Yazarlar Paul Thomas mikroskop tavsiye ve yardım için teşekkür ederiz. Bu eser burada yer BBSRC tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. M.M.M. ve tw bb/J009040/1).

<ol>
	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium.">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li><li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells.">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells.">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres.">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li><li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening.">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer.">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts.">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIS1,+CLIP-170's+key+to+the+dynein/dynactin+pathway.">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li><li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice.">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Yalıtım bağırsak dokusu Yalıtım küçük bağırsak kriptalarının ve villus ve kolon kriptalarının Mukozal yüzeyin hücre kişiler, (sallama) ayırma ve Santrifüjü gevşetmek için EDTA çözüm ile tedavi maruz içerir. Sunulan bağırsak villus/crypt yalıtım Protokolü Belshaw vd ve Whitehead ve ark. değiştirildi. 17 , 18
Mukozal yüzey açığa Bu yordamı gelişiminde bağırsak mukozal yüzeyinde ortaya çıkarmak için yaklaşımlar bir dizi ile tecrübe var. (Ters dönüş) çıkar için klasik bir yaklaşımdır tüpte kesimleri 100 mm uzunluğunda, genelde doku katlayin bir ucunu ve sonra kalan tüp yakalanmış bir metal çubuk kullanarak üzerinde tüp19kaydırdı. Yuvarlatılmış uçları ile metal bir çubuk (2.4 mm çap) fare doku için idealdir. Bu yaklaşım PBS ve EDTA daha iyi erişim sağlayan Mukozal yüzeyin genişleyen yararı vardır. Başlangıçta bu yaklaşım kullanılan ama tüp kesme kısa uzunlukta parçalara (yaklaşık 5 cm) ve bu daha kolay ispat olarak makas diseksiyon ile her bölümünde açmak için taşındı. Eğer sadece birkaç bağırsak gereklidir bu uygun bir yaklaşımdır; Ama eğer daha fazla hayvan were to be bir denemede sonra amaca uygun yapılmış bir aygıt kesme için tüp boyuna, Yoneda ve ark. tarafından açıklandığı gibi kullanılan aç 14 daha verimli olacaktır.
Dekolmanı villus ve kas katmanından kriptalarının Başlangıçta 3 mM EDTA PBS ve nispeten uzun bir kuluçka zamanlarında 60 dakikaya kadar temel doku17,18Mukozal yüzeyden gevşetmek için kullanılır. Bu konsantrasyon EDTA bir kuluçka süresi 30 dk kriptalarının fare iki nokta üstüste gelen gevşetmek yeterli buldum. Ancak, ince bağırsak crypt/villus yalıtım için verimli bir yaklaşım olduğunu kanıtladı daha kısa bir süre daha yoğun EDTA kullanarak çalıştı. Tüm sonraki çalışma ile ilgili bölümler için villus veya kriptalarının üreten 30 mM EDTA tekniği kullanarak çıkarılan doku yapılmıştır. Kriptalarının, biz normalde havuza alınmış kesirler 3-5 düzeltmeden önce ama zamanlamaları bağlı olacaktır gibi bir dizi faktöre bağırsak boyunca konum gibi fare, iltihap, önceki diyet yaş üzerinde bu uygun kesirler vardır olup olmadığını kontrol etmek önemlidir , vb benzer şekilde, farklı koşullar altında doku etkili olabilmesi için EDTA tedavi sarsılmış gereken süreyi değişebilir. İzole doku kesirler villus kriptalarının veya özellikle de villus veya kriptalarının (Şekil 2) bir karışımı içeren sonucudur. 30 için tüp doku sallayarak, üst üste hiçbir villus olarak crypt ayıklama tek adımda ulaşılabilir olabilir s. Bu kesirler sabit ve immün etiketleme için işlenir.
Bağırsak organoids Bodrum matris işlemleri olan Organoids Bodrum matris kubbeler üzerinden işlemleri olan hücre kurtarma çözümü kullanarak elde edilebilir. Genellikle bodrum matris ama sıcaklık 2-8 ° c olması gereken depolymerizing tarafından çözüm çalışır Dikkatli bir not dinamik mikrotübüller korunmuş olduğunu. Böylece, dinamik mikrotübüller, immün etiketleme için ve + EBs hücre gibi ipuçları, Bodrum matris fiksasyon önce kurtarma önerilmez. Ancak, mikrotübüller ayırt organoid hücrelerdeki çoğu nispeten istikrarlı ve bunlar (şekil 6) korunduğu görülmüştür. Aynı zamanda iyi IMMUNO-etiketleme için centrosomal ve bileske proteinler hem de hücre işaretleri çalıştı.
Fiksasyon protokolleri Formaldehit (PFA taze yapılmış) tersinir oluşturur bir nispeten hızlı etkili sabitleştirici çapraz bağlantılar ve % 4 İngiltere'de yılın örnekte mikrotübüller IMMUNO-etiketleme ve gama-tübülin ve Phalloidin ile boyama aktin filamentleri için iyi çalışıyor. Daha İngiltere'de yılın çözümleri gibi İngiltere'de yılın daha yüksek konsantrasyonlarda işe yaramadı iken IMMUNO-Örneğin, etiketleme için iyi ile crypt kök hücre niş içinde kök hücre işaretçileri Lgr5 ve Paneth hücre işaretleyici CD24 çalıştı % 1 oranında seyreltin.
Oxazolidin ilavesi mikrotübüller ve %3.7 PFA, %0.05 oxazolidin ve % 0,5 deterjan PHEMO arabellek (68 mM borular, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA ve 3 mM MgCl2)2 karışımından oluşan sözde PHEMO fiksasyon daha iyi korunması verir mükemmel mikrotübüller korunması antigenicity ödün verir. Bu da IMMUNO-etiketleme gama-tübülin, β-catenin ve E-cadherin ve phalloidin ile boyama aktin filamentleri için iyi çalışıyor. Ancak, 3D doku ve organoid kültürleri, PHEMO fiksasyon tutarsız sonuçlar üretti ve bu nedenle kullanılmamıştır.
Metanol nispeten iyi penetrasyon verir ve antigenicity korumak eğilimi bir koagulant sabitleştirici var. Fiksasyon % 100 metanol (-20 ° C) ile bazı büzülme tanıtır, ılımlı Morfoloji koruma sağlayan ve mikrotübüller, + ipuçları ve ninein 2D hücre kültürlerinde dahil olmak üzere birçok centrosomal antikorlar için çalışır. Ancak, bazı organoids bu fiksasyon yöntemi kullanarak zaman çöktü. Buna ek olarak, tüm kriptalarının, villus veya organoids antikorların penetrasyon başlangıçta bir sorun olduğunu biliyorum ama % 0,1 deterjan yıkama çözüm ve uzun süreli çamaşır ilavesi daha iyi sonuçlar elde.
Formaldehit ve metanol bir kombinasyonu daha önce Rogers ve ark. tarafından kullanılmaya başlanmış 20 IMMUNO-etiket EB1 için Drosophila. Formaldehit bir karışımı bir fiksasyon protokolüne dayalı ve metanol bu nedenle bağırsak dokusu-20 ° C soğuk ama 5 mM Sodyum karbonat Rogers tarafından kullanılan karışım üzerinden atlama % 3 formaldehit ve % 97'si metanol dayalı organoids için geliştirilmiş ve ark. 20 -20 ° C'de dondurucuda Ayrıca, örnekleri düzeltildi Bu amele özellikle immün etiketleme için iyi + ipuçları, küçük-170 ve EBs gibi ama aynı zamanda sabitleme ve immün etiketleme mikrotübüller ve aktin içinde doku ve 3D organoids için mükemmel oldu. Çok iyi Yapısal koruma belirgin ve ninein için etiketleme daha tutarlı bir şekilde metanol ile çalışabiliyordu antigenicity gama-tübülin ve ninein, gibi centrosomal proteinler yanı sıra birkaç hücre iskeleti ve ilişkili proteinler için korundu fiksasyon.

