Bu çalışma (LEN hem de) Ulusal Sağlık Hibe R01 EB-008.836 Enstitüleri ve R01 HL083895 tarafından finanse edilmektedir. Biz araştırma biyoreaktörler yapmak için Daryl Smith Üniversitesi cam üfleme, teşekkür etmek ister.

Otoklav Akış sistemi ve Şekil 1 ve Şekil 2&#39;de anlatıldığı gibi biyoreaktör bileşenleri (biyoreaktör kendisi ve silikon tıpa kapağını) için tüp birleştirin ve otoklav. Tüple beslenme, bir ucunda erkek konnektör ve diğer tarafı açık bir sonu vardır. Üç kısa boru parçaları, gaz değişimi için bir silikon kap ile eklenir. 1. Dikiş PGA Mesh <ol><li> Kes PGA örgü 1.1cm x ~ 8cm sayfası (biyoreaktör boyutuna bağlı olarak). </li><li> Distile su (dH20) ve kullanmadan önce kuru hava ile temizleyiniz silikon tüp (3mm iç çapı). </li><li> Dexon 6.0, tek dikiş takip üç cerrahi knot ile başlayan temiz silikon tüp etrafında PGA örgü dikmek için dikiş kullanın. </li></ol> 2. PGA Yüzey Tedavi Yapı iskeleleri <ol><li> 1-2min ve tedavi süresi kayıt ve tüm PGA iskeleleri için aynı anda kullanmak için PGA iskele 1M NaOH batırın. </li><li> PGA iskeleler için dH2O banyolarında 2 dakika 3 kez durulayın. </li><li> Pat PGA dH 2 O banyolarında her dalış arasında Kimwipes kuru iskele. </li><li> Kuru PGA doku kültürü kaputu altında iskeleler üzerinde üfleyici ile 15 dakika süreyle kurumaya. </li></ol> 3. Dikiş Dacron silah <ol><li> Dacron manşet (1 cm), 2-3mm lik bir çakışma ile PGA örgü her ucuna küçük parçalara dikmek Prolen 4.0 sütür kullanın. Not: dikkatli olun ponksiyon silikon tüp (Şekil 3). </li><li> Dacron manşet serbest ucunu etrafında üç dikiş dikmek için aynı sütür kullanın. Adım 5.1 (Şekil 3), Prolen dikiş serbest ucunda yeterli sütür bıraktığınızdan emin olun. </li></ol> 4. Biyoreaktör Meclisi (biyoreaktör kültürü başlamadan önce Gün) <ol><li> % 70 etanol banyo dikili örgü ve silikon tüp, cerrahi aletler, ve ince bir tel, 20-30 dakika bekletin. </li><li> Montaj öncesinde en az 30 dakika boyunca% 70 etanol banyo biyoreaktör ve bu batığın bulunduğu otoklav torbalar açın. Biyoreaktör etanol ile iyice yıkayın emin olun. % 70 etanol tüm biyoreaktör bileşenleri Pozlama ek sterilizasyon adımdır. Bu adım aynı zamanda otoklavlayarak kaldırılır ve vasküler hücreleri için zararlı değildir endotoksin kaldırır. </li><li> Silikon tüp üzerine çekmek için ince tel kullanarak yan kolları ile çekin. </li><li> (Etanol içinde batık örgü tutmak) etanol banyo biyoreaktör alın. Biyoreaktör içinde PGA iskele sıkma ve Prolen sütür (Şekil 3) bağlama alevlendi cam dudakları üzerinden Dacron manşet bağlayarak sabitleyin. </li><li> Biyoreaktör yan kolların bir tarafı silikon tüp konnektörler aracılığıyla bağlayın. </li><li> Yeterli gerilim ile çekin ve silikon tüp diğer tarafında kalan iki konnektörleri silikon tüp içine yerleştirin. Silikon tüp konnektörleri takarken sıkı tutunun! </li><li> Yeniden takın, etanol banyosu içine biyoreaktör ve yan kollar yavaşça konnektörler çekerek etanol ile yıkayın. </li><li> Biyoreaktör ters çevirin ve 10 dakika bekletin. </li><li> Çevir biyoreaktör sağ tarafında yukarı ve ek bir 10 dakika bekletin. </li><li> Tüm etanol boşaltın. </li><li> Fazla etanol tüplerin ucundan damladı tutmak için merkezi çanak serisi ve yer biyoreaktör üç büyük petri kaplarına (10 cm) ayarlayın. </li><li> Biyoreaktör ve PGA mesh 5ml veya 10ml pipet kullanarak doku kültürü su ile yıkayın. Ayrıca silikon tüp içine gömme doku kültürü su. </li><li> Petri kutularının içine iyice biyoreaktör her iki tarafında tüm fazla suyu boşaltın. </li><li> Kuru biyoreaktör blower ve UV OFF kaput geceleme. </li><li> Ek Notlar: steril heyecan bar biyoreaktör olduğundan emin olun. Bu noktadan biyoreaktör üzerinde &quot;vurgulu&quot; için kontaminasyonu önlemek için emin olun. Bol parafilm şeritler kesin ve onları küçük bir% 70 etanol banyo (büyük petri iyi çalışıyor) emmek. </li></ol> 5. 