofector Medium</td><td>Lonza</td><td>VZB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin / L-glutamine (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td><td>PAA</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>siRNA / plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 human leukemia monocytes</td><td>CLS</td><td>300356</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flasks (75 cm&amp;sup2;; 150 cm&amp;sup2;)</td><td>TPP</td><td>TPP90076/TPP90151</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td><td>TPP</td><td>TPP92406/TPP92012</td><td></td></tr><tr><td>Tubes (1.5 ml)</td><td>StarLab</td><td>S 1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20 with gentamycin</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

Makrofajlar, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının önemli oyuncuları olarak, doku homeostasis veya çeşitli patolojiler ile ilgili araştırma odağında bulunmaktadır. SiRNA ve plazmid DNA ile transfeksiyon onların işlevini incelemek için etkili bir araçtır, ancak makrofaj transfeksiyonunun önemsiz bir konu değildir. Ökaryotik hücrelerin transfeksiyonu için çok farklı yaklaşımlar mevcuttur, ancak az sayıda makrofaj güvenilir ve verimli transfeksiyona, ancak daha az hücre canlılığı ve sık görülen farklılaşma veya polarizasyon için azalmış yeteneği gibi ciddi bir şekilde değiştirilmiş bir hücre davranışını verir. Bu nedenle, bu şekilde transfeksiyon protokol, normal hücre davranış bağlamında siRNA etki ya da plazmid soruşturma izin ciddi yan etkilere neden olmadan makrofajlara siRNA ve plazmid DNA aktarma yeteneğine sahip olması gereklidir. Burada sunulan protokol güvenilir ve etkili bir insan THP-1 makrofajlar ve mo transfekte edilmesine yönelik bir metot sağlar;Yüksek hücre canlılığı, yüksek transfeksiyon verimlerine ve hücre davranışı üzerinde minimum etki nocytes. Bu yaklaşım nucleofection dayanmaktadır ve protokol transfeksiyondan sonra hücre aktivasyonu için maksimum yeteneği sağlamak için optimize edilmiştir. Protokol süspansiyon içinde ayrılması ve hücre sonra yapışık hücreler için yeterli olduğunu ve orta örnek sayı için, küçük için kullanılabilir. Bu yüzden, sunulan bu yöntem, makrofaj farklılaşması ve polarizasyon esnasında gen düzenleyici etkilerini araştırmak için yararlıdır. Apart alternatif bir kimyasal yönteme göre bu protokole göre transfekte makrofajlar karakterize sonuçlarını sunma, hücre davranışı üzerindeki transfeksiyonundan sonra hücre kültür ortamı seçimi etkisi de tartışıldı. Sunulan veriler, farklı deneysel ayarları için seçimi doğrulama önemini göstermektedir.

