Biz yayın maliyetlerini kapsayan bu yayını sponsor için Lonza Group Ltd müteşekkiriz. Biz SL mali destek und Kultur Wissenschaft Deutsche Infarktforschungshilfe Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung ve Thüringer Ministerium für Bildung&#39;u, teşekkür ederim.

THP-1 Makrofagların 1. Predifferentiation <ol><li> Bir CO2 içinde% 10 (h / h) fetal dana serumu (FCS) ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin / L-glutamin (PSG) ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında, THP-1 hücrelerini yetiştirmek (% 5 37 ° C) kuluçka makinesi. </li><li> Transfeksiyondan önce, hücreleri bölme ve daha önce olduğu gibi taze RPMI ortamına aktarabilirsiniz. 24 saat boyunca hücrelerin kültive edilmesi. </li><li> Tohum 1.0-1.5 x 10, 75 cm² doku kültür şişesi içine 7 hücreleri veya 2.5 x 10 7, RPMI-1640 ortam maddesi içinde bir 150-cm² doku kültür şişesi içine hücre ve% 10 (hac / hac) FCS,% 1 (hacim ekleme / 48 saat boyunca hacim) PSG,% 1 (v / v) sodyum piruvat,% 1 (h / h) esas olmayan amino asitleri, 10 ng / ml PMA ve 50 uM β-mersaptoetanol eklenir. </li></ol> Nucleofection 2. hazırlanması <ol><li> 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içine Accutase I ve ortam yerleştirin. </li><li> Şişeden bir kültür ortamı aspire ve 6 ml (75 cm² şişe) veya 12 ml (150 cm² balon) ile değiştirin bölgesininAccutase I ve hücrelerin tam ayrılması için 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. Hücreler yuvarlak bir görünüme sahip olmasını sağlamak için Accutase ben tedaviden sonra hücre morfolojisi gözlemleyin. Bazı hücreler hala bağlı gibi görünüyorsa, dikkatli bir mikropipet ile şişeyi çalkalayın ya da hafifçe dekolmanı tamamlamak için dokunun. Bu hücre canlılığı üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olacak gibi, hücre kazıyıcılar kullanmayın. 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer hücre süspansiyonu. </li><li> Accutase Ben tedavisi sırasında, aşağıdaki ortamları hazırlamak: <ol><li> Transfeksiyon ortamı hazırlayın: ek hücre kültür ortamı,% 1 (h / h) PSG ile,% 1 (h / h) esansiyel olmayan amino asitler,% 1 (v / v) sodyum piruvat ve% 5 (h / h) insan serumu (plazmid DNA), insan serumu (siRNA) veya% 20 (h / h); iki adet 12 oyuklu plakalar için, bir 6-yuvalı plaka ya da 4 ml / numune için, ya 3 ml / numunenin bir son hacim hazırlar. </li><li> Yetiştirme ortamı hazırlayın: ek bir kültür ortamı,% 1 (h / h) PSG ile,% 1 (h / h) temel olmayan amino asitler,% 1 (v / v) sodyum piruvat ve% 5 (h / h), HUinsan (siRNA için), kan ya da% 20 (plasmidi için) (h / h) insan serumu, 2.5 ng / ml PMA ve 50 uM β-mersaptoetanol; iki adet 12 oyuklu plakalar için, bir 6-yuvalı plaka ya da 4 ml / numune için, ya 3 ml / numunenin bir son hacim hazırlar. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje hücre süspansiyonu. </li><li> RPMI ortamında 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış, 1 ml aspire Accutase I ve tekrar süspansiyon hücreleri; hücre sayısını belirlemek için hücreleri saymak. NOT: hızlı otomatik hücre sayım işlemleri kullanıldığında, 2.4 ve 2.5 adımları atlanabilir ve hücreler dekolmanı Accutase I uzun süreli temastan kaçınılmalıdır şartıyla hemen sonra sayabiliriz. </li><li> Her bir numune için transfeksiyon 2.0-2.5 x 10 6 hücre ihtiva eden santrifüj tüplerine alikotları hazırlamak. </li></ol> THP-1 Makrofagların 3. Nucleofection <ol><li> Santrifüj, oda sıcaklığında 250 x g&#39;de 10 dakika boyunca her alikotları. </li><li> Nükleaz serbest plazmid DNA veya siRNA seyreltin, su veya uygun bir tampon. Mümkün olduğu kadar küçük plazmid DNA veya siRNA&#39;nın gerekli hacmi tutun. </li><li> Her bir transfeksiyon için plazmid DNA siRNA 1 ug veya 0.5 ug ya da sadece bir kez Nucleofector küvet hazırlayın. </li><li> Her seferinde bir transfeksiyon gerçekleştirin. Hücre bölenin aspire süpernatant. </li><li> DNA / siRNA ve Nucleofector çözeltisi 100 ul toplam hacim elde etmek üzere çözelti içinde topak Nucleofector süspansiyon hücreleri. En az saf Nucleofector çözeltisine maruz kalma süresi 15 dakika tutmak ve aşmamasını maruz kalma süresi sağlamak. </li><li> Hafifçe vurmak suretiyle Nucleofector küvet içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ve