1. Gün: Biyoreaktör Kurulum <ol><li> Kirleticiler PGA iskele içinde korumak amacıyla her biyoreaktör açılması üzerine steril bir petri kabına yerleştirin. </li><li> Şekil 4 ve parafilm tüm derzlerinde belirtildiği gibi biyoreaktör akış sistemi birleştirin. <ol><li> Ilk konektörler alkollü mendil ile silin. </li><li> Biyoreaktör üçüncü, kullanılmayan kol enjeksiyon portuna takın. </li><li> Mors tüpünü çıkarın ve Y-kavşak mümkün olduğunca yakın tuzlu seyreltme sonunda mavi kravat. Tüp bu bölümü için hiçbir sıvı transferi sağlamak için yerinde tüp kelepçe çekin </li><li> IV çantayı çıkarın, mors tüp (kırmızı) IV çanta öbür ucuna takın. Önce alkol ile silin ekleme portu temizlemek için emin olun. </li><li> (Beyaz sonuna tüp yoluyla) akış sisteminin bir tarafa mors takın. </li><li> 3-yollu akış sistemi içine stopcock yerleştirin. </li><li> Basınç dönüştürücü çıkarın ve üç yollu stopcock bağlanın. </li><li> Çanta orta açılış basınç dönüştürücü diğer ucunu takın. </li></ol></li><li> BağlamakY-kavşak üzerinden akış sistemi biyoreaktör. IV çanta 350ml% 1 fungizone ekleyin (PBS 495ml ile karıştırın 5ml fungizone) 60ml bir şırınga kullanın. </li><li> PBS akışına izin vermek için stop musluklar ayarlayarak akan sistemini temizlemek için IV çanta sıkın. Not: biyoreaktör içinde hiçbir sızıntı sağlamak için kontrol edin. </li><li> Her PGA scafffold üzerine orta ve tohum 1.25ml 8 x10 6 SMC&#39;lere (yaklaşık bir konfluent T75) yeniden askıya. Düzgün PGA örgü alt yüzüne yanı sıra hücre süspansiyonu PGA mesh-Dacron kavşak üzerine damladı olmuştur emin olun. </li><li> Biyoreaktör alkol ile ağız yana gezinip önlemek biyoreaktör dönen üzerinden silin silin. </li><li> Silikon stoper kapak düzeneğini (Şekil 2) <ol><li> Geri dikkatle otoklav torbası Peel, kapağın altındaki maruz kalmaması için emin olun. </li><li> Erkek konnektör beslenme tüpüne enjeksiyon portu takın. </li><li> Her üç hava limanlarından PTFE 0.20 mikron filtreleri takın. </li><li> Bu işlem sırasında açığa / alt kapak dokunmamaya dikkatli olun. </li><li> Parafilm enjeksiyon portu. </li></ol></li><li> Cam biyoreaktör içine silikon tıpa kapağını takın ve biyoreaktör içindeki beslenme tüpü numaralı seribaşı PGA iskeleleri dokunmatik olmadığından emin olun. Kapağı etrafında Parafilm. </li><li> Inkübatör içindeki akış sistemi (yan) biyoreaktör yerleştirin ve 25-30 dakika boyunca her 5 dakikada bir biyoreaktör döndürmek. </li><li> 400ml (Tablo 1) açıklandığı gibi 4-10 kültür ortamı ile biyoreaktör odasına doldurun. Bu kültür ortamı domuz mühendislik arterler için &quot;optimize&quot; dir. </li></ol> 6. Gün 6-7: Pompa açılması ve İlk Besleme <ol><li> 6-7 gün için silikon tüp yoluyla herhangi bir pulsatil pompa olmadan statik numaralı seribaşı iskele büyütün. Bu süre içinde orta değişikliği ya da C vitamini takviyesi için gerek yoktur. </li><li> PBS veya bükülme akış sistemi boru pompa açmadan önce herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun. </li><li> Akış sistemi pompa açın ve basıncı yaklaşık 270/-30mmHg okur, böylece pompa ayarı ayarlamak için emin olun. </li><li> Kayıt kültür boyunca günlük baskılar ve 270/-30mmHg basınç korumak. Basınç detektörler basıncını okumak ve izlemek için bir bilgisayara bağlanabilir. </li></ol> İlk Besleme <ol start="5"><li> Orta değişim ve orta atık azletme amaçlar için kapakları beslenme üzerine enjeksiyon portu ve PTFE filtre birleştirin. </li><li> Beslenme tüpü sıkıca pompa yerleştirin ve bir ucunu biyoreaktör ve diğer ucunu besleme kapağı liman besleme. Etanol mendil ile enjeksiyon noktaları temizlemek için emin