Epiteli ile apico Bazal polarite oluşumu geliştirmede temel bir süreçtir ve mikrotübüller ve centrosomal proteinlerinin dramatik bir yeniden yapılanma içerir. Merkezi bir konumda bulunan bir centrosomal Mikrotubul Merkezi düzenleme yayılan (MTOC) birçok hayvan hücrelerinde belirgin ve bu nispeten düz hücreler için de uygun bir Radyal Mikrotubul dizi. Buna ek olarak, bu bağırsak gibi yassı epitel hücreleri daha iyi şekil ve bu hücrelerin özel işlevlerini destek olmayan Radyal transcellular Mikrotubul diziler topla. Bu dramatik yeniden düzenleme-in mikrotübüller transcellular mikrotübüller1,2 anchorage için sorumlu olur centrosome tepe ve şekillendirme, apikal centrosomal MTOCs (n-MTOCs) hareket elde edilir , 3 , 4 , 5.
Epitel farklılaşma ve ilişkili Mikrotubul yeniden yapılanma ile ilgili bilgilerimizi çoğunu yapmak değil göstermek içinde vivo doku mimari 2D vitro hücre katmanları araştırmalar geldi. Taklit ediyorlar vivo içinde mimari ve geliştirme gibi geliştirme Clevers ve iş arkadaşları6tarafından öncülük 3D vitro organoid kültürlerin büyük bir teknolojik ilerleme temsil eder. Epitel farklılaşma hiyerarşisini bağırsaklarda belirgindir; kök hücre alt kriptalarının olgunlaşmamış transit çoğalırlar ve nereye onlar tamamen önce ayrıştırılan haline crypt küçük bağırsak villus veya kolon yüzey üzerine kadar göç gibi yavaş yavaş ayırt hücreleri yükseltecek ortaya çıkmasına Lümen7dökmek. Önemlisi, bu bağırsak organoids nerede kök hücre niş hücrelerden daha sonra alt ve kist bölge doğru yavaş yavaş ilerliyor farklılaşma kök hücreleriyle crypt benzeri tomurcukları oluşturmak şekillendirme kistler prolifere olarak çoğaltılır, hangi villus benzeri8olur. Bağırsak organoid, bu nedenle sadece Mikrotubul ve epitel farklılaşma ama çok sayıda diğer proteinler yanı sıra ilaç ve gıda ile taranması için ideal bir platform sağlayan sırasında centrosomal yeniden yapılanma çalışması için güçlü bir modelini temsil bileşikler potansiyel terapötik yararları9,10.
Organoids canlı görüntüleme için floresan öğesini proteinlerin uygundur ve her ikisi de Tak- ve knock-out organoids CRISPR/Cas9 gen11,12düzenleme kullanarak oluşturulabilir. Ancak, ifade ve yerelleştirme belirlenmesi için endojen proteinlerin kurulması özellikle tagged proteinler davranışını doğrulamak önemlidir. 3D organoids IMMUNO-etiketleme Bodrum matris veya izole ex vivo yetiştirilen kültür yemekleri 2D yetiştirilen hücrelerin daha karmaşık dokudur. Fiksasyon iletişim kuralı hala antikor antigenicity (Yani, antikorlar bağlama epitopları) koruyarak organoids hassas 3D mimari korumak gerekiyor. Örneğin, % 4 paraformaldehyde (PFA) genellikle bir sabitleştirici kullanılır ama nispeten hızlı oyunculuk sabitleştirici ve iyi morfolojik koruma verir iken, bizim deneyim sık antigenicity kaybolmasına ve çoğu için uygun değildir centrosomal antikor. 3D yapılar ve doku nüfuz yeteneği sabitleştirici ve antikorlar da düşünülmelidir. Bu amaçla, biz değiştirdiniz ve doku yalıtım ve dolaylı IMMUNO-3D vitro organoids ve ex vivo etiketleme için gelişmiş protokoller bağırsak dokusu izole. Biz küçük bağırsak kriptalarının ve villus ve kolon doku izole etmek ve 3D organoids yalıtım sabitleme ve IMMUNO-etiketleme Bodrum matris içinde alternatif olarak için bir iletişim kuralı eklemek nasıl açıklar. Biz üç alternatif fiksasyon Protokolü IMMUNO mikrotübüller ve centrosomal proteinler, ninein gibi ve Mikrotubul artı uç izleme proteinler (+ ipuçları), (Ayrıca başvurular8, bkz: EB proteinler ve CLIP-170 gibi etiketleme için mevcut 13). Biz de artılarını ve eksilerini her iletişim kuralıyla ilişkili tartışıyorlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