DNA / siRNA karıştırın. </li><li> Nucleofector 2b Aygıt program-Y-001 gerçekleştirerek transfekte hücreler. </li><li> Tek kullanımlık plastik pastör pipet kullanılarak bir reaksiyon şişesine transfekte hücrelerin aktarın. </li><li> Hemen hazırlanan transfeksiyon ortamı 500 ul ilave edin. </li><li> Tekrar 3.4 Her transfeksiyon numune için 3.9 için yineleyin. </li></ol><ol><li> Transfekte edilmiş hücreler, 6-ya da 12-kuyucuklu plakalar ya hazırlayın. Pipet 2,5, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna transfeksiyon ortamı (1 de / transfeksiyon) ml ya da 12 oyuklu plakanın her oyuğuna transfeksiyon aracı 1.75 ml (2 kuyu / transfeksiyon). </li><li> Bir mikropipet ile iyice hücre süspansiyonları karıştırın. </li><li> Hazırlanan kuyu içine transfekte edilmiş hücrelerin aktarın (bir ya da 12 oyuklu bir plaka içerisinde bir 6 yuvalı plaka ya da iki). </li><li> Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde (% 5 CO2, 37 ° C) 4 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Mikroskobik hücrelerin yatıştırıldı edin. NOT: hücrelerin çoğunluğu yine yapışık olmalıdır. Zaman zaman, 1 saat ile kuluçka süresinin uzatılması yeterli yeni yapışma durumunda yapışan hücrelerin sayısını artırır. </li><li> Dikkatlice bir mikropipet ile transfeksiyon orta aspirat ve yetiştirme ortamında eşit miktarda değiştirin. Her seferinde sadece bir aspire de. </li> &lt;li&gt; plazmid veya siRNA&#39;nın (24-72 saat) maksimum etki için gerekli süre boyunca inkübe hücreleri. Inkübasyon süreleri 48 saat aşarsanız, 48 saat sonra orta yerine. </li><li> Efektör ek tedavisi için (örneğin,., Sitokinler, agonistler, antagonistler ve inhibitörler), PMA olmadan serum içermeyen ortamda ve β-merkaptoetanol kullanın. Saat plazmid veya siRNA&#39;nın maksimal etkinin süresi ile bir effektör İnkübasyon süresinin sonunda, orta ve buna göre efektör eklenmesi değişikliği planı. Daha uzun, 24 saat boyunca serum serbest koşullar altında hücreleri korumak etmeyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer.">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li><li>Mae&#223;, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages.">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li><li>Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+C-X-C+chemokine+receptor+type+7+(CXCR7)+switches+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+and+phagocytic+activity+in+macrophages+linked+to+atherosclerosis.">Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis.</a> J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation.">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li><li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47,+a+lipid+cargo+protein+involved+in+macrophage+triglyceride+metabolism.">TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).</li><li>Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+proteins+visualized+by+freeze-fracture+immuno-electron+microscopy:+A+new+tool+in+cellular+and+molecular+medicine.">GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine.</a> J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).</li><li>Guh, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators.">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates:+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b.">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li></ol>

Bu video-makale için yayın masrafları Lonza Group Ltd tarafından sponsor

Burada özetlenen protokolü genellikle geçiştirilmesi için oldukça zor THP-1 makrofaj geçiştirilmesi için güvenilir ve verimli bir yol sunuyor. Transfeksiyon hücre canlılık önemli bir azalma olmadan siRNA için% 90 ve üzerinde transfeksiyon verimliliği ile elde edilebilir. Plazmidler için verimlilikleri genellikle elde edilebilir% 70 civarında kendi boyutu ancak transfeksiyon verimliliği nedeniyle daha az olabilir. SiRNA aracılı Nakavt verimi, uygulanan siRNA bağlı olarak 80-90% ulaşabilir. Bu protokolün önemli bir avantajı, hücre farklılaşması müdahale etmemesidir. Transfeksiyondan sonra hücreler yine 12 farklılaşma madde PMA (1B ve Şekil 4 Şekil 1A) karşı normal cevap veremez. Bu da transfeksiyon a sonra ekimi için seçilen ortama