olun. </li><li> Orta 200ml dışarı pompalamak için çift yönlü Masterflex pompa kullanın. Ardından yeni bir beslenme tüpü biyoreaktör geri taze orta 200ml pompa kullanın. Her zaman, orta ve arka biyoreaktör pompalama özellikle çok yavaş bir hız ile başlar. </li><li> Orta ve ek askorbik asit 2x/week değiştirin. Askorbik asit eklemek için, orta 25ml ve doku kaputu bir kenara yerleştirmek için 30ml şırınga kullanabilirsiniz. PBS 5ml 25mg askorbik asit çözülür ve 0,22 mikron filtresi ile filtre. Öncelikle beslenme tüpü içine steril askorbik asit enjekte ve daha önce alınan 25ml orta geri ekleyin. Orta tarifi Tablo 1&#39;de verilmiştir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Akış sisteminin montajı için boru ve konektörler yukarıda gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Silikon tıpa kapak düzeneğini yukarıda gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Biyoreaktör montaj Şemalar yukarıda gösterilmiştir. Biyoreaktör Dacron manşet mavi dikiş knot cam silah üzerine sabitlenmiş olan İç. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. Tüp ve biyoreaktör bağlı akış sistemi yukarıda gösterilmiştir. L/S18 boru Masterflex pompa ile pompalanır ve akış böylece sürüş olacak. Basınç dönüştürücü üst akım biyoreaktör girmeden önce basıncını ölçmek. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5. Hasat mühendislik geminin Resim Engineered damarların opak görünür ve pulsatil koşullar altında, 8 hafta kültürü sonra bir duvar kalınlığı yaklaşık 250μm ulaşacaktır . <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6. Mühendislik gemilerin Hematoksilen ve Eosin boyanan kesitler. A ve B sırasıyla, gemilerin 8 hafta non-darbeli ve darbeli.C ve D, sırasıyla 4 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri,. L gemilerin luminal tarafında gösterir. Terazi bar 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Şekil 7"/> Şekil 7. Kollajen için tasarlanmış gemilerin kesitler Masson trikrom lekeleri (mavi), A ve B sırasıyla 8 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri, . C ve D, sırasıyla 4 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri,. 4 hafta darbeli gemi olmayan darbeli meslektaşı daha fazla kolajen gösterir unutmayın. Beyaz oklar gemilerin PGA parçaları kalan noktası. Terazi bar 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Şekil 8"/> Şekil 8. Sığır mühendislik arterlerde SMC belirteçlerin İmmünokimya boyama. Düz kas α-aktin calponin-1, ve düz kas miyozin ağır zincir (SMMHC) sırasıyla erken, orta ve geç SMC kontraktil belirteçler. 12 haftalık kültür sonuna kadar, gemi hücreleri duvar ifade SM α-aktin ve orta miktarda Calponin-1 ve SMMHC. Terazi bar 20μm. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> DMEM (DME / düşük değiştirilmiş) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (fetal sığır serum) ısı inaktive </td><td> 100 ml. </td></tr><tr><td> Hepes 1.0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> C vitamini (PBS ya da DMEM çözünmüş) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glisin / Alanin 25 mg/25 mg/10 mg (PBS 5ml içinde çözünmüş) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1.5 mg (PBS in1 ml çözünmüş) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> Penisilin 10.000 adet G / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> 10 ng PDGF-BB (trombosit kaynaklı büyüme faktörü-BB) </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> 10 ng bFGF (temel fibroblast büyüme faktörü) </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tablo 1. &quot;4-10&quot; orta Bileşenleri yukarıdaki tabloda gösterilmiştir. PDGF-BB ve bFGF hariç, diğer tüm bileşenleri kullanmadan önce 0.2μm filtre süzgecinden edilmelidir.