Vivo doku mimarisi ve morfogenetik taklit 3D vitro organoids gelişiyle hücre ve gelişim biyolojisi anahtar biyolojik sorular çalışma yeteneği büyük ölçüde ilerlemiştir. Buna ek olarak, organoids ile birlikte son teknik gelişmeler gen düzenleme ve viral gen teslim tıbbi araştırma ve geliştirme hastalıklarının tedavisi için yeni ilaçların ilerlemek vaat ediyor. Vitro Bodrum matris yetiştirilen Organoids çeşitli proteinlerin işlevini ve davranış eğitimi için güçlü model sistemleri sağlar ve canlı görüntüleme için floresan öğesini proteinlerin uygundur. Ancak, ifade ve yerelleştirme endojen proteinlerin kurulması ex vivo doku ve vitro organoids tagged proteinlerin davranışını doğrulamanız önemlidir. Bu amaçla biz geliştirdik ve doku yalıtım, fiksasyon ve immün etiketleme iletişim kurallarını mikrotübüller, centrosomal ve ilişkili proteinler ex vivo bağırsak dokusu ve vitro bağırsak organoids lokalizasyonu için değiştirildi. Ayrıca antikor antigenicity koruyarak ve iyi penetrasyon ve izni sabitleştirici ve antikorlar etkinleştirme sırasında organoids/doku 3D mimari korumak sabitleştirici amaç içindi. Tüm istikrarlı mikrotübüller soğuk maruz depolymerizes ve bu çeşitli protokoller değiştirirken önemli bir faktör oldu. Biz 3 mM EDTA kolon kriptalarının için yeterli iken ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) konsantrasyonu 3 mm 30 mM için artan villus ve ince bağırsak kriptalarının verimli dekolmanı verdi bulundu. Gelişmiş formaldehit/metanol fiksasyon protokolü de antigenicity etkili etiketleme mikrotübüller, aktin ve bitiş (EB) proteinler için koruma sırasında çok iyi Yapısal koruma verdi. Metanol Protokolü daha tutarlı bir şekilde çalıştı, ancak aynı zamanda centrosomal protein ninein için çalıştı. Daha fazla gelen izole veya Bodrum matris içinde kalan organoids ile fiksasyon ve IMMUNO-etiketleme mikrotübüller ve ilişkili proteinler elde edilebilir kurduk.