kuvvetle bağlıdır, ancak bu IL10 veya LPS gibi sitokin uyaranlar tarafından eklenmesi hücresel kutuplaşma / IFNy, etkilenmez 12&#39;dirŞekil 4&#39;te gösterilen s. Özel gereksinimlere protokolünü uyarlamak için modifiye edilebilir prosedür dahilinde çeşitli seçenekler vardır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, hücreler, transfeksiyondan sonra, seçilen kültür ortamına bağlı olarak aynı IL10 uyarana farklı şekilde etkiler. Bu ortam kompozisyon, hücresel davranışı üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğunu gösterir. Çeşitli deneysel uyarıcılar için farklı olabilir ortam tarafından uygulanan etki olarak, bu optimum ortamı değişebilir ve bu nedenle bağımsız olarak farklı deneyler için vasatın uygun olduğunu doğrulamak için bir ihtiyaç olduğu mümkündür. Ancak THP-1 hücrelerinin kültivasyonu için kullanılan varsayılan ortamı olan RPMI-1640 ortamı, hücre canlılığını önemli bir kayıp gözlendi olarak transfeksiyondan sonra kültivasyonu için kötü uygun olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca protokol, aynı zamanda önceden PMA-kaynaklı farklılaşma olmadan, THP-1 monosit uygulanabilir, butabii ki, işlem sırasında hücre ayrılması ihtiyacını ortadan kaldırır, fakat geri kalan bütün adımları ayarlanması gerekmez. Gerekirse, THP-1 monosit sonra ayırt edilebilir. Protokolün en kritik elemanlar ilk olarak ayrılması ve ikinci transfeksiyon için gerekli olan zaman vardır. Dekolmanı yüksek hücre canlılığını muhafaza edilmesi amacıyla, yavaşça mümkün olduğu kadar gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle Accutase Ben üzerinde bu tür tripsinizasyon oldukça agresif yöntemler ile karşılaştırmalı olarak yumuşak enzimatik dekolmanı öneririz. Lidokain gibi ya da kazıma ile işlenmesi gibi başka ayırma yöntemleri oldukça zararlı olduğu bulunmuştur ve kullanılmamalıdır. Accutase Tedaviden 30 dakika tüm hücreleri ayırmak için yeterli olmaması gerektiğini durumda doğru bu genellikle yanlış olarak depolanır ya da süresi dolmuş Accutase Ben çözümün ya da çok sayıda donma-çözülme döngüleri bir göstergesidir. Bu -20 ° C&#39;de Accutase I az miktar depolayarak iyi sonuçlar elde ettikC dondurma-çözme döngüsü sayısını azaltmak için. Yetersiz dekolmanı olduğu ancak zaman taze Accutase ile Accutase I değiştirmek veya 1 saat inkübasyon süresi kadar artar ya. Ilave nazik dokunarak veya dekolmanı yardımcı olabilir şişesi veya plaka durulama. Transfeksiyon için gerekli süre konusunda saf Nucleofector çözüm hücrelerin maruz kalma süresi mümkün olduğunca kısa olmalıdır ve böylece hücre canlılığı yüksek etki var ve gelmiştir. Bunu başarmak için en iyi yolu bir süre paralel (adım 2,10-2,15) çok değil transfeksiyonlardan her transfeksiyonunu yapmaktır. Demonte verimliliği düşük ise, bu genellikle düşük transfeksiyon verimliliği neden değil, ama bu kolayca akım sitometri veya floresan mikroskopi kullanılarak doğrulandı ve floresan siRNA&#39;nın veya GFP kodlama plazmid etiketli olabilir. Çoğunlukla nedeni verimsiz bir SiRNA veya plazmid DNA. Bu koşullar altında (2-3 ug kadar) siRNA miktarını artırmak için değerlendirilmesi gereken veyaDNA (kadar 1-2 mg) veya varsa farklı bir SiRNA veya ifade vektörü kullanın. Seçenek olarak ise, tatmin edici sonuçlar, aynı hedefe yöneltilmiş birçok farklı siRNA&#39;lar bir havuz kullanılarak elde edilebilir. Ayrıca, süre ders deneyler doğru genellikle transfeksiyonundan sonra 24 ila 72 saat sonra ulaşılır maksimal etkisi dönemini belirlemek için gerekli olabilir. Yanı sıra transfeksiyon, elektroporasyon ile memeli hücrelerin transfeksiyonu için iyi bilinen teknikleri daha vardır. Sık uygulanan sistemler, yük nükleik asit ile kompleks oluşturulmasına ve daha sonra hücrelere taşınmasını kolaylaştırmak için kimyasal nakil maddelerdir. En sık kullanılan ayıraçlar farklı lipit türlere dayanmaktadır veya katyonik polimerlerin 3 bir dizi seçilebilir. Her iki farklı bir seçim yaklaşımlar için ticari olarak temin edilebilir. Bu transfeksiyon reaktifler bunlar genellikle avantajı sunuyoruzBöylece dekolmanı için gerekliliğini ortadan kaldıran, çok zaman gerektirir ve de yapışık hücreleri ile işe yaramazsa, kullanımı kolay. Ne yazık ki, makrofajlar onlar in vitro belirgin