<ol>
	<li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis.">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li><li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion.">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li><li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+porcine+arteries:+Effects+of+scaffold+modification.">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li><li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts.">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li><li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries.">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li><li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valent&#237;n, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors,+Intravital+Imaging,+and+Biomechanical+Modeling.">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li><li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li><li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs.">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+engineered+from+human+cells.">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li><li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).</li></ol>

Tasarlanmış gemilerin kalitesini büyük ölçüde doku kültüründe kullanılan SMC&#39;lere kalitesini tarafından dikte. SMC fenotip kritik yönleri kontraktil morfolojisi, düşük geçit sayısı ve biyoreaktör içinde prolifere yeteneği içerir. Biz geçit sayısı polimer iskele üzerine hücre tohumlama zamanında P3 daha büyük olması önerilir. Ayrıca, SMC kaynakları kullanmadan önce mycoplasma özgür olduğunu onaylamak için çok önemlidir. Biz mycoplasma-kontamine hücreler biyoreaktör kültür...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / Malzeme Adı </th><th> Satıcı </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> FBS (fetal sığır serumu) Isı-İnaktive </td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-Basic </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penisilin G </td><td> Sigma </td><td> Penna </td></tr><tr><td> Bakır (II) Sülfat </td><td> Sigma </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> Sigma </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-Alanin </td><td> Sigma </td><td> A7469-25G </td></tr><tr><td> L-prolin </td><td> Sigma </td><td> P5607-25G </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A4544-25G </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td></tr><tr><td> Silikon Stopper </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex borular L / S </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06.508-16, 06.508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex pompa </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Dacron manşet </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA hissettim </td><td> Concordia </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1.5 metrik Surgipro II sütür </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0.7 metrik Dexon sütür </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE filtreleri </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> Üç Yönlü Stop-horoz </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> Basınç Transducer </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV çanta </td><td> Baxter </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> Tuzlu seyreltme seti </td><td> Ok </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> Silikon tüp </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