IMMUNO-etiketleme için bağırsak dokusu yalıtım Kolon ve ince bağırsak açıklanan doku yalıtım protokollerde korunması ve mikrotübüller ve ilişkili proteinler IMMUNO etiketleme için ancak kök hücre canlılığı ve organoid üretimi (Resim 1 ve Tablo 1 için optimize ). Crypt oluşturmak için amacı olduğunu ve gibi villus hizip (mukus ve diğer doku yoksun) temiz mümkün olduğunca EDTA ve soğuk yapısını korumak ve mikrotübüller neden buz soğuk çözümleri ile bozulumu önlemek maruz en aza indirerek tüm ama istikrarlı mikrotübüller bozulumu. Şekil 2 kesirler 2 ve 3 görüntüleri örneklerden izole küçük bağırsak dokusu, gösterir kesir villus ve kriptalarının (şekil 2A, B), kesir 3 sırasında karışımı içeren 2 esas olarak kriptalarının (şekil 2C içerir D).
Fiksasyon ve izole bağırsak dokusu IMMUNO etiketleme Tek tek veya kombine kesirler sonra fiksasyon için işlenmiş olan ve immün etiketli fiksasyon da dahil olmak üzere bir dizi aracılığıyla, deterjan, engelleme, antikor, çözümler, son villus/kriptalarının yeniden askıya almadan önce yıkama cips montaj medyada, slaytlara aktarma ve cam coverslips ile kapsayan. Kriptalarının ve villus üzerinde confocal mikroskop görüntüsü.
İyi korunması ve mikrotübüller ve aktin villus ve kriptalarının etiketlerine göre aşağıdaki tarafından elde:-20 ° C'de tekrarlanan % 0,1 deterjan ve % 1 serum içeren ve PBS içinde %0,1 ile engelleme PBS yıkama, formaldehit/metanol fiksasyon bir arada deterjan ve % 10 serum, birincil antikorlar 4 ° C'de ve oda sıcaklığında (şekil 3) ikincil antikorlar 2 h, gecede kuluçka izledi. Formaldehit/metanol fiksasyon da iyi etiketleme için çalıştı + EBs ve CLIP-170 izole kriptalarının ve villus (şekil 4) gibi ipuçları. Kafes boyunca Derneği istikrarlı mikrotübüller villus örnekleri (şekil 4 c) görülebilir mikrotübüller (kuyruklu da bilinir) artı sonunda EB3 birikimleri kriptalarının (şekil 4A), belirgin önemli katkılarda bulunmuştur. Farklı yerelleştirme klip-170 ve p150Tutkalla yapıştırılmış (dynactin birimi) apikal n MTOCs izole villus (şekil 4B) içinde açıkça belli. Fiksasyon formaldehit/metanol protokolü ile tutarlı bir şekilde izole bağırsak dokusunda bizim Pep3 antikor fare ninein karşı kullanarak ninein yerelleştirme için işe yaramadı. Ancak, metanol fiksasyon-20 ° C'de aynı yıkama tarafından takip ve formaldehit/metanol gelince çözümleri engelleme ninein izole kriptalarının ve villus (şekil 5; başvuru8) içinde çok iyi yerelleştirme verdi. Ninein apikal centrosomes konsantre olmakla ilginçtir, bazı birikimi hücre Bankası, izole kriptalarının (şekil 5) bazı hücrelerde belirgin oldu. Bu belirsiz etiketleme veya yalıtım yordamı geciktirmek bir sonucu nedeniyle olup fiksasyon (ve böylece koruma etkileyen) daha fazla araştırma gerekir. Ancak, metanol-sabit (-20 ° C) cryostat ( şekil 3bi 8' bakınız) villus bölümlerini de ninein o ninein düşündüren bazı hücrelerde temel hücre, mikrotübüller Bazal nüfusu ile de ilişkilendirebiliriz ortaya koydu.
Fiksasyon ve IMMUNO-Bodrum matris izole organoids, etiketleme Küçük bağırsak organoids oluşturulan ve Bodrum matrix üç hafta veya daha uzun (şekil 6A; başvuru6,15) büyüdü. Nezle (4 ° C) hücre kurtarma çözümü organoids Bodrum matris yalıtmak için kullanıldı. Depolymerized Bodrum matris çözüm organoids ile tüpler için transfer ve fiksasyon ve immün etiketleme önce centrifuged. Bu çok temiz hazırlıklar üretilen ve organoids iyi bir ulaşım çeşitli çözümler için izin verdi. Organoid i. etki alanları içinde farklılaşmış hücre istikrarlı apico Bazal mikrotübüller içeriyor; Bunlar etiketli çoğu durumda (şekil 6B, C) iyi ve EB1 Mikrotubul kafes (şekil 6E; başvuru13) da görülebilir. Ancak, soğuk hücre kurtarma çözümü hangi belirgin bazı örnekleri (ki büyüyen mikrotübüller artı sonuna bağlamak) EB1 kuyruklu yıldızlar Bazal crypt etki alanlarındaki (şekil 6F eksikliği ile dinamik mikrotübüller bozulumu içinde neden olabilir ). Diğer örnekleri, astral (dinamik) mikrotübüller (şekil 6D) korunduğu görülmüştür. Organoid yalıtım fiksasyon önce ve immün etiketleme de bileske proteinler, ninein, klip-170 ve müsin goblet hücreleri ve chromogranin A enteroendocrine hücreler için gibi hücre işaretçileri için çalıştı.
Fiksasyon ve immün organoids Bodrum matris içinde etiketleme Şekil 7 kist aşamada (A-C) ve yeraltı türbesi geliştirme (D), formaldehit/metanol içinde sabit ve immün etiketli mikrotübüller ve ninein için erken bir aşamada bir organoid gösterir. İyi Mikrotubul korunması ve etiketleme gibi apikal n-MTOCs, ninein için etiketleme belirgin idi. Şekil 8A, B 6 organoid metanol protokolü ile sabit ve etiketli bir gün mikrotübüller ve EB1 içinde crypt etki alanını gösterir. Mikrotübüller ve EB1 kuyruklu yıldızlar iyi korunması dinamik mikrotübüller korunması düşündüren açıktı.
Organoids Ayrıca Bodrum matris içinde kalan süre sabit ve immün etiketli edildi. Bu yordamı dezavantajları olmasına rağmen her iki durumda da daha az sık sık ne zaman % 0,1 deterjan sabitleştirici eklenmiştir sabitleştirici zavallı penetrasyonu ve bindirme antikor (şekil 8B), Bodrum matris içinde olmak ve/veya çözümleri yıkayın. Buna ek olarak, % 4 İngiltere'de yılın vermedi koru Bodrum matris iyi ama neden bu çözülmeye, bu yüzde 1'daha az çok olmasına rağmen İngiltere'de yılın.Metanol fiksasyon, öte yandan, bazen organoid çöküşü indüklenen.
Gibi bazı antikorlar karşı kök hücre işaretçisi Lgr5 ve Paneth hücre işaretleyici ile etiketleme CD24% 4 İngiltere'de yılın, metanol veya formaldehit/metanol iletişim kuralları ile başarısız oldu. Ancak, organoids Bodrum matris içinde yüzde 1'sabitleme PFA PBS ile % 0,1 deterjan oda sıcaklığında, Lgr5 ve CD24 için etiketleme neden (Şekil 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig1.jpg"> 
Şekil 1: yalıtım küçük bağırsak villus ve kriptalarının. Küçük bağırsak villus ve crypt yalıtım fiksasyon ve immün etiketleme önce anahtar adımları akış diyagramı. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig2.jpg"> 
Şekil 2: izole villus ve fare bağırsağı üzerinden kriptalarının. Bağırsak kesirler villus (büyük oklar) ve kriptalarının (küçük oklar) gösterilen aydınlık alan mikroskop görüntüleri. (A, B) Kesir 2 villus ve kriptalarının karışımı içeren ve morfolojisi villus ve mezar odası korunması Bbelirgindir. (C, D) Kesir 3 yalıtım kriptalarının ve yokluğu villus ve bozulmamış kriptalarının çatallanmış bir crypt içinde Cdahil gösterir. Ölçek çubukları = 500 mikron (A, C); 100 mikron (B, D). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig3.jpg"> 
Şekil 3: izole küçük bağırsak villus ve crypt formaldehit/metanol içinde sabit ve immün etiketli mikrotübüller ve aktin. Belirtilen farklı hücre tipleri ile villus ve crypt epitel(a)şeması. Vurgulanan kutuları B ve Cyansıma temsilcisi bölgeleri gösterir. (B, C) İ. (B) ve 30 mM EDTA kullanarak ve formaldehit/metanol içinde sabit, % 1 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS yıkanmış, PBS içinde bloke ince bağırsak dan izole Bazal yeraltı türbesi (C) bir parçası üzerinden confocal optik bölümleri % 10 keçi serum ve %0,1 deterjan ve etiketli mikrotübüller ile fare monoklonal Anti-tübülin antikor (yeşil) ve aktin ile tavşan poliklonal anti-β-aktin antikor (kırmızı) içeren. İyi apico Bazal korunmuş Mikrotubul demetleri villus ve crypt hücrelerinde belirgin ve aktin konsantre Lümen (ok) karşı karşıya apikal bölgede görülebilir. Ölçek çubukları 5 mikron =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig4.jpg"> 