çoğalırlar ve yabancı sitozolik DNA&#39;ya 13-15 yöneltilen savunma mekanizmalarını sahip olmayan yok gibi, bu yöntemlerle geçiştirilmesi için oldukça zordur. Bu durumda, kimyasal nakil teknikler sıklıkla hücre canlılığının bir ciddi azalma ile sonuçlanır. Geçmişte başarıyla makrofajlara siRNA aktarabilir kimyasal nakil maddeleri, ancak akış sitometrik (Şekil 2A) ve floresan mikroskobik olarak (Şekil 2B) analizleri, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, ancak bunlar hücreleri içindeki siRNA ile aynı homojen dağılımı elde etmek için başarısız göstermektedir nucleofection ile elde edilmiştir. Aslında, akış sitometrik veriler, transfekte edilmiş hücrelerin iki popülasyon meydana gelmesi Nucleofecti sonra hücreler olarak benzer floresan ile ilk önce bir nüfus olduğunuüzerinde tespit edilir ve ikinci daha yoğun floresan bir nüfus bulunmaktadır. Kesin onay hala gereklidir ancak ilk popülasyon ikinci popülasyon muhtemelen çok parlak aglomeratlar ile hücrelerin tekabül ederken, sitoplazmada içinde floresan siRNA homojen bir dağılımını gösteren bu hücreler ile aynı olan floresan mikroskopi olduğunu varsayalım. Şekil 2A&#39;da gösterilen bir akış sitometrik veriler göstermektedir ki, alternatif lipofeksiyon yaklaşıma göre, hücre başına daha az siRNA Nucleofection sonuçlanır. Bununla birlikte Şekil 3&#39;te veri nucleofection ile bu buluşa katılan siRNA bile nispeten küçük miktarı zaten, hedef genin 80-90% demonte için yeterli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, kimyasal transfeksiyondan sonra ikinci popülasyonuna ile bu buluşa katılan siRNA ek miktarı çok fazla ve muhtemelen daha da artmasına, yok etme etkisi için daha arzu edilmeyen yan etkilere neden olduğu, böylece daha olasıdır. Bunun dışındaBu SiRNA molekülleri olası değil fonksiyonel veya serbest siRNA&#39;nın moleküllere göre en azından daha az verimli ve hedef etkilerini kapalı neden olabilir hücre içi aglomeralarının oluşumu zaten kendi içinde istenmeyen bir durumdur. Ayrıca bu aglomeraların gerçek doğası henüz belli değil. Bu noktalar, siRNA hücreler tarafından ancak endozomlar başarısız oldu ve siRNA tutulacağı ve bu yüzden etkisiz kalır, daha sonra ikinci serbest olduğunu gösteren endozomlar temsil mümkündür. Alternatif olarak, hücre lekeleri oluşur topaklar olabilir. Kimyasal transfeksiyonunun Fonksiyonel değerlendirmeler nedenle devirme verimliliği üzerinde hiçbir kesin ifadeler hala iki ayrı nüfus varlığı bu tüm sonuçlar, hem nüfus ortalamasını tarif demektir zaten elverişsiz olduğu, henüz yapılabilir, bekleyen, bu yüzden uyuşmuyor ya popülasyonlarının. Bu nedenle Nucleofection üstün bir yaklaşımdır. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; Bununla birlikte, aynı zamanda burada tarif edilen transfeksiyon prosedüre sınırlamalar vardır. Hücreler Nucleofection yapışan hücreler, hücrelere ilave bir stres faktörü sunduğu, müstakil gereken karışımın içinde olmak zorunda beri. Ayrıca tüm protokol de oldukça zaman alıcı. Deney başına 10 - Transfeksiyonlar aynı anda gerçekleştirilir, ancak hücre hasarı önlemek için hızlı bir şekilde yapılması gereken olabilir ve bu, numune sayısı 8 ile sınırlıdır. Böylece, bu protokol, yüksek veri akışı tarama projeler için uygun değildir. Yüksek hacimli uygulamalar için farklı Nucleofector sistemleri mevcuttur. Birincisi, 16 de şerit biçimini sunan 4D-Nucleofector sistemi vardır. Daha büyük verim için, 96 gözlü Servisi sistemi ve 384 de HT Nucleofector sistemi mevcuttur. Bu şekilde yeni sistemler yerine alüminyum iletken polimer elektrot ve bu nedenle elektrik koşullarda, yani programları ve kompozisyonunun çalışma Ancak olarakNucleofector çözeltisi TV&#39;nizi yerleştirmeden, bizim, bu sistemlerin protokol aktarılabilir halinde tespit edilmesi gerekir, buna göre değişti. Ancak, bu sınırlamalara rağmen protokolü bütün diğer viral olmayan yaklaşımların üstün THP-1 hücrelerinin güvenilir ve etkili bir transfeksiyonunu verim vermez burada sundu. Bu protokol, tüm diğer yönden birbirinden ayrılması ve normal olarak ve böylece mümkün olduğu kadar az transfeksiyon yan etkiler gösterdikleri için polarize, THP-1 hücrelerinde gen ekspresyonu değişimlerinin etkileri inceleme sağlar.