Genellikle hücre canlılığının önemli bir düşüş olmadan 90 Yukarıda% transfeksiyon oranları elde siRNA ile THP-1 makrofajlar transfeksiyonu için bu protokolü kullanarak. Şekil 1, 24 saat, bir transfekte edilmemiş karşı siRNA floresan etiketli ile transfeksiyondan sonra hücrelerin durumunu karakterize etmek için temsili verileri gösterir Nucleofection reaktifleri ile muamele edilmiş ve darbeli veya siRNA fakat transfekte edilmiş örnekleri gibi bir kültür ortamı tüm değişiklikleri dönmemiştir kontrolü. Şekil 1A hücresel morfoloji akım sitometri ölçümüne göre gösterilmektedir. . Mikroskopik görüntüleri Şekil 1B gösterildiği Şekil 1C ve 1D düşük apoptoz oranları (kontrol:% 1.5; Nucleofection:% 5.4) temsil edilir:;: etkilenmemiş hücre canlılık gösteren ve nekroz (% 3.2, kontrol Nucleofection% 2.0). Nakledilmiş THP-1 makrofaj daha olarak nekroz ve apoptoz transfekte numune için biraz daha yüksektiruntransfected hücreleri, dekolmanı artar sırasında hücre hasarı dolayısıyla olasılığı daha ayırmak zordur. Son transfeksiyon verimi Şekil 1 E&#39;deki sunulmuştur. Tüm transfekte edilmiş bir popülasyondan kontrolüne karşı kaydırılır, bu tüm hücreler flüoresans mikroskopisi görüntüleri (Şekil 2B) ile teyit edildiği transfekte olduğunu gösterir. Her ikisi de tüm hücreler sürekli hücreleri arasında yanı sıra hücre içindeki siRNA&#39;nın homojen dağılımı ile transfekte olduğunu göstermektedir sıtometrık verilerin yanı sıra floresan mikroskobik görüntüleri akar. Bu karşılaştırma için Şekiller 2A, bir çok kimyasal transfeksiyon reaktifleri aksine ve Şekil 2B, yağ bazlı bir yaklaşım kullanılarak kimyasal bir transfeksiyon maddesi için ilgili akış sitometrik veriler ve floresan mikroskopik resimleri göstermektedir. Bu rakamlar, transfekte edilmiş hücrelerin, iki farklı popülasyonlar tespit edilebileceğini göstermektedir. İlk popülasyon follo transfekte edilmiş hücrelere benzerkanat Nucleofection. Bunlar, düşük toplam floresan ve hücrelerin içinde siRNA homojen dağılımı ile karakterize edilir. Ikinci popülasyon siRNA çok parlak hücre topaklarının kaynaklanan daha şiddetli floresan ile işaretlenir. Şekil 2C&#39;de, farklılık belirleyici kontrast ile gösterildiği gibi, her iki hücre morfolojisi transfeksiyon yaklaşımlar için etkilenmez. Etkin bir şekilde benzer sonuçlar ile plazmid DNA verimi Transfeksiyonlar, örnekler için Robenek ve ark. (2009) 9 ya da Xie bakınız ark. (2006) 7. Transfeksiyondan sonra hücre kültür ortamının seçimi büyük öneme sahiptir; bu nedenle de farklı hücre kültür ortamı kıyasla test edildi. Seçilen tüm ortam, THP-1 hücrelerinin kültivasyonu için uygun olan ve sonrası Nucleofection kültivasyonu için ortam olarak uygulanabilir Lonza&#39;dan önerilerine göre seçilmiştir. 3 siRNA MEDIAT temsil Şekiled IL10RB (interlökin 10 reseptörü β zinciri) mRNA&#39;ya karşı yönlendirilmiş bir siRNA kullanılarak verimi demonte. Test edilen tüm ortam için IL10RB ekspresyonunun önemli ölçüde kontrol seviyesi yaklaşık% 10-20 (Şekil 3) indirgenmiştir. Bununla birlikte transfekte edilmiş hücreler polarizasyon için potansiyeli kültür ortamına bağlı olarak değişebilir. Spesifik olmayan kontrol siRNA veya IL10RB özgü ya siRNA ile transfekte edilmiş THP-1 makrofajlar transfeksiyondan sonra farklı ortamlarda yetiştirilen ve IL10 ile tedavi edildi. IL10-indüklenmiş gen SOCS3 mRNA düzeyine (3 sitokin sinyal baskılayıcı) sonradan ekspresyon düzeyleri RT-QPCR kullanılarak ölçüldü. Kültür ortamı arasındaki farklar SOCS3 mRNA ekspresyonunun indüksiyonu ölçüde ilgili olarak ortaya çıkmaktadır (Şekil 4), test edilen ortam fare T-hücresi Nucleofector Orta her biri için indüksiyonlar, LGM3, X-VIVO 20 ve 19.5 olmuştur IMDM [17,7-21,5 ], 11.5 [8,5-15,7], 8.0 [4,6-14,2] ve 7.2 [5,6-9,5] sırasıyla katlayın.Fare T hücresi Nucleofector ortamının refore uygulama hayati önem taşımaktadır. Buna ek olarak, tedaviden sonra da IL10 SOCS3 ifadesi üzerindeki IL10RB arasında Nakavt etkisi gözlemlenebilir farklılıklar vardı SOCS3 mRNA ekspresyon seviyeleri, 9.5 [8,8-10,3] katlanması fare T-hücresi Nucleofector ortamına düşürülmüş, 2.1 [1,1-4,1] kat LGM3 yılında, 4.8 [3,2-7,2] X-VİVO 20 ve 3.3 [2,7-3,9] katlayın IMDM&#39;de katlayın. Bu değerler sırasıyla% 49,% 18,% 60 ve% 45, en farklı ortamda SOCS3 ifade azalmalara karşılık gelmektedir. IL10RB siRNA transfeksiyonundan sonra, IL-10 ile indüklenen SOCS3 ifade azaltılması transfeksiyonu ile IL10RB başarılı infekte teyit etmektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> Işık mikroskopik, tarafından açıklanan ve akış sitometrik analizleri transfekte edilmemiş eş olarak transfekte edilmiş THP-1 makrofaj Şekil 1. karakterizasyonu. Hücrelerin karakteristik durumu etkilenmemiştirTHP-1 hücreleri, makrofajlar karşı ntrol sunulan protokole göre transfekte edildi. THP-1 makrofajlar 48 saat boyunca 10 ng / ml PMA ile farklılaşmış ve floresan etiketli (Alexa 488) spesifik olmayan kontrol siRNA ile transfekte edilmiştir. Transfeksiyondan sonra 24 saat ya da canlı hücre görüntüleri (B) alınmıştır, veya hücreler Accutase I muamele ile ayrılmış ve akış sitometrisi (A) ile analiz edilmiştir. Apoptoz ve nekroz boyama Annexin V-fikoeritrin (PE), (C) ve 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Transfeksiyon