Şekil 4: İzole küçük bağırsak crypt ve villus formaldehit/metanol içinde sabit ve immün etiketli mikrotübüller, EB3, p150Tutkalla yapıştırılmışve CLIP-170. Confocal optik bölümleri crypt ve villus bölgelerin 30 mM EDTA kullanarak ince bağırsak izole ve formaldehit/metanol, % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan, içeren PBS yıkanmış sabit % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan, içeren PBS bloke ve IMMUNO-etiketli. (A)Crypt tavşan poliklonal α-tübülin antikor (kırmızı) ve fare monoklonal EB3KT36 antikor (yeşil) ile etiketli ve DNA'ın apico Bazal mikrotübüller ve EB3 kuyrukluyıldızlar gösterilen DAPI (mavi) ile lekeli. Ters tek kanal görüntü EB3 kuyruklu yıldızlar iyi istikrarlı mikrotübüller yanı sıra dinamik korunması düşündüren Bazal crypt hücreler boyunca açıkça gösteriyor. Epitel hücreleri etiketli tavşan poliklonal klip-170 antikor ile (B) Villus (kırmızı, bkz: Ayrıca16başvuru) ve fare monoklonal p150Tutkalla yapıştırılmış antikor (yeşil) apikal gösterilen eş yerelleştirme. Ters tek kanal görüntüleri aşağıda gösterilmektedir. (C) Villus hücreleri tavşan poliklonal α-tübülin antikor (kırmızı) ve fare monoklonal EB3-KT36 antikor (yeşil) ile etiketli ve DNA'ın EB3 ile apico Bazal mikrotübüller kafes boyunca gösterilen DAPI (mavi) ile lekeli. Ters tek kanal görüntü EB3 kuyruklu yıldızlar ve kafes dernek öneriyor iken EB3 kafes Derneği büyütülmüş görüntü vurgulanır. Ölçek çubukları 5 mikron =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig5.jpg"> 
Şekil 5: izole kolon crypt metanol, ninein ve E-cadherin, immün etiketli sabit ve DAPI ile lekeli. Bazal confocal optik bölümü ve bir crypt transit yükseltecek bölgesinin 3 mM EDTA kullanarak kolon izole ve metanol içinde sabit, % 1 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS yıkanmış ve % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS engellendi. Crypt tavşan poliklonal ninein antikorlar ile etiketli oldu (Pep3, Ayrıca bkz: başvuru8, kırmızı) ve fare monoklonal E-cadherin antikor (yeşil) ve DAPI (mavi) ile lekeli. Ters tek kanal görüntü sadece ninein gösterir. Görüntü iyi korunmuş bir lahitte E-cadherin ile tek tek hücreleri ve ninein apikal centrosomes konsantre ana hatlarını ortaya gösterir. Sabitleştirici ve antikorlar iyi penetrasyon ve antigenicity korunması önerir. Ölçek çubuğu 5 mikron =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig6.jpg"> 
Şekil 6: Organoid geliştirme, fiksasyon ve IMMUNO-etiketleme, izole organoids. (A)faz kontrast görüntüler gösteren farklı gelişimin organoid hücre toplamları üzerinden kist bud başlatma ve tamamen için kurulan crypt ve villus etki alanları ile organoids.(B-F) 4 ° C'de % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan, içeren PBS % 10 keçi içeren PBS engelleme yıkama formaldehit/metanol fiksasyon ardından (10 dakika) hücre kurtarma çözümü kullanarak Bodrum matris izole organoids aracılığıyla confocal optik bölümleri Serum ve %0,1 deterjan ve mikrotübüller, β-catenin ve EB1 IMMUNO etiketleme. (B) Organoid kist mikrotübüller (mavi) ve β-iyi Mikrotubul koruma açığa ve en hücreler etiketleme catenin (kırmızı) için etiketli. (C) ayrı apico Bazal mikrotübüller bir organoid kist genişlemiş bu epitel hücrelerinden