İnsan bağışıklık sisteminin hücresel bileşenleri arasında, makrofajlar, doğal immun cevabın için büyük önem taşımaktadır. Onların görevleri çeşitlidir; onlar genelde patojenlere ve nekrotik malzeme fagositozu katılan, doku homeostazında önemli bir rol oynayabilir ve düzenleyen ve bağışıklık yanıtı düzenlemek için 1 sitokinlerin çok sayıda üretmek ve salgılamak. Bu nedenle bütün olarak makrofajlar, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik süreçler koşullarda katılmaktadırlar. Nedeniyle görevlerinin çeşitliliği, makrofajlar çok heterojen ve çok yönlü hücre tipi vardır. Bu, farklı polarizasyonlar ile elde edilmektedir; dış uyaranlara makrofajlar bağlı olarak farklı fenotipleri 2 dönüşebilir. Immün yanıta makrofajlar &#39;değişkenliği ve etki onlara çok ilginç bir araştırma konusu yapmak. In vitro bir model, karmaşık metabolik ve düzenleme işlevini uygun makrofajlar aydınlatmak amacıyla Shawnee Nationaledinilmiş doğru makrofaj karışıklığını ve değişkenliği yansıtmaktadır. Hücresel bir gen ekspresyonunu değiştirmek için plazmid DNA vektörleri ya da küçük müdahale edici RNA&#39;lar (siRNA&#39;lar) ile hücrelerin transfeksiyonu gen regülasyonu ve gen işlevini hem de incelemek için, hücre biyolojisi yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir araç haline gelmiştir. Şu anda ökaryotik hücrelerin transfeksiyonu için mevcut farklı araçlar büyük bir seçim var. Bu araçlar hücrelere 3, viral vektörler, (örneğin, bir gen tabancası gibi) mekanik yöntemlerle, (nükleik asit ile kompleksler oluşturabilir polimerler veya lipitler dayanan) kimyasal yaklaşımlar uygulanmasını ve elektroporasyon yer alır. Bu yaklaşımların hepsinin avantajları ve dezavantajları vardır ve belirli bir hücre tipi ve uygulama için, bu geniş diziden en uygun seçimi zor ve zaman alıcı bir süreç olabilir. Makrofajlar hemen hemen tüm köklü transfe transfect oldukça zorduravranış yaklaşımlar büyük ölçüde makrofajlar &#39;canlılığı azaltmak ya da davranışları, yani farklılaşma ile ve özellikle polarizasyon müdahale. Bu yüzden, burada DNA düşük miktarda gerektiren optimum bir elektroporasyon yaklaşımı temsil elektroporasyon bazlı Nucleofector teknolojisi kullanılarak insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkili bir viral-olmayan protokol mevcut. Nucleofection, monositler ve makrofajlar gibi hassas hücrelere için çok uygundur. Bu protokol daha önce yayınlanmış sürümleri 4,5 bir uyarlamasıdır. Kısaca, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA), önceden siRNA veya plazmit DNA ile transfeksiyondan erken makrofajlara 48 saat boyunca insan monositleri, THP-1 ayırt etmek için kullanılır. Transfeksiyon için predifferentiated makrofajlar Accutase Ben tedavi ile enzimatik ayrılır. Transfeksiyon hücrelerin elektroporasyonu için Nucleofector 2b cihazı kullanılarak gerçekleştirilir. Transfeksiyondan sonra, farklılıkayırt edilmesi gereken şekilde bir 24-48 saat boyunca devam edilir. Son olarak, olgun transfekte edilmiş makrofaj fonksiyonel çalışmalarda bileşiklerin çeşitleri ile inkübe edilir. Bu yaklaşım, insan THP-1 monosit ve makrofajlar gibi hücre çizgilerinin transfeksiyonu için izin verir ve gecen 6-10 uygulanmıştır. En çok kimyasal nakil yaklaşımların aksine, erken makrofajlar kullanılarak Modifiye Nucleofection işlem, viral vektörlerin kullanılması veya bilinmeyen yan etkiler ile daha fazla taşıyıcı madde bileşikleri eklemek gerek kalmadan, zarar görmemiş hücre yaşayabilirliği ile kombinasyon halinde, yüksek transfeksiyon verimi elde edilir. Buna ek olarak, makrofajlar ve böylece, aşağıdaki transfeksiyon 11 engelsiz işlevsel incelemeleri sağlayan tam farklılaşması için potansiyel olarak polarizasyon saklayın. Ayrıca, nucleofection sonra uygulanan hücre kültürü ortamı şiddetle fonksiyonel çalışmalar aşağıdaki tran etkilersfection; Özellikle, polarizasyon için makrofajların kapasite uygulanan kültür ortamına bağlı olarak etkilenebilir. Hücre kültür ortamının Burada, dört farklı tipte (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 ve fare T hücresi Nucleofector ortamı) ile interlökin devreden çıkartma şartları altında test edilmiştir (İL), THP-1 10. makrofajlar kullanarak, IL10 hücre tepkisi olduğu görülmüştür Fare T hücresi Nucleofector ortamı, yukarıda sözü edilen diğer kültür ortamı ile karşılaştırıldığında kullanıldığı zaman güçlü. Bu sonuçlar, önemli ölçüde deney sonuçlarını geliştirmek şekilde tüm hücre kültürü koşullarının optimizasyonu uygun transfeksiyon başarı und daha sonra fonksiyonel çalışmalar için gerekli olduğunu göstermektedir. Makrofajlar çeşitli insan hastalıklarında rol gibi, çok daha fazla araştırma makrofaj davranışı ve makrofajlar tarafından kontrol makrofaj veya sırayla etkileyen düzenleyici mekanizmaların tanıtılması odaklanmıştır. Dolayısıyla, bu protokol geçerliliğini korumaktadırbirçok farklı araştırma alanları.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Accutase I</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amino acids, nonessential</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">M11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal calf serum (FCS gold)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human Monocyte Nucleofector Kit</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VPA-1007</td>
