Yazarlar hayvancılık için &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; tarafından destek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Avrupa Birliği 6. Çerçeve Programı hibe &quot;Embryomics&quot; tarafından ve ANR hibe &quot;tarafından, Michael Schubert ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 ve ANR-11-JSV2-002-01) fonları tarafından desteklenen ANR- Jean-François Nicolas ve Nadine Peyriéras 10-BLAN-121.801 Dev-Süreci &quot;. João Emanuel Carvalho bir FCT doktora bursu ile finanse edilmektedir (SFRH / BD / 86878/2012). Burada anlatılan vektörler talepleri yazarlara doğrudan ele alınabilir.

Araçların ve Reaktifler 1. Hazırlık <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pasteur pipet aktarın <ol><li> Farklı hızlarda bir alev üzerinde 230 mm uzunluğunda Pasteur pipetler çekerek, farklı uç çapları transfer Pasteur pipetler bir dizi oluşturun. Konik aspirasyon düzgün ve ince kontrolü için mümkün olduğunca uzun olduğundan emin olun. </li><li> Bir elmas çizici ile, dik pipet uzunluğu bir hat boyunca pipet çizmeyin. Her iki elinizle, künt kesim oluşturmak için kendi uzunluğuna pipet paralel çekin. Hızla alev lehçe ucu sızdırmazlık olmadan pipet. </li><li> , 200-400 mikron (mikron çapında 500 civarında) döllenmiş yumurta, 600 mikron döllenmemiş oosit için 300-400 mikron (çapı 150 mikron civarında): oosit / embriyo aşamasında olan ucunun çapı pipetle için Vary taranmış neurulae için. Ağız-izlenen aspirasyon tüpü ile kullanın pipetler bir çanak oosit / embriyo transferbaşka. </li></ol></li><li> Enjeksiyon iğneleri <ol><li> RNaz ücretsiz koşulları sağlamak için eldiven ile kılcal işleyin. OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, uzunluğu 10 mm boyutlarında olan Filament kılcal ile borosilikat camını kullanın. </li><li> Kılcal damarlar Malzeme Listesi&#39;nde tanımlanan ısıtma telli iğne çektirmenin türüne çekti, aşağıdaki ayarları kullanın: Isı 600, Velocity 80, Zaman 60, Basınç 200 veya 300. Aksi takdirde 50 çekin, şekil, hangi sağlamak Başarılı enjeksiyonlar için önemli, aşağıdaki özelliklere sahip olan, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, 4-8 um dış uç çapı 2 cm konik uzunluğu. NOT: İğneler yumurtlama sezonu öncesi çekti ve sezon boyunca kullanılır. </li></ol></li><li> % 5 Fenol Kırmızısı stok çözeltisi (4x) <ol><li> Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın. </li><li> 0.22 mikron filtre tüpünde, fenol kırmızı bir toz halinde 25 mg tartılır. </li><li> Için DNase- ve RNaz içermeyen su, 0.5 ml ilave ediliriçeren toz tüpü. </li><li> Çözelti filtre-sterilize ve enjeksiyon iğnesi tıkayabilecek kristallerin uzaklaştırılması için, oda sıcaklığında 18,000 x g&#39;de 3-5 dakika boyunca dönerler. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın veya -20 ° C&#39;de 250 ul alikotları saklayın. </li></ol></li><li> / Ml poli-lizin çözeltisi, 0.25 mg <ol><li> Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın. </li><li> Damıtılmış su, 20 ml poli-L-lisin, 5 mg eritin. -20 ° C&#39;de, 5 ml lik bir kısmı. </li><li> Poli-lisin-kaplanmış çanak oositlerin tekrarlanabilir ve sağlam yapışmasını sağlamak için sadece bir kez hemen çözülmüş kısım kullanın. </li></ol></li><li> mRNA sentezini <ol><li> Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın. </li><li> (37 ° C&#39;de, genellikle 2 saat süre ile,) uygun enzim ile ilgili DNA&#39;nın 5 ug linearize. Sindirim eksiksiz olduğunu kontrol etmek için, 20 dakika boyunca 150 W TBE tampon maddesi içinde bir% 1 agaroz TBE jeli üzerinde sindirim karışımı hacminin% 2 çalıştırın. </li><li> Linea Özü24: 1 fenol (pH 8.0): kloroform: 25 rized DNA izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 18.000 xg&#39;de 10 dakika ve sulu (üst) faz toplamak için Vortex. </li><li> 24 ile tekrar ektraktlayınız: 1 kloroform: izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 10 18.000 x g&#39;de dakika ve sulu faz toplamak için Vortex. </li><li> 10: 300 doğrusallaştırılmış DNA: 3 M sodyum asetat (pH 5.2): -20 ° C de bir gece% 100 etanol 100 ile doğrusallaştırılmış DNA&#39;nın çökeltilmesi. </li><li> 4 ° C&#39;de 18,000 x g&#39;de santrifüj 20 dk. % 70 etanol içinde durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 18,000 x g&#39;de santrifüj 10 dk. RNase içermeyen su içinde, kuru ve tekrar süspansiyon 0.5 ug / ml bir son konsantrasyonda olsun. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir polimeraz ile bir mRNA sentez kiti kullanılarak doğrusallaştırılmış DNA&#39;nın 1 ug yazıya. </li><li> 1 fenol (pH 4,7): 5 ile mRNA Özü kiti ile sağlanan kloroform ve amonyum asetat durdurma çözüm. </li><li> 20 saniye için Vortex, centrifuge 18,000 x g&#39;de 10 dakika ve sulu faz toplanır. </li><li> 24 ile tekrar ektraktlayınız: 1 kloroform: izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 10 18.000 x g&#39;de dakika ve sulu faz toplamak için Vortex. </li><li> Gece boyunca -20 ° C de, 100% izopropanol ile mRNA çökeltilmesi. </li><li> 4 ° C&#39;de 18,000 x g&#39;de santrifüj 20 dk. % 80 etanol içinde durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 18,000 x g&#39;de santrifüj 10 dk. Daha sonra tekrar askıda bırakılması zordur olacak gibi daha uzun bir süre, 5-10 dakika için oda sıcaklığında pelet kurumaya bırakın. En az 2 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar DNase- ve RNase-barındırmayan su içinde yeniden süspanse enjeksiyon karışımı içinde iyi bir son mRNA konsantrasyonunu sağlamak. </li><li> Transkripsiyon ürünün kalitesini ve boyutunu kontrol 20 dakika boyunca 150 W TBE tamponu bir RNaz ücretsiz% 1 agaroz-TBE jel üzerinde mRNA 0.5 ul çalıştırmak için. Mağaza -80 ° C &#39;de 2 ul alikotları. </li></ol></li><li> Poli-lizin kaplı tabaklar NOT: Poly-lizin coaTed yemekler enjeksiyon sırasında oosit hareketsiz hale getirmek için kullanılır. <ol><li> Her 35 mm&#39;lik hücre kültürü Petri çanağı (toplam 5) için, buzu çözülmüş 0.25 mg / ml poli-lisin çözeltisinin, 1 ml Petri kabı alt kapağı. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Her 35 mm&#39;lik hücre kültürü Petri çanağı (toplam 5), başka bir 35 mm&#39;lik hücre kültürü Petri çanağı içine 0.25 mg / ml poli-lizin çözeltisi aktarın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 0.25 mg / ml poli-lizin çözeltisi atın. </li><li> 2 saat süre ile, oda ısısında petri kaplarında kuru ters olsun. </li><li> Bir hafta maksimum kirlenmeyi önlemek için 4 ° C&#39;da bir plastik sargı sarılmış poli-lisin-kaplanmış yemekler saklayın. </li></ol></li><li> Agaroz kaplı yemekler NOT: Bu kültür enjekte edilen embriyolar için kullanılır. Agaroz enjekte edilen embriyolar için bir yastık sağlayan ve çanak dibine yapışmasını engeller. <ol><li> Yapay deniz suyu (ABY) 37-38 g / L comm kullanarak olunters ozmoz su içerisinde ercial tuzları + 0.25 mM NaHCO 3. </li><li> Bir mikrodalga fırında çözelti ısıtılarak 0.22 um filtreden ASW agaroz bir% 1 konsantrasyona çözülür. </li><li> Hızla çanak çok ince agaroz kaplama sağlamak amacıyla başka biri ile bir 35 mm Petri kabı, sıcak agaroz dökün. </li><li> Saran sarılmış agaroz kaplı yemekler bir hafta maksimum kirlenmesini önlemek için 4 ° C&#39;de sarın saklayın. </li></ol></li><li> Enjeksiyon iğne enjeksiyonu karışımı ve yükleme <ol><li> Yaklaşık 2 saat enjeksiyonları başlamadan önce, 1-1,8 mRNA ug / ul,% 15 gliserol,% 1.25 Fenol Red nihai konsantrasyonları ile 2 ul enjeksiyon RNase- içinde karışımı ve DNaz-ücretsiz su yapmak. NOT: Fenol Kırmızı renk enjeksiyon verimlilik ve başarıyla enjekte edilen embriyoların belirlenmesi izlenmesine olanak sağlar çözümü. Gliserol oosit içinde mRNA difüzyon yanadır. </li><li> Santrifüj 4 dk 18.000 xg&#39;dePelet kristaller. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin. </li><li> 10 ul pipet ile, kristaller, topak haline edilmiş boru, alt kaçınarak enjeksiyon karışımı 0.5 ul toplar. </li><li> İğnenin büyük açılışında enjeksiyon karışımı 0.5 ul damla pipetleme (durumunda enjeksiyon sırasında bir tatili) en az iki enjeksiyon iğneleri dolduramaz. </li><li> Enjeksiyon karışımı buharlaşmasını önlemek için 4 ° C&#39;de altındaki sıvı bir depo kabı iğneler takın. Enjeksiyon karışımı yavaş yavaş kabarcıklar oluşumunu en aza indirmek için, en az 1 saat süre ile enjeksiyon iğnesinin ucunun tümünü olsun. </li><li> MRNA kalitesi bozulur, bundan sonra, üç ek kullanımları, en fazla -80 ° C&#39;de saklayın, ek enjeksiyon karışımı (veriler gösterilmemiştir). </li></ol></li></ol> Biyolojik Malzeme, Mikroenjeksiyon ve Embriyo Kültürü 2. Koleksiyonu <ol style="margin-left: 40px;"><li> Yumurta ve sperm toplama NOT: Theodosiou görünve ark. yumurtlama uyaran ve gamet toplama için ayrıntılı bir protokol için 12. <ol><li> 24 saat süre ile, 23 ° C&#39;de ASW Şok erkek ve dişi. </li><li> Çoğu yetişkin gün batımından sonra 1-2 saat doğacaktır, çünkü gün batımından önce bir iki saat, 19 ° C&#39;de ASW bireysel bardak içine yetişkin aktarın. </li><li> Filtrelenmiş ASW&#39;nin 35 mm Petri kapları durulayın ve onlara çanak dibine yapışmasını önlemek oosit kuru ters-üzdüm. </li><li> Yumurtlama üzerine, derhal 1.000 ul pipet ile sperm ve oosit toplamak. <ol><li> Sperm tutun ve iletişim gamet sağlığı için zararlı olduğu için oosit yetişkin amphioxus ayrı (veriler gösterilmemiştir). </li><li> Dahası, sperm ve oosit hem dağılımı hareketlere neden olur, bu yetişkin şaşırtıcı önlemek ve dolayısıyla seyreltin. Mümkün olduğunca uzun süre aktif sperm tutmak için ve döllenme oranını optimize mümkün olduğunca konsantre olarak sperm toplamak için. </li></ol></li><li> Tutmak1.5 ml tüp buz üzerinde sperm. </li><li> Önceden durulanmış, 35 mm Petri kutularına süzüldü ASW oosit aktarın. </li><li> Transferi 100-500 enjeksiyonları gerçekleştirmek için başka bir 35 mm&#39;lik Petri kabı önceden çekti 300-400 mikron transferi Pasteur pipeti ile oocytes. </li><li> Sperm ve oosit kalitesi için ya da diğer deney için bir kontrol olarak kavramanın kalan döller. </li></ol></li><li> Oosit enjeksiyonu <ol><li> Yatay düzleme 50 ° açıyla mikromanipülatör enjeksiyon iğnesi takın. NOT: Birden fazla 50 ° açıları oosit iğne pozisyonda uygun bir izleme izin vermez iken daha az 50 ° açıları, çanak etrafında oosit itecektir. </li><li> 25X oküler floresan kesme kapsamında, süzüldü ASW içeren bir poli-lisin-kaplanmış tabağına 300-400 um aktarım Pasteur pipeti ile 30 oosit aktarın. </li><li> Taşımak için bir hat boyunca oosit yatırındüzenli bir şekilde ve üzerinden enjeksiyonu olmayan enjekte edilmiş oositlerde enjekte ayırt etmek üzere. Gelişmekte olan embriyolar deforme eğiliminde poli-lisin, oositlerin maruz kalma süresini en aza indirmek için çok az sayıda (30 oosit) enjekte edilir (veriler gösterilmemiştir). </li><li> Mümkün olduğunca saydam olarak oosit işlemek için karanlık alan aydınlatma kullanın. </li><li> Mikromanipülatör kaba hareket topuzu, bir oosit yakın enjeksiyon iğnesi getirmek. </li><li> Ince forseps ile ucu kavisli olması başlar düzeyde iğne açmak kesti. Enjektör ile darbe olarak, kırmızı enjeksiyon karışımı aslında iğnenin dışarı akan doğrulayın. </li><li> 200X büyütmede ve mikromanipülatör ince hareketi topuzu, hafifçe oosit çekirdek içinde bir iğne hareket. NOT: Çok yüzeysel takılırsa, enjekte çözüm oosit içinde kalmayacak. Çok takılırsa, oosit yok edilecek. </li><li> 120 msn Durat 1-3 darbeleri ile enjekteiyon ve 1-10 psi basınç. İğne yeterince iyi değilse, sabit basınçta sürekli akış ile enjekte. Enjeksiyon hacmi, tek bir oosit hacminin 1/3, 1/5 karşılık emin olun. </li><li> Enjeksiyonu takiben, oosit sızıntısını önlemek için hızla iğneyi çekin. </li><li> Enjekte çözüm oosit içinde kalır ve bir kaç saniye sonra, enjekte çözüm oosit yayılır doğrulayın. </li><li> Doğrultusunda bir sonraki oosit üzerine taşıyın. </li><li> Enjekte embriyolar için tararken arka plan floresan tahmin negatif kontrol olarak her dizinin bazı uninjected embriyolar tutun. </li></ol></li><li> Enjekte embriyolar ve embriyo kültürü Döllenme, seçim <ol><li> En kısa sürede bir dizi enjekte edildiği gibi oosit döller. Oosit kalitesi zamanla azalır gibi, enjekte ve 12 yumurtlama sonra 1 saat içinde oosit döller. </li><li> Sperm konsantrasyonu bağlı olarak, oosit sperm 1-5 damla ekleyin veçanak girdap. Not: fertilizasyon zarf hakkında 1 dk sonra embriyolar üzerine belirgin hale gelmelidir. </li><li> Oosit bir dizi enjekte edilirken, embriyolar, poli-lisin kaplı çanak ayırmak için izin verin. </li><li> Bir agaroz kaplı Petri kabı içine 600 mikron transferi Pasteur pipeti ile embriyolar transfer. Mümkünse 2 hücreli aşamada önce, eğer, en kısa sürede, poli-lisin kaplı tabak embriyolar çıkarın. Not: poli-lizin, uzun süre maruz kalması durumunda, embriyolar, çanağın tabanı dokunmadan yan düzleştirilmiş yoğun dolu blastulae, olma eğilimindedir. </li><li> 2-hücreli 4-hücreye aşamada, DSR filtreli bir floresan diseksiyon kapsamı ile seçin başarıyla enjekte embriyolar, yani, bir Fenol Kırmızı-türetilmiş kırmızı floresan sinyali sergilediği normal morfolojiye sahip olanlar. </li><li> İstenilen aşamada kadar 19 ° C&#39;de agaroz kaplı Petri kapları süzülür ASW kültür embriyolar tutunin vivo görüntüleme. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Weber, T., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+tools+for+multicolor+imaging+in+zebrafish+larvae.">Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae.</a> Methods. 62, 279-291 (2013).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+as+a+tool+of+mechanical+delivery.">Microinjection as a tool of mechanical delivery.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).</li><li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes.">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> J. Vis. Exp. , e50841 (2014).</li><li>Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphioxus+and+tunicates+as+evolutionary+model+systems.">Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).</li><li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+amphioxus.">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li><li>Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+new+characters+after+whole+genome+duplications:+insights+from+amphioxus.">Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).</li><li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+the+tunicates.">Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates.</a> Development. 138, 2143-2152 (2011).</li><li>Yu, J. K., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalochordates+(amphioxus+or+lancelets):+a+model+for+understanding+the+evolution+of+chordate+characters.">Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Fuentes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+spawning+behavior+and+development+of+the+European+amphioxus+(Branchiostoma+lanceolatum).">Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum).</a> J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).</li><li>Li, G., Shu, Z., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Year-round+reproduction+and+induced+spawning+of+Chinese+amphioxus,+Branchiostoma+belcheri,+in+laboratory.">Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory.</a> PLoS One. 8, e75461 (2013).</li><li>Theodosiou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphioxus+spawning+behavior+in+an+artificial+seawater+facility.">Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility.</a> J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).</li><li>Holland, L. Z., Yu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalochordate+(amphioxus)+embryos:+procurement,+culture,+and+basic+methods.">Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods.</a> Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).</li><li>Holland, L. Z., Onai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+gene+function+in+amphioxus+embryos+by+microinjection+of+mRNAs+and+morpholino+oligonucleotides.">Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides.</a> Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).</li><li>Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+microinjection+method+for+unfertilized+eggs+of+Asian+amphioxus+Branchiostoma+belcheri.">An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri.</a> Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).</li><li>Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-targeted+green+fluorescent+protein+reliably+and+uniquely+marks+cells+through+apoptotic+death.">Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death.</a> Cytometry. 43, 273-278 (2001).</li><li>Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+nuclei+in+Aspergillus+oryzae+with+EGFP+and+analysis+of+the+number+of+nuclei+in+each+conidium+by+FACS.">Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).</li><li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD.">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li><li>Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+preferred+nucleotide+sequences+around+the+translation+initiation+codon+in+eukaryote+genomes.">Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).</li><li>Deheyn, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+green+fluorescent+protein+(GFP)+in+amphioxus.">Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus.</a> Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).</li><li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+acts+via+Hox1+to+establish+the+posterior+limit+of+the+pharynx+in+the+chordate+amphioxus.">Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus.</a> Development. 132, 61-73 (2005).</li><li>Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu makalede, B. enjeksiyonu için, ilk kez için, ayrıntılı ve yeniden üretilebilir bir protokol mevcut lanceolatum oositleri, burada, daha sonra B floridae 13,14 ve B belcheri 15, bu nedenle bu tür bir teknik tarif edilmiş olan üçüncü Amphioxus türdür. Önemli olarak, iletişim kuralı, aynı zamanda B floresan protein üretimi için uygun vektör sistemlerinin açıklamasını içerir Burada açıklanan in vitro koşullarda üretil...

Gelişimi sırasında, tek bir hücre, hücre bölünme ve hareketleri hem de içeren oldukça karmaşık bir işlem olarak, bütün bir organizma neden olur. Iyi hücre davranış dinamiklerini yatan biyolojik prensiplerini anlamak, gelişimsel biyologlar floresan tabanlı vivo görüntüleme teknikleri kullanmaya başlamıştır. Bu tür hücre membranları gibi hücre spesifik bölmeleri, ya floresan boyalar ile muameleler ile spesifiklik eksikliği ve doku penetrasyonu 1 engellenmektedir bir yaklaşım olarak etiketlenmiş olabilir, ya da floresan proteinleri 2 kodlayan eksojen mRNA&#39;ların embriyo özgü sokulmuştur. Farklı teknikler mRNA gibi eksojen bileşikler, etkili bir şekilde verilmesi için kullanılabilir. Bunlar arasında, ancak mikroenjeksiyon, elektroporasyon, mikro parçacıklar, lipofeksiyon ve transdüksiyon 3,4 ile bombardıman, bunlarla sınırlı değildir. Bu yaklaşımların her bir egzojen bileşikleri sokmak için kullanılabilir, ancakgelişmekte olan embriyo, sadece mikroenjeksiyon, her hücrede 3 içine önceden tanımlanmış ve hassas miktarlarda uygulama sağlar. Mikroenjeksiyon teknikleri tüm önemli gelişim model sistemler için de tarif edilmiştir 4 (örneğin, meyve sinekleri, nematod kurtlar, zebra balığı, kurbağa, fareler) ve gelişim mekanizmalarına evrimini anlamak amacıyla karşılaştırmalı çalışmalar için kullanılanlar dahil olmak üzere, bazı alternatif modeller 4, olduğu gibi (örneğin, deniz lalesi, halkalı solucanlar, deniz kestaneleri, ascidian gömlekliler, Kafatassızlar Amphioxus). Birlikte gömlekliler ve kordalı filumunu kurmak omurgalılar ile, özellikle çok uygun modeller sefalokordatlar, omurgalılar evrimini ve omurgasız atadan 5-8 arası omurgalıların çeşitlendirilmesi çalışma. Kafatassızlar soyu çok erken kordalı evrimi sırasında ayrılmaktadır; ve üç cins bölünmüştür kaybolmamış sefalokordatlar, (Branchiostoma, Asymmetron ve Epigonichthys), omurgalılar benzer hem genel anatomi ve genom mimarisi 5-8 açısından. Şimdiye kadar tarif edilmiş sefalokordatlar yaklaşık 30 türün, beş embriyolojik ve geliştirme çalışmaları 6,9 için kullanılabilir: Asymmetron lucayanum (Bahama lancelet) Branchiostoma floridae (Florida Amphioxus) Branchiostoma lanceolatum (Avrupa Amphioxus), Branchiostoma belcheri (Çin Amphioxus) ve Branchiostoma japonicum (Japon Amphioxus). Bu türlerin üç olgun yetişkin (B lanceolatum, B. belcheri ve B japonicum) isteğe bağlı üreme mevsiminde 10,11 boyunca yumurtlamaya indüklenebilir. Buna ek olarak, en az bir B. lanceolatum verimli yumurtlama böylece ayrıca LABORATOR için bu özel Kafatassızlar türleri erişilebilir hale yapay deniz suyu 12 indüklenebilirDoğal deniz suyuna erişimi olmayan ler. B. kombinasyon, lanceolatum, mikroenjeksiyon gibi etkin bir dağıtım yöntemi ile embriyo için uygun ve güvenli erişim, şimdiye kadar 13-15, (b floridae ve B belcheri hem de) amphioxus içinde gelişmiş sadece uygulama tekniği, geliştirilmesini mümkün kılmaktadır soy tracing- ve dinamik hücre davranış tabanlı yaklaşımları içeren manipülatif teknikler, yeni paketi. MRNA etkin mikroenjeksiyon için bir protokol B floresan proteinleri ifade etmek için lanceolatum embriyo dolayısıyla geliştirilmiştir. Ayrıca, B. canlı görüntüleme için bir temel araç seti temin etmek lanceolatum embriyolar, vektör sistemleri zara bağlı ve floresan proteinleri nükleer ekspresyon izin veren geliştirilmiştir. Membran hedeflemesi için, gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) mCherry ve eGFP insan HRAS CAAX kutusu ve nükleer lokalizasyon oldu erimiş olduzebra balığı histon 2B (H2B) ekson (Şekil 1, ek İçerik 1) füzyon yoluyla elde edilmiştir. Ayrıca, protein dönüşümünü optimize etmek amacı ile, konstruktların Kozak dizilerini ve kodonlar değiştirilmiş ve B kullanılmak üzere uyarlanmış lanceolatum. Birlikte ele alındığında, burada sunulan enjeksiyon yöntemi ve ifade vektörleri özellikle son vivo görüntüleme teknikleri floresan tabanlı kullanarak analizler, sefalokordatlar için yeni deneysel yaklaşımlar üretilmesi için bir temel olarak hizmet verecek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Yukarıda ayrıntılı protokol B mikroenjeksiyonu için temel sağlar lanceolatum oositler ve dolayısıyla B geliştirilmesi dahil edilmek için mRNA lanceolatum embriyolar in vivo görüntüleme için floresan proteinleri kodlayan. Tekniği kesinlikle sağlam ve güvenilir olmasına rağmen, bu protokolü kullanarak başarılı enjeksiyonları oranı değişken (Tablo 1) kalır. Bu ilginç aslında çok olası bir açıklama oosit kavramaları aşırı de?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes at JoVE.com

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

Floresan protein ifadesindeki<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

expression-fluorescent-proteins-branchiostoma-lanceolatum-mrna

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K Görüntüleme.  Institut Pasteur.  Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak. 

Video: Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Gelişim Biyolojisi

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Bitki Dokularının Hücre Duvarındaki Arabinogalactan Protein ve Pektinlerin Floresan İmmünolokalizasyonu

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Olgunlaşmamış Kedi Yumurtalarının Minimum HacimVitrifikasyonu

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Zebra Balıklarının Yumurtalık Foliküllerinde Foliküler Hücrelerin ve Oositlerin Ayrılması

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...