belirgindir. (D) astral (dinamik) mikrotübüller (ok) dahil olmak üzere iğ gösterilen mikrotübüller için etiketli hücre bölünmesi. (E, F) İ. etki alanı (E) ve çok az EB1 kuyruklu yıldızlar bile Bazal crypt içinde bu dinamik düşündüren görülür iken bazı EB1 villus, özellikle de istikrarlı mikrotübüller kafes boyunca etiketleme gösterilen crypt etki alanı (F) organoid bölgeler mikrotübüller korunmuştur değil. Ölçek çubukları = 20 mikron (A); 2 mikron (D); 5 mikron (B, C, E-F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig7.jpg"> 
Şekil 7: Organoids formaldehit/metanol Bodrum matris içinde sabit ve immün etiketli mikrotübüller ve ninein. Organoids confocal optik bölümleri formaldehit/metanol içinde sabit, yıkanmış ve % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS bloke ve Bodrum matris içinde kalan süre etiketli. (A-C) Organoid kist Mikrotubul (yeşil) ve ninein (Pep3; başvuru8, kırmızı) için etiketli ve DAPI ile (Birleştirilen görüntüyü A gösterilen mavi) lekeli ve mikrotübüller (B) ve ninein (C) için tek kanallı görüntüler ters. Görüntüler apico Bazal mikrotübüller ve apikal ninein yerelleştirme, telkin organoid çok iyi yapısal korunması ve penetrasyon antikorların yanı sıra ilişkisiz antikorları temizlemek göstermektedir. (D, E) Sabit ve yukarıdaki gibi etiketli crypt ve tekrar gösteren mükemmel Yapısal koruma geliştirme, etiketleme ve sıra takas Organoid. Farklı apico Bazal mikrotübüller ve apikal n-MTOC ninein yerelleştirme belirgin ve Dkutulu bölgede büyütülmüş görüntü (E) vurgulanmış. Ölçek çubukları = 10 mikron (A-D); 5 mikron (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig8.jpg"> 
Şekil 8: metanol Bodrum matris içinde sabit ve mikrotübüller ve EB1 IMMUNO etiketli Organoids. Organoids confocal optik bölümleri metanol içinde sabit, yıkanmış ve % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS bloke ve etiketli, Bodrum matris içinde kalan süre. (A)kist etki alanından bir tam gelişmiş organoid etiketli ile tavşan poliklonal α-tübülin (kırmızı) ve fare monoklonal EB1 (yeşil) antikorları apico Bazal mikrotübüller, gösterilen Miller (ok) iki sayesinde bunun bölünen hücreler ve farklı EB1 kuyruklu yıldızlar. Bazı bindirme ilişkisiz EB1 antikorların belirgindir. Ancak, iyi yapısal korunması ve etiketleme mikrotübüller ve EB1 görülmektedir. EB1 kuyruklu yıldızlar varlığı dinamik mikrotübüller korunur olduğunu göstermektedir (A, ters çevir). (B) ters görüntü α-tübülin antikor önemli antikorlar ile etiketleme tuzağa çevredeki Bodrum matris içinde (ok) gösterilen organoid kist bölgesinin. Ölçek çubukları 5 mikron =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig9.jpg"> 
Şekil 9: %1 Bodrum matris içinde sabit Organoids İngiltere'de yılın ve immün etiketli Lgr5 ve CD24. % 1 Bodrum matris içinde sabit organoids confocal optik bölümleri % 0,1 deterjan, içeren PBS PFA PBS içinde % 1 keçi serum ve % 0.1 deterjan ile yıkanmış ve Lgr5 ve CD24 karşı antikor taşır. (A, B) Paneth hücreleri CD24 için (kırmızı) pozitif gösterilen bir mezar odası etki alanı içinde kök hücre niş. Confocal ve faz kontrast görüntüler Aiçinde birleştirilmiş. B CD24 tek kanal etiketleme gösterir. (C) kök hücre bölge Lrg5 olumlu kök hücre gösterilen bir mezar odası etki alanı içinde. Ölçek çubukları 10 mikron =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56662/56662table1.jpg"> 
Tablo 1: zaman çizelgesi küçük bağırsak crypt ve villus tecrit ve fiksasyon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662table1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