			<td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human serum off the clot</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">C11-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Isove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Mouse T Cell Nucleofector Medium</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VZB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nucleofector 2b</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">AAD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100&#215;)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">siRNA / plasmid</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">THP-1 human leukemia monocytes</td>
			<td style="width:145px;">CLS</td>
			<td style="width:145px;">300356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture flasks (75 cm&#178;; 150 cm&#178;)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP90076/TPP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP92406/TPP92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tubes (1.5 ml)</td>
			<td style="width:145px;">StarLab</td>
			<td style="width:145px;">S 1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">X-Vivo 20 with Gentamycin</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">BE04-448Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

Makrofajlar, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının önemli oyuncuları olarak, doku homeostasis veya çeşitli patolojiler ile ilgili araştırma odağında bulunmaktadır. SiRNA ve plazmid DNA ile transfeksiyon onların işlevini incelemek için etkili bir araçtır, ancak makrofaj transfeksiyonunun önemsiz bir konu değildir. Ökaryotik hücrelerin transfeksiyonu için çok farklı yaklaşımlar mevcuttur, ancak az sayıda makrofaj güvenilir ve verimli transfeksiyona, ancak daha az hücre canlılığı ve sık görülen farklılaşma veya polarizasyon için azalmış yeteneği gibi ciddi bir şekilde değiştirilmiş bir hücre davranışını verir. Bu nedenle, bu şekilde transfeksiyon protokol, normal hücre davranış bağlamında siRNA etki ya da plazmid soruşturma izin ciddi yan etkilere neden olmadan makrofajlara siRNA ve plazmid DNA aktarma yeteneğine sahip olması gereklidir. Burada sunulan protokol güvenilir ve etkili bir insan THP-1 makrofajlar ve mo transfekte edilmesine yönelik bir metot sağlar;Yüksek hücre canlılığı, yüksek transfeksiyon verimlerine ve hücre davranışı üzerinde minimum etki nocytes. Bu yaklaşım nucleofection dayanmaktadır ve protokol transfeksiyondan sonra hücre aktivasyonu için maksimum yeteneği sağlamak için optimize edilmiştir. Protokol süspansiyon içinde ayrılması ve hücre sonra yapışık hücreler için yeterli olduğunu ve orta örnek sayı için, küçük için kullanılabilir. Bu yüzden, sunulan bu yöntem, makrofaj farklılaşması ve polarizasyon esnasında gen düzenleyici etkilerini araştırmak için yararlıdır. Apart alternatif bir kimyasal yönteme göre bu protokole göre transfekte makrofajlar karakterize sonuçlarını sunma, hücre davranışı üzerindeki transfeksiyonundan sonra hücre kültür ortamı seçimi etkisi de tartışıldı. Sunulan veriler, farklı deneysel ayarları için seçimi doğrulama önemini göstermektedir.

Genellikle hücre canlılığının önemli bir düşüş olmadan 90 Yukarıda% transfeksiyon oranları elde siRNA ile THP-1 makrofajlar transfeksiyonu için bu protokolü kullanarak. Şekil 1, 24 saat, bir transfekte edilmemiş karşı siRNA floresan etiketli ile transfeksiyondan sonra hücrelerin durumunu karakterize etmek için temsili verileri gösterir Nucleofection reaktifleri ile muamele edilmiş ve darbeli veya siRNA fakat transfekte edilmiş örnekleri gibi bir kültür ortamı tüm değişiklikleri dönmemiştir kontrolü. Şekil 1A hücresel morfoloji akım sitometri ölçümüne göre gösterilmektedir. . Mikroskopik görüntüleri Şekil 1B gösterildiği Şekil 1C ve 1D düşük apoptoz oranları (kontrol:% 1.5; Nucleofection:% 5.4) temsil edilir:;: etkilenmemiş hücre canlılık gösteren ve nekroz (% 3.2, kontrol