Bu protokol, hayvan türlerinde doğurganlık ve biyolojik çeşitliliğin korunması için çok önemli olan vitrifikasyon ile bilinen kriyopreservation tekniği ile kedi yumurtalarının uzun süreli korunması için yararlıdır. Vitrifikasyonun en önemli avantajları, 17 dakikadan daha kısa sürede tamamlanabildiği için hızı ve sıvı nitrojen varsa alan koşullarındaki fizibilitesidir. Evcil kedi vahşi nesli tükenmekte olan kedi için uygun bir modeldir.
Kriyoppreservation protokollerinin geliştirilmesi ve optimizasyonu kedi koruma programları için gamet biyobankaların kurulmasını sağlayacaktır. Bir satırda üç konik kuyular ile bir Repro vitrifikasyon plaka sıyrık hazırlayarak başlayın. Birinci kuyuya 20 mikrolitre denge çözeltisi, ikinci ve üçüncü kuyulara ise 300 mikrolitre vitrifikasyon çözeltisi ekleyin.
Kümülüs yumurta komplekslerini veya COC'leri dengelemek için, bir veya daha fazla kompleksi ilk kuyunun altına aktarmak için küçük delikli bir pipet kullanın. Yavaşça damla sınırına 20 mikrolitre denge çözeltisi ekleyin ve üç dakika bekleyin, sonra başka bir 240 mikrolitre denge çözeltisi ekleyin ve dokuz dakika bekleyin. Beklerken sıvı nitrojen içeren bir kutu hazırlayın ve deney veya kedi tanımlama koduyla vitrifikasyon desteği etiketleyin.
Kutuyu ve desteği stereo mikroskobun yakınına koyun. COC'leri dengeledikten sonra, 90 saniyeden daha kısa bir sürede vitrifikasyon yapın. COC'leri vitrifiye etmek için, küçük delikli pipeti ikinci kuyudan vitrifikasyon çözeltisi ile doldurun.
CoC'leri ilk kuyunun altından alın ve ikinci kuyunun yüzeyine taşıyın. Pipeti vitrifikasyon solüsyonuyla yıkayın, ardından COC'leri kuyunun başka bir bölgesine taşıyın ve çevredeki çözeltiyi karıştırın. Pipeti kuyunun başka bir alanından gelen çözeltiyle doldurun.
COC'leri hareket ettirin ve çevredeki ortamı pipetle karıştırın. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, pipeti üçüncü kuyudan vitrifikasyon çözeltisi ile yıkayın ve COC'ları üçüncü kuyunun dibine taşımak için kullanın.
Yine, çevreleyen çözeltiyi karıştırın. Pipeti kuyunun başka bir alanından gelen solüsyonlarla doldurduktan sonra, COC'leri hareket ettirin ve çözeltiyi karıştırın. Bu işlemi tekrarlayın.
Pipet ucunu kuyunun başka bir alanından gelen vitrifikasyon çözeltisi ile doldurun ve coc'ları ucuna yakın vitrifikasyon desteğinin şeridine yüklemek için kullanın, sonra fazla ortamı aspire edin. Hemen sıvı nitrojen vitrifikasyon desteği daldırma ve onu kapatmak için kelepçeler kullanın, o batık kalır emin olun. Yüklü vitrifikasyon desteklerini bir kadehte saklayın ve ısınına kadar bir depolama sıvı azot tankında saklayın.
Isıtma aşamasını stereo mikroskoba yakın yerleştirin ve 38 santigrat dereceye açın. Sahnenin üstündeki Petri kabının kapağını ısıtın, ardından vitrifikasyon desteklerini depolama tankından sıvı nitrojen içeren bir kutuya aktarın. Isınmak için her vitrifikasyon desteği için bir sıra Repro plaka hazırlayın.
İlk kuyuya 300 mikrolitre seyreltme çözeltisi, ikinci ve üçüncü kuyulara 300 mikrolitre yıkama çözeltisi ekleyin. Çözülme solüsyonu kuvözden alın ve Petri kabının kapağına 100 mikrolitre bırakın. Sıvı azot içinde vitrifikasyon desteği açmak için kelepçeler kullanın.
Petri kabının kapağını stereo mikroskobun altına yerleştirin, ardından vitrifikasyon desteğini hızlıca alın ve şeridini damlaya batırın ve tüm COC'ler ayrılana kadar hareket ettirin. Boşalır boş alır almaz desteği damladan çıkarın, ancak COC'leri çözülme çözeltisinde bir dakika bekletin. Bir pipeti seyreltme çözeltisi ile doldurun ve kokları erime çözeltisinden seyreltme çözeltisi ile ilk kuyunun dibine taşımak için kullanın.
COC'leri üç dakika orada bırakın. Pipeti ikinci kuyudan yıkama solüsyonuyla yıkayın, sonra COC'leri alın ve ikinci kuyunun dibine taşıyın. Beş dakika bekleyin.
Pipeti üçüncü kuyudan bir çözeltiyle yıkayın ve COC'leri ikinci kuyudan üçüncü kuyunun yüzeyine taşımak için kullanın. COC'ların üçüncü kuyunun dibine dokunmasını bekleyin. Sonra başka bir kuyu alanı ile işlemi tekrarlayın.
Bittiğinde, pipetkültür orta ile yıkayın ve bir kültür çanak için yumurta hareket ettirin. Gametlerin büyük çoğunluğu bu protokole göre yumurta vitrifikasyon ve ısınma dan sonra hayatta kalır. Floresan diasetat ve propidium iyodür ile boyanmış canlı vitrifiye ısıtılmış kedi kümülüs oosit kompleksinin temsili bir resmi burada gösterilmiştir.
Bu tablo, in vitro olgunlaşma için tasarlanmış yumurtaların ısınma sonrası verilerini gösteren vitrifikasyon sonrası sağkalım yüzdesini göstermektedir. 435 oositten 395'i hayatta kalarak ,%90,8'lik bir ısınma sonrası canlılık elde etti. Ancak, Bazı morfolojik değişiklikler ısınma dan sonra fark edilebilir.
En sık görülen morfolojik anormallikler ooplazm şekli ve granülasyon değişiklikleri, kümülüs hücrelerinin kısmi veya bazen toplam kaybı ve zona pellucida kırıklarıdır. Bu yordamı denerken, medyayı kullanmadan önce doğru sıcaklıkta olacak şekilde önceden hazırlamayı ve hücre toksisitesini önlemek için protokol sıcaklıklarını ve zamanlamalarını izlemeyi unutmayın. Protokol diğer türlerin yumurtalarına da uygulanabilir.
Başarılı olursa, bu da nesli tükenmekte olan kedi biyolojik çeşitliliğin korunması için mikrop plazm bankacılık katkıda bulunabileceği.