etkililiği, (E) siRNA bağlı floresan etiketi kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edilmiştir. Transfekte hücreleri (siyah) floresan sinyali kontrol sinyali (gri) karşı gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width = &quot;4in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51960 / 51960fig2highres.jpg&quot; width = &quot;400&quot; /&gt; Şekil lipofeksiyon karşı nucleofection sonra siRNA hücre içi dağılımı 2. karşılaştırılması. THP-1 hücreleri Bu protokole uygun olarak 48 saat boyunca farklılaşır, sonra da nucleofection ya da lipofeksiyon yoluyla transfekte edildi. Sunulan lipofeksiyon- sonuçları 4 siRNA&#39;nın için reaktif bir ücret oranı ile üreticinin tavsiyelerine göre Xtremegene SiRNA kiti kullanılarak elde edilmiştir: 1. Transfeksiyon hücre sonra 24 saat ya akım sitometri analizi için Accutase I ile müstakil veya canlı hücreleri ile mikroskopik değerlendirildi. Nüfus içinde (A) transfeksiyon verimi ve hücre başına siRNA dağılımı siRNA bağlı floresan etiketi kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edilmiştir, siRNA transfekte edilmiş kontrol gri renkle gösterilir, siRNA ile transfekte edilmiş numuneler siyahlıkla gösterilmiştir. (B) Floresan mikroskopisiRNA (Alexa Fluor 488) floresan etiketli hücre içi dağılımını gösteren görüntüler; skala çubuğu 40 mm temsil eder. (C) floresan görüntüye karşılık gelen diferansiyel-interferans-kontrast bir görüntü; ölçek çubuğu 40 mikron temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. nakledilmiş THP-1 makrofajlarda IL10RB demonte siRNA aracılı., THP-1 makrofajlar özetlenen protokole göre transfekte edildi. Transfeksiyon, hücreler dört farklı kültür ortamı, yani fare T-hücresi Nucleofector ortamı (A) IMDM (B) kültive edildikten sonra Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, LGM3 (° C) ve X-VIVO 20 (D) desteklenmiştir. Carşın ya da spesifik olmayan kontrol siRNA (CTRL) ya özgü IL10RB siRNA (IL10RB) ile transfekte edilmiştir. Darbe kontrolü, yani: Aşağıdaki örnekler alındı ​​ilave kontroller olarak. yani SiRNA (Darbe) yokluğunda, ve orta kontrolde transfeksiyon yapıldı hücreler. kültür ortamı sadece değişiklikleri alınan ama başka maruz bırakılmamıştır hücreleri. 24 saat transfeksiyondan sonra hücreler ya da daha fazla, 24 saat boyunca 50 ng / ml &#39;IL10 içermeyen serumsuz ortam içinde inkübe edildi. IL10RB ifadesi RT-QPCR ile ölçülmüştür; şemaları, üç bağımsız deneyin ortalaması, hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil gösterir; * P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** Ctrl vs p &lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; Şekil nakledilmiş THP-1 makrofajlarda IL10RB demonte sonra SOCS3 4. IL10-bağımlı regülasyonu., THP-1 makrofajlar tanımlanmış olan protokole göre transfekte edildi. Transfeksiyon, hücreler dört farklı kültür ortamı fare T-hücresi Nucleofector ortamı (A) IMDM (B) kültive edildikten sonra Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, LGM3 (C) ve X-VIVO 20 (D) desteklenmiştir. Hücreler, spesifik olmayan kontrol siRNA (CTRL) ya özgü IL10RB siRNA (IL10RB) ile transfekte edilmiştir. Yani Pulse kontrolü, siNRA (Pulse) yokluğunda transfeksiyonunu uygulandı, yani hücreleri ve orta kontrolü,: ek aşağıdaki örnekler alındı ​​kontroller gibi. kültür ortamı sadece değişiklikleri alınan ama başka maruz bırakılmamıştır hücreleri. 24 saat transfeksiyondan sonra hücreler ya da daha fazla, 24 saat boyunca 50 ng / ml &#39;IL10 olmadan serum içermeyen ortam içinde inkübe edildi. SOCS3 Expresalgılanması RT-QPCR ile ölçülmüştür; şemaları, üç bağımsız deneyin ortalaması, hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil gösterir; *, # P &lt;0.05; **, ## P &lt;0.01; ***, ### Ctrl vs vs ve p &lt;0.001 Ctrl + IL-10, sırasıyla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Bu protokol, yüksek hücre canlılığı ve farklılaşması ve polarizasyon tam makrofaj kapasitesini muhafaza ederek, yüksek transfeksiyon verimi olan elektroporasyon ile siRNA veya plazmit DNA&#39;sı ile insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkin ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

highly-efficient-transfection-human-thp-1-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

46.7K Görüntüleme.  Friedrich Schiller University Jena.  Bu protokol, yüksek hücre canlılığı ve farklılaşması ve polarizasyon tam makrofaj kapasitesini muhafaza ederek, yüksek transfeksiyon verimi olan elektroporasyon ile siRNA veya plazmit DNA'sı ile insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkin ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır. 

Video: Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Biyoloji

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Transfecting Primary Macrophages with Modified mRNA

Source: Herb, M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60143">Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the process of transfecting primary macrophages with modified mRNA encoding green fluorescent protein. These modified mRNAs, designed to reduce immunogenicity and improve its stability, ensure the successful transfection and subsequent expression of green fluorescent proteins, which is confirmed through fluorescence microscopy.