Nucleofection% 2.0). Nakledilmiş THP-1 makrofaj daha olarak nekroz ve apoptoz transfekte numune için biraz daha yüksektiruntransfected hücreleri, dekolmanı artar sırasında hücre hasarı dolayısıyla olasılığı daha ayırmak zordur. Son transfeksiyon verimi Şekil 1 E&#39;deki sunulmuştur. Tüm transfekte edilmiş bir popülasyondan kontrolüne karşı kaydırılır, bu tüm hücreler flüoresans mikroskopisi görüntüleri (Şekil 2B) ile teyit edildiği transfekte olduğunu gösterir. Her ikisi de tüm hücreler sürekli hücreleri arasında yanı sıra hücre içindeki siRNA&#39;nın homojen dağılımı ile transfekte olduğunu göstermektedir sıtometrık verilerin yanı sıra floresan mikroskobik görüntüleri akar. Bu karşılaştırma için Şekiller 2A, bir çok kimyasal transfeksiyon reaktifleri aksine ve Şekil 2B, yağ bazlı bir yaklaşım kullanılarak kimyasal bir transfeksiyon maddesi için ilgili akış sitometrik veriler ve floresan mikroskopik resimleri göstermektedir. Bu rakamlar, transfekte edilmiş hücrelerin, iki farklı popülasyonlar tespit edilebileceğini göstermektedir. İlk popülasyon follo transfekte edilmiş hücrelere benzerkanat Nucleofection. Bunlar, düşük toplam floresan ve hücrelerin içinde siRNA homojen dağılımı ile karakterize edilir. Ikinci popülasyon siRNA çok parlak hücre topaklarının kaynaklanan daha şiddetli floresan ile işaretlenir. Şekil 2C&#39;de, farklılık belirleyici kontrast ile gösterildiği gibi, her iki hücre morfolojisi transfeksiyon yaklaşımlar için etkilenmez. Etkin bir şekilde benzer sonuçlar ile plazmid DNA verimi Transfeksiyonlar, örnekler için Robenek ve ark. (2009) 9 ya da Xie bakınız ark. (2006) 7. Transfeksiyondan sonra hücre kültür ortamının seçimi büyük öneme sahiptir; bu nedenle de farklı hücre kültür ortamı kıyasla test edildi. Seçilen tüm ortam, THP-1 hücrelerinin kültivasyonu için uygun olan ve sonrası Nucleofection kültivasyonu için ortam olarak uygulanabilir Lonza&#39;dan önerilerine göre seçilmiştir. 3 siRNA MEDIAT temsil Şekiled IL10RB (interlökin 10 reseptörü β zinciri) mRNA&#39;ya karşı yönlendirilmiş bir siRNA kullanılarak verimi demonte. Test edilen tüm ortam için IL10RB ekspresyonunun önemli ölçüde kontrol seviyesi yaklaşık% 10-20 (Şekil 3) indirgenmiştir. Bununla birlikte transfekte edilmiş hücreler polarizasyon için potansiyeli kültür ortamına bağlı olarak değişebilir. Spesifik olmayan kontrol siRNA veya IL10RB özgü ya siRNA ile transfekte edilmiş THP-1 makrofajlar transfeksiyondan sonra farklı ortamlarda yetiştirilen ve IL10 ile tedavi edildi. IL10-indüklenmiş gen SOCS3 mRNA düzeyine (3 sitokin sinyal baskılayıcı) sonradan ekspresyon düzeyleri RT-QPCR kullanılarak ölçüldü. Kültür ortamı arasındaki farklar SOCS3 mRNA ekspresyonunun indüksiyonu ölçüde ilgili olarak ortaya çıkmaktadır (Şekil 4), test edilen ortam fare T-hücresi Nucleofector Orta her biri için indüksiyonlar, LGM3, X-VIVO 20 ve 19.5 olmuştur IMDM [17,7-21,5 ], 11.5 [8,5-15,7], 8.0 [4,6-14,2] ve 7.2 [5,6-9,5] sırasıyla katlayın.Fare T hücresi Nucleofector ortamının refore uygulama hayati önem taşımaktadır. Buna ek olarak, tedaviden sonra da IL10 SOCS3 ifadesi üzerindeki IL10RB arasında Nakavt etkisi gözlemlenebilir farklılıklar vardı SOCS3 mRNA ekspresyon seviyeleri, 9.5 [8,8-10,3] katlanması fare T-hücresi Nucleofector ortamına düşürülmüş, 2.1 [1,1-4,1] kat LGM3 yılında, 4.8 [3,2-7,2] X-VİVO 20 ve 3.3 [2,7-3,9] katlayın IMDM&#39;de katlayın. Bu değerler sırasıyla% 49,% 18,% 60 ve% 45, en farklı ortamda SOCS3 ifade azalmalara karşılık gelmektedir. IL10RB siRNA transfeksiyonundan sonra, IL-10 ile indüklenen SOCS3 ifade azaltılması transfeksiyonu ile IL10RB başarılı infekte teyit etmektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> Işık mikroskopik, tarafından açıklanan ve akış sitometrik analizleri transfekte edilmemiş eş olarak transfekte edilmiş THP-1 makrofaj Şekil 1. karakterizasyonu. Hücrelerin karakteristik durumu etkilenmemiştirTHP-1 hücreleri, makrofajlar karşı ntrol sunulan protokole göre transfekte edildi. THP-1 makrofajlar 48 saat boyunca 10 ng / ml PMA ile farklılaşmış ve floresan etiketli (Alexa 488) spesifik olmayan kontrol siRNA ile transfekte edilmiştir. Transfeksiyondan sonra 24 saat ya da canlı hücre görüntüleri (B) alınmıştır, veya hücreler Accutase I muamele ile ayrılmış ve akış sitometrisi (A) ile analiz edilmiştir. Apoptoz ve nekroz boyama Annexin V-fikoeritrin (PE), (C) ve 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Transfeksiyon etkililiği, (E) siRNA bağlı floresan etiketi kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edilmiştir. Transfekte hücreleri (siyah) floresan sinyali kontrol sinyali (gri) karşı gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width = &quot;4in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51960 / 51960fig2highres.jpg&quot; width = &quot;400&quot; /&gt; Şekil lipofeksiyon karşı nucleofection sonra siRNA hücre içi dağılımı 2. karşılaştırılması. THP-1 hücreleri Bu protokole uygun olarak 48 saat boyunca farklılaşır, sonra da nucleofection ya da lipofeksiyon yoluyla transfekte edildi. Sunulan lipofeksiyon- sonuçları 4 siRNA&#39;nın için reaktif bir ücret oranı ile üreticinin tavsiyelerine göre Xtremegene SiRNA kiti kullanılarak elde edilmiştir: 1. Transfeksiyon hücre sonra 24 saat ya akım sitometri analizi için Accutase I ile müstakil veya canlı hücreleri ile mikroskopik değerlendirildi. Nüfus içinde (A) transfeksiyon verimi ve hücre başına siRNA dağılımı siRNA bağlı floresan etiketi kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edilmiştir, siRNA transfekte edilmiş kontrol gri renkle gösterilir, siRNA ile transfekte edilmiş numuneler siyahlıkla gösterilmiştir. (B) Floresan mikroskopisiRNA (Alexa Fluor 488) floresan etiketli hücre içi dağılımını gösteren görüntüler; skala çubuğu 40 mm temsil eder. (C) floresan görüntüye karşılık gelen diferansiyel-interferans-kontrast bir görüntü; ölçek çubuğu 40 mikron temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. nakledilmiş THP-1 makrofajlarda IL10RB demonte siRNA aracılı., THP-1 makrofajlar özetlenen protokole göre transfekte edildi. Transfeksiyon, hücreler dört farklı kültür ortamı, yani fare T-hücresi Nucleofector ortamı (A) IMDM (B) kültive edildikten sonra Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, LGM3 (° C) ve X-VIVO 20 (D) desteklenmiştir. Carşın ya da spesifik olmayan kontrol siRNA (CTRL) ya özgü IL10RB siRNA (IL10RB) ile transfekte edilmiştir. Darbe kontrolü, yani: Aşağıdaki örnekler alındı ​​ilave kontroller olarak. yani SiRNA (Darbe) yokluğunda, ve orta kontrolde transfeksiyon yapıldı hücreler. kültür ortamı sadece değişiklikleri alınan ama başka maruz bırakılmamıştır hücreleri. 24 saat transfeksiyondan sonra hücreler ya da daha fazla, 24 saat boyunca 50 ng / ml &#39;IL10 içermeyen serumsuz ortam içinde inkübe edildi. IL10RB ifadesi RT-QPCR ile ölçülmüştür; şemaları, üç bağımsız deneyin ortalaması, hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil gösterir; * P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** Ctrl vs p &lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; Şekil nakledilmiş THP-1 makrofajlarda IL10RB demonte sonra SOCS3 4. IL10-bağımlı regülasyonu., THP-1 makrofajlar tanımlanmış olan protokole göre transfekte edildi. Transfeksiyon, hücreler dört farklı kültür ortamı fare T-hücresi Nucleofector ortamı (A) IMDM (B) kültive edildikten sonra Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, LGM3 (C) ve X-VIVO 20 (D) desteklenmiştir. Hücreler, spesifik olmayan kontrol siRNA (CTRL) ya özgü IL10RB siRNA (IL10RB) ile transfekte edilmiştir. Yani Pulse kontrolü, siNRA (Pulse) yokluğunda transfeksiyonunu uygulandı, yani hücreleri ve orta kontrolü,: ek aşağıdaki örnekler alındı ​​kontroller gibi. kültür ortamı sadece değişiklikleri alınan ama başka maruz bırakılmamıştır hücreleri. 24 saat transfeksiyondan sonra hücreler ya da daha fazla, 24 saat boyunca 50 ng / ml &#39;IL10 olmadan serum içermeyen ortam içinde inkübe edildi. SOCS3 Expresalgılanması RT-QPCR ile ölçülmüştür; şemaları, üç bağımsız deneyin ortalaması, hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil gösterir; *, # P &lt;0.05; **, ## P &lt;0.01; ***, ### Ctrl vs vs ve p &lt;0.001 Ctrl + IL-10, sırasıyla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Bu protokol, yüksek hücre canlılığı ve farklılaşması ve polarizasyon tam makrofaj kapasitesini muhafaza ederek, yüksek transfeksiyon verimi olan elektroporasyon ile siRNA veya plazmit DNA&#39;sı ile insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkin ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

highly-efficient-transfection-human-thp-1-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

46.5K Görüntüleme.  Friedrich Schiller University Jena.  Bu protokol, yüksek hücre canlılığı ve farklılaşması ve polarizasyon tam makrofaj kapasitesini muhafaza ederek, yüksek transfeksiyon verimi olan elektroporasyon ile siRNA veya plazmit DNA'sı ile insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkin ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır. 

Video: Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Yüksek Saflaştırılmış Alınması Toxoplasma gondii Süreksiz Sezyum Klorür Gradient ookistleri

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...