Fonksiyonel küçük çaplı arteriyel atlar yeniden metodoloji geliştirmek ve ilerletmek için çok çaba ayrılmış oldu. Fizyolojik bir ortamda, hem mekanik hem de kimyasal stimülasyon arter damarlarının 1,2 düzgün gelişimi ve işlevleri korumak için gereklidir. Grubumuz tarafından geliştirilen Biyoreaktör kültür sistemleri, yerli damarları taklit bir tam kontrollü kemo-mekanik bir ortam içinde gemi yenilenmesini desteklemek üzere tasarlanmıştır. Bizim biyoreaktör montaj ve bakım işlemleri oldukça basit ve 3,4 yüksek tekrarlanabilir. Düz kas hücreleri (SMC&#39;lere) uyumlu silikon tüp içinde 12 hafta veya pulsatil uyarı olmaksızın dişli ve biyoreaktör kültüre bir tübüler Poliglikolik asit (PGA) örgü üzerine numaralı seribaşı. Bazı öncekilerden biyoreaktör ayırt dört temel nitelik vardır. 1) sadece yerel kan damarlarının etrafındaki biyokimyasal simüle diğer kültür sistemlerinin aksine, bizim biyoreaktör kültür gemilere siklik radyal gerilme uygulayarak fizyolojik pulsatil bir ortam oluşturur. 2) Birden fazla mühendislik gemilerin kontrollü bir kimyasal ortam içinde farklı mekanik koşullar altında aynı anda yetiştirilebilir. 3) biyoreaktör hayvan implantasyon modeller için tasarlanmış gemilerin luminal yüzüne kolayca kaplanabilir endotel hücreleri bir tek katman (EC) sağlar. 4) Ayrıca biyoreaktör, belirli bir çap boyutuna uyacak şekilde tasarlanmış gemilerin değişik çap büyüklüğü ile kültür, her bireyin biyoreaktör uyarlamak için çaba harcamadan, 1 mm den 3 mm arasında değişiyordu. Bizim biyoreaktör kültürü tasarlanmış gemilerin, belli bir dereceye kadar doğal kan damarlarının histolojik olarak benzerler. Damar duvarlarındaki hücreler, düz kas miyozin ağır zincir (SMMHC) 3 gibi olgun SMC kontraktil belirteçlerinin ifade eder. Önemli bir miktarda kolajen mühendislik damarları 5 nihai mekanik dayanım sorumlu ekstraselüler matriks içinde yatırılır. Biyokimyasal analizler de mühendislik damarların kollajen içeriği, ana arterler 6 ile karşılaştırılabilir olduğunu gösterir . Önemlisi, pulsatil biyoreaktör sürekli hayvan modellerinde 3,7 başarılı implantasyon deneyleri izin mekanik özellikleri sergileyen damarları yeniden. Ayrıca, bu biyoreaktör bir non-lineer optik mikroskobu (NLOM) 8 kullanarak kollajen remodeling zamanla gerçek zamanlı değerlendirilmesi ve takibi, non-invaziv, daha izin değiştirilebilir. Sonuç olarak, bu biyoreaktör fonksiyonel küçük çaplı vasküler greft rejenerasyon düzenleyen temel mekanizmaları incelemek için mükemmel bir platform olarak hizmet etmelidir.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor at JoVE.com

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Grubumuz, kardiyovasküler sistem fizyolojik pulsatil gerilmeler implante küçük çaplı vasküler greft yeniden taklit eden bir biyoreaktör kültür sistemi geliştirmiştir.

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.9K Görüntüleme.  Yale University. Grubumuz, kardiyovasküler sistem fizyolojik pulsatil gerilmeler implante küçük çaplı vasküler greft yeniden taklit eden bir biyoreaktör kültür sistemi geliştirmiştir.

Video: Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Biyomühendislik

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Bir Benchtop Biyoreaktör Operasyonu

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Bir Roman Vokal Fold Bioreactor İnşaatı ve Karakterizasyonu

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Doku Engineered Vasküler Greftlerinin ve sonraki İmplantasyonunda Cerrahi Tekniği<em&gt; İn Vivo</em&gt; İzleme

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Çeşitli mikrobiyal Toplulukları Yüksek Yoğunluklu Yetiştirme için Yeni Bir Biyoreaktör

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.