15.3K Görüntüleme.  University of East Anglia. Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.

Video: Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically diverse. Inroads have been made in understanding the roles of distinct cortical interneuron subgroups, however, there are still many mechanisms to be worked out that may contribute to the development and maturation of different types of GABAergic cells. Moreover, altered GABAergic signaling may contribute to phenotypes of autism, schizophrenia and epilepsy. Specific Cre-driver lines have begun to parcel out the functions of unique interneuron subgroups. Despite the advances in mouse models, it is often difficult to efficiently study GABAergic cortical interneuron progenitors with molecular approaches in vivo. One important technique used to study the cell autonomous programming of these cells is transplantation of MGE cells into host cortices. These transplanted cells migrate extensively, differentiate, and functionally integrate. In addition, MGE cells can be efficiently transduced with lentivirus immediately prior to transplantation, allowing for a multitude of molecular approaches. Here we detail a protocol to efficiently transduce MGE cells before transplantation for in vivo analysis, using available Cre-driver lines and Cre-dependent expression vectors. This approach is advantageous because it combines precise genetic manipulation with the ability of these cells to disperse after transplantation, permitting greater cell-type specific resolution in vivo.

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

GABAergic cortical interneuron progenitors disperse, develop and synaptically integrate into a host cortex after transplantation. These cells can be easily transduced before transplantation for in vivo studies of genetically modified GABAergic precursors. Here, we show viral labeling techniques to target specific interneuron subgroups using existing Cre lines and Cre-dependent reporters.

Viral-aracılı Etiketleme ve medial Gangliyonik Eminence Transplantasyon (MGE) Hücreler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Çalışmalar

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Gelişim Biyolojisi

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. Several commercial extracellular matrix products are available as hydrogels or membranes, but these do not possess tissue-specific biological activity. Because perfusion decellularization is usually not possible with human heart tissue, we developed a 3-step immersion decellularization process. Human myocardial slices procured during surgery are first treated with detergent-free hyperosmolar lysis buffer, followed by incubation with the ionic detergent, sodium dodecyl sulfate, and the process is completed by exploiting the intrinsic DNase activity of fetal bovine serum. This technique results in cell-free sheets of cardiac extracellular matrix with largely preserved fibrous tissue architecture and biopolymer composition, which were shown to provide specific environmental cues to cardiac cell populations and pluripotent stem cells. Cardiac extracellular matrix sheets can then be further processed into a microparticle powder without further chemical modification, or, via short-term pepsin digestion, into a self-assembling cardiac extracellular matrix hydrogel with preserved bioactivity.

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

This protocol describes the complete decellularization of human myocardium while preserving its extracellular matrix components. Further processing of the extracellular matrix results in the production of microparticles and a cytoprotective self-assembling hydrogel.

İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Fetal Intestinal Organoidler Kullanılarak Tüp Bebek Teyidi--Weaning Geçiş

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Viral-aracılı Etiketleme ve medial Gangliyonik Eminence Transplantasyon (MGE) Hücreler

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling