Bu ürün, floresan protein etiketi ile proteinleri düzleştirmek ve ilginç zebra balığı laboratuvar bireyinin proteininin yerini ve ifadesini görselleştirmek için optimize edilmiştir. Düşük bollukta ifade edilen proteinleri görüntülemek için özellikle yararlıdır. Yöntemimiz donör yapım sürecini basitleştirir ve hızlandırır.
CDS dışındaki bu bileşenler önceden omurgaya dahil edilir. Donör ayrıca verimliliği artırmak için optimize edildi. İletim ekranı iş akışı, en düşük zaman ve çaba maliyetiyle kalıtsal çekirdeği biriktirir.
Zebra balığı, enfeksiyon ve bağışıklık araştırmalarında yaygın olarak kullanılan model organizmadır. Özellikle sepsisin altında yatan mekanizmalarla ilgileniyoruz. Artık protokolümüzü kullanarak floresan etiketlemeyi kolayca yapabildiğimiz için, zebra balığındaki bir görüntüyü, sepsis proteinlerini ve hücrelerini etiketlemeye çalışacağız.
Başlamak için, bir sağlıklı dişi zebra balığı ve iki sağlıklı erkek zebra balığını bir çiftleşme tankına koyun. Çiftleşmeye hazırlamak için erkekleri dişilerden ayırmak için bir bölücü kullanın. Mikroenjeksiyon gününde, mikroenjeksiyon karışımını RNaz içermeyen bir ortamda buz üzerinde hazırlayın.
Rnaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak mikro enjeksiyon solüsyonunu iğneye yükleyin. Yüklenen iğneyi bir mikro enjektöre bağlı bir mikro manipülatöre yerleştirin. Mikroskop altında, iğnenin ucunu kırılana kadar hafifçe sıkıştırarak kesmek için sivri uçlu cımbız kullanın.
İğne sürekli olarak bir nanolitrelik bir damlacık çıkarana kadar enjeksiyon basıncını ayarlayın. Daha sonra, bölücüyü çiftleşme tankından çıkarın ve balığın altı dakika boyunca üremesine izin verin. Tek hücre aşaması embriyolarını toplayın ve embriyo tamponu içeren bir Petri kabına aktarın.
Embriyoların sağlığını ışık mikroskobu altında inceleyin ve döllenmemiş yumurtaları veya kalıntıları temizleyin. 20 sağlıklı embriyoyu ayrı bir Petri kabında enjekte edilmemiş kontroller olarak bir kenara koyun ve kabı etiketleyin. Küçük bir fırça kullanarak, sağlıklı bir hücre aşaması embriyolarını oda sıcaklığına ısıtılmış bir mikroenjeksiyon plakasının oluklarına aktarın ve nazikçe hizalayın.
Fazla tamponu plakadan çıkarın. Bir iğne ucu yardımıyla, her embriyonun konumunu, hayvan direği iğneye bakacak şekilde nazikçe ayarlayın. Karışık çözeltinin bir nanolitresini hayvan direğine enjekte edin.
Enjeksiyondan sonra, embriyoları embriyo tamponu ile 6 oyuklu bir plakaya nazikçe durulayın. Plakayı 28,5 santigrat derece sabit sıcaklık inkübatöre yerleştirin. Döllenmeden 10 saat sonra, embriyonik gelişimi stereo mikroskop altında inceleyin ve ölü embriyoları çıkarın.
Döllenmeden 24 saat sonra, embriyoları genotipleme için 1,5 mililitrelik tüplere toplayın ve fazla suyu dikkatlice atın. Her tüpe Proteinaz K içeren 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Tüpleri bir saat boyunca 56 santigrat derecede ve daha sonra 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçka işleminden sonra 200 mikrolitre etanol ekleyin ve iyice karıştırın. Tüpü 19.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin ve peleti 500 mikrolitre% 70 etanol ile yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı atın. Tekrar santrifüjleyin ve peleti 50 mikrolitre çift damıtılmış suda çözmeden önce havayla kurutun.
PCR için reaksiyon karışımını hazırlamak için ekstraktın bir mikrolitresini kullanın. PCR'den sonra, başarılı amplifikasyonu doğrulamak için agaroz jelleri iki mikrolitre PCR ürünü ile çalıştırın. sgRNA'ların verimliliğini değerlendirmek için enzimatik sindirim gerçekleştirin.
Sindirim solüsyonunu yavaşça karıştırın ve üreticinin talimatlarına uyarak oda sıcaklığında inkübe edin. Sindirimi doğrulamak için sindirilmemiş PCR kontrollerinin yanı sıra sindirilmiş ürünler için agaroz jelleri çalıştırın. sgRNA verimliliğini analiz etmek için TIDE web sitesini açın ve TIDE'yi Başlat'a tıklayın.
sgRNA'nın kılavuz dizisini kılavuz dizisi çerçevesine girin. Vahşi tip kontrolünün sıralama sonucunu kontrol örneği kromatogramı alanına yüklemek için Gözat'a tıklayın. Benzer şekilde, düzenlenen numunenin sıralama sonucunu test numunesi kromatogramı alanına yükleyin.
Sonuçları analiz etmek için Görünümü Güncelle'ye tıklayın. Başlamak için, donör plazmidini oluşturmak için ligasyondan bağımsız klonlama veya eksonükleaz III ile LIC kullanın. Vektör elemanı 1 ve eleman 2'nin bir kısmı ile çakışan bir diziye sahip astar F1'i tasarlayın.
Eleman 1, eleman 2 ve eleman 3'ün bir parçası ile astar R2'yi tasarlayın. Astar F2'yi eleman 3 ve 4'ü ve sgRNA hedef bölgesini takip eden CDS'nin 5 asal dizisini içerecek şekilde tasarlayın. Kaplama dizisinin üç ana dizisi ve vektör ile örtüşen bir dizi ile astar R1'i tasarlayın.
Zebra balığı CDNA'sını şablon olarak kullanın ve tasarlanan primerlerle PCR gerçekleştirin. PCR ürünlerini etanol çökeltme kullanarak saflaştırın. Donör vektörünü pCI ve Acc65I gibi restriksiyon enzimleri ile sindirin ve sindirilmiş donör vektörünü saflaştırın.
DNA jel elektroforezi kullanarak saflaştırılmış PCR fragmanlarını ve sindirilmiş donör vektörünü ölçün. Daha sonra, saflaştırılmış donör vektör ile LIC karışımını hazırlayın ve 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için bir mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin.
Çözeltiyi karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Reaksiyon karışımını 60 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. LIC ürünlerini buz üzerinde soğutun.
Ardından, LIC ürünlerini kullanarak DH5-Alpha yetkin hücreleri dönüştürün. Dönüştürülmüş hücreleri ampisilin içeren Luria-Bertani plakaları üzerine yerleştirin ve 16 saat boyunca büyütün. İnkübasyondan sonra, enzimatik sindirim analizi ve DNA dizilimi için LIC plakalarından tek koloniler seçin.
Doğru donör plazmitlerini bir saflaştırma kiti ile ekstrakte edin ve saflaştırın. Mikroenjeksiyondan 12 ila 48 saat sonra, bir stereo floresan mikroskobu altında zebra balığı embriyolarına gen knockin' için bir mikroenjeksiyon karışımı enjekte edin, zebra balığı larvalarının floresansını gözlemleyin. Yerleşik bir tarama yöntemi kullanarak, floresan larvaları seçin ve bunları ayrı ayrı yetiştirin.
Bir aylıkken, anestezi uygulanmış her zebra balığından küçük bir parça kürek yüzgeci toplayın etiketli bir PCR tüpüne. İlgili anestezi uygulanmış zebra balığını, tüp üzerindeki etikete uygun UV ile sterilize edilmiş filtrelenmiş su ile doldurulmuş 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Alkali lizis yöntemini kullanarak genomik DNA'yı çıkarın.
Sol homoloji kolunun yukarısında bir ileri astar ve ek parça üzerinde bir ters astar tasarlayın. Dizinin beş ana bağlantısını hedefleyen PCR gerçekleştirin. Elenmiş F zebra balığının vahşi tip zebra balığı ile çiftleştirilmesiyle elde edilen F1 embriyolarını GFP ekspresyon paternleri için inceleyin.
Eklem PCR kullanarak F1 embriyolarını genotipleyin. Tüm F1 soylarının kaslarında kalıtsal spesifik floresan gözlendi, bu da connexon 39.9'un başarılı GFP etiketlemesini gösteriyor. Tüm F2 soylarının merceğinde kalıtsal spesifik floresan tespit edildi, bu da connexon 44.1'in başarılı bir şekilde mCherry etiketlemesini düşündürdü.
39.9 ve 44.1 bağlantılarının doğru vuruşu, bağlantı polimeraz zincir reaksiyonları ile doğrulandı.
