Bu çalışma, ZS, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve PKD vakıf tarafından desteklenmiştir. Yale Hayvan Kaynakları Merkezi (YARC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) yönergeleri doğrultusunda tüm hayvan deneyleri yapılmıştır.

Bölüm 1: mikropipetler hazırlanması ve mikroenjeksiyon odası plakalar <ol><li> Isıtma ve borosilikat cam kapiller tüplerin (Dünya Precision Instruments, Inc, 1B100-4) çekerek bir mikropipet çektirmenin cihazı (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown P-97) mikropipetler imal. Az miktarda kil veya yapışkan bant üstünde bir Petri kabındaki saklayın. </li><li> (Zebra balığı Kitap &quot;ta anlatıldığı gibi), enjeksiyon sırasında embriyoların tutmak için kolay bir yöntem olarak hizmet verecek kama şeklindeki olukları ile kalıp 1x E3 orta plakalar% 1.5 agaroz (American Bioanlytical, Inc, AB00972-00.500) dökün 1. agar odasına plakalar 4 º C&#39;de kullanımı ve mağaza önce kuvvetlendirmek </li></ol> Bölüm 2: RNA hazırlanması Zebrafish embriyoların in vitro kapaklı transkripsiyonu RNA gen fonksiyon çalışmaları için güçlü bir yaklaşım microinject. Kapaklı RNA CAP analog varlığı nedeniyle in vivo bulundu ökaryotik mRNA&#39;ların benzer şekilde davranır. Zebra balığı araştırmacılar rutin kendi ilgi gen eksprese veya misexpress için bu yöntemi kullanmaktadır. Bu gösteri, bir EGFP etiketli transkript microinject ve başarılı bir enjeksiyon için görünür bir okuma olarak canlı embriyo tüm GFP-ifade kullanmak. <ol><li> In vitro CAP RNA transkripsiyonu tepki ilgi transkript bir gerçekleştirin. Laboratuvarda rutin bir pCS2 + vektör ilgi bir cDNA yerleştirin ve kapaklı RNA mMessage mMachine SP6 kiti (Ambion, Inc, AM1340) kullanarak büyük miktarda in vitro sentez reaksiyon gerçekleştirilir. </li><li> Purify RNA örneği RNeasy Mini kiti (Qiagen, Inc 74.104) ile çalışan veya fenol: kloroform ekstraksiyonu ve izopropanol yağış. </li><li> Dikkatli bir şekilde kullanıma hazır olana kadar -80 º C&#39;de RNA hazırlık ve mağaza konsantrasyonu belirler. </li><li> Enjeksiyon gününde, RNA örnek, girdap hafifçe Çözülme ve kısaca aşağı doğru döndürün. </li><li> 0.050% fenol kırmızısı (Sigma-Aldrich Co, P0290) - Steril su ve 0.025 bir final konsantrasyon ile bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Fenol kırmızı görünür bir çözüm embriyo içine enjeksiyon için işaretleyici olarak hizmet vermektedir. Bu makalede, biz% 0.050 fenol kırmızısı ile 100 ng / uL EGFP mRNA çalışan bir solüsyon hazırlanır. </li><li> -80 ° C&#39;ye kadar buz ve dönüş RNA stok çalışma örneği tutun </li><li> Bölüm 4 Bu örnek enjekte etmek için hazır geçin. </li></ol> Bölüm 3: morfolino hazırlanması Morfolino antisens oligonükleotidler hedeflenen protein çeviri bloke ederek veya pre-mRNA ekleme 2,3 değiştirerek gen ekspresyonu yaygın olarak değiştirmek için kullanılır. Zebrafish Morpholinos genin fonksiyonu aşağı vurma güçlü bir ters genetik aracı olarak hizmet vermektedir. Bu makalede, biz pkd2 translasyonel başlatılması sitesi (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;) hedef alan bir morfolino oligo microinject. Daha önce kurulan çalışma dayanarak, enjekte edilen embriyolar fenotipik pkd2 mutant balık 4 taklit etmek için bekliyoruz. <ol><li> Biz rutin olarak özel bir gen Gen Araçlar faiz, LLC (Philomath OR) için tasarlanmış bir morfolino oligo 300 nmol sipariş. </li><li> 3 mM stok solüsyonu yapmak için 100 uL steril su ekleyin. Kullanıma hazır olana kadar -20 ° C&#39;de kısım çözüm ve mağaza. </li><li> Enjeksiyon gününde, 65 morfolino çözümü ısı ° C 5 dakika. Hemen buz üzerine serin çekin ve kısaca döndürün. Bu adım, oligo herhangi bir ikincil yapılar yıkılır ve çözüm tamamen çözünür olmasını sağlar. </li><li> 0.050% fenol kırmızı - steril su ve 0.025 final konsantrasyonda morfolino çözüm seyreltilmesi ile çalışan bir çözüm hazırlayın. Bu gösteri,% 0.050 fenol kırmızı ile 0.50 mM pkd2 morfolino bir çalışma çözeltisi hazırlanıyor. </li><li> Oda sıcaklığında çözüm çalışmaya devam edin. </li><li> Bu örnek enjekte etmek için hazır Bölüm 4 geçin .---- </li></ol> Bölüm 4: çalışma çözeltisi ile mikropipet Dolum <ol><li> Forseps ile mikropipet distal ucu veya 50X büyütme (Nikon Instruments, Inc SM2645) diseksiyon mikroskobu altında görünür bir açılış oluşturmak için bir cerrahi jilet kesin. </li><li> Place 2 lamel üzerine bir damla olarak çalışan çözüm uL. </li><li> 5 ml şırınga derialtı iğne ve biraz çalışma çözüm damla içine daldırın mikropipet distal ucu boru ile donatılmış bir mikropipet geri takın. Mikropipet ucu kırmamaya özen gösterin. </li><li> Şırınganın pistonu çekerek mikropipet distal sonuna kadar çalışma çözeltisi Sifon. </li></ol> Bölüm 5: mikropipet enjeksiyon hacmi Kalibre <ol><li> Mikrometre slayt üzerinde mineral yağ, bir damla (Amerikan Biyoanalitik, Inc, AB00921-00025) (Fi yerleştirinsher, 12-561-SM1). </li><li> Basınç darbeli mikro enjektör cihazları (Dünya Precision Instruments Inc, PV830) güç ve hava kaynağı açın. </li><li> Mikropipet mikropipet sahibine mikro enjektör aparat takın. Mikro enjektör basınç düzenlenir ve deşarj ayak pedalına basarak aktive edilir. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında enjeksiyon hacmi, çalışma çözüm mikrometre yağı, üzerine bir damla yere mikro enjektör kullanarak test edin. Yağın üstüne bir küre olarak yüzer gibi damla çapı ölçün. </li><li> Süresi ve enjeksiyon basıncı enjeksiyon hacmi dikkatle kalibre etmek için ayarlayın. Bu adım, mikroenjeksiyon deney tekrarlanabilirlik yardımcı olur. Bu gösteri, tüm microinjections bir damla çapı 0,15 mm (hacmi yaklaşık 1.76 nL) ile yapılacaktır. </li><li> Enjeksiyon hacmi kalibre edildikten sonra, dolgu ve mikropipet sızmasını önlemek için &quot;Tut&quot; düğmesi mikro enjektör kullanın. </li></ol> Bölüm 6: mikroenjeksiyon için hazırlanması döllenmiş zebrafish embriyolar <ol><li> Zebra balığı her sabah ilk birkaç saat içinde rastgele arkadaşı olacak. 1-hücreli aşamada embriyoların toplayın ve 1x E3 orta koyun. </li><li> 3 ml transfer pipetlemeyin (Becton Dickinson Laboratuvar, 357.524) kullanarak, mikroenjeksiyon odası plakalar kama şeklindeki olukları boyunca embriyolar düzenliyoruz. </li><li> Embriyoların basık batık ve sular değil böylece orta çıkarın. Bu adım, sıra mikropipet koryon penetrasyon olukları alt embriyolar çözümünde yardımcı olur. </li></ol> Bölüm 7: koryon ile Mikroenjeksiyon <ol><li> 1-hücreli aşamada embriyo sitoplazma diseksiyon mikroskop altında görülebilir böylece mikropipet embriyolar işleyin. Mikropipet ucu kırmamaya özen gösterin. </li><li> Mikropipet koryon ve sonra sarısı embriyonun içine enjekte etmek için nüfuz. Bu gösteri, ilk doğrudan hücre altında sarısı içine microinjecting ve hücre içine çalışma çözüm getirmek için izin sitoplazmik akışı ve difüzyon. Bu akış, emekçi çözüm için fenol kırmızısı nedeniyle görünür. </li><li> Ayrıca hücre sitoplazma içine direkt enjeksiyon gösterecektir. Hücre içine doğrudan mikroenjeksiyon daha güçlü ama uygun embriyo yönelim ve mikroenjeksiyon tekniği gereklidir gibi zaman alıcı. Hücre zarı, yumurta zarı daha sıkı olduğu için, hücre sitoplazma ulaşmak için yumurta sarısı ile mikropipet girmek için genellikle daha hızlıdır. Hayvan kutup çukur alt kısmına doğru yönlendirmek ve kararlı ellerle bu enjeksiyon yöntemi yardımcı olabilir. </li><li> E3 orta mikroenjeksiyon sonra, embriyoların bir Petri kabı içine yerleştirin ve 28,5 az inkübe ° C normal gelişimi için. </li><li> Embriyo gelişiminin sonraki birkaç saat ve gün içinde, ilgi fenotipleri embriyolar gözlemliyoruz. </li></ol> Bölüm 8: Temsilci sonuçları EGFP mRNA aşırı ekspresyonu: mikroenjeksiyon başarısını doğrulamak için, biz (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII) in vivo embriyo tüm floresan mikroskopi kalkan aşamada (~ 6 hpf) başlayarak, gelişmekte olan embriyolar, GFP ifade izleyecek . Yapı İfade erken embriyonik gelişim olaylar sırasında en güçlü ve genellikle geliştirme sırasında enjekte kapaklı RNA yavaş yavaş düşer ve ifade protein istikrar bağlı olarak azalacaktır. pkd2 translasyonel engelleme morfolino: daha önce yayınlanan sonuçlara dayanarak, yaklaşık 2 pkd2 mutant Zebra balığı ve mevcut böbrek kistleri bulunan dorsal vücut ekseni eğrilik pkd2 morphants - 3 dpf&#39;e 4 taklit etmek için bekliyoruz. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: EGFP mRNA ve pkd2 Ağustos morfolino mikroenjeksiyon Temsilcisi sonuçlar. (A) TAB embriyolarının EGFP mRNA 0.17 ng 1-hücreli aşamada microinjected ve in vivo GFP ifade 1 dpf&#39;e görüntülendi. (B, c) TAB embriyolarının 0.50 mM pkd2 translasyonel engelleme morfolino ~ 1.7 nl 1-hücreli aşamada microinjected ve 4 dpf&#39;e dorsal vücut eğriliği için attı.

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

Zebrafish embriyolar içine mikroenjeksiyon gelişimi belirli bir genin rol keşfetmek için köklü ve sağlam bir tekniktir. Uygulamalar ilgi yanı sıra birden fazla genin arasındaki epistatik analizi gen aşırı ekspresyonu, misexpression ve demonte deneyleri içerir. Transgenik hayvanlar oluşturma ve erken blastula embriyolar 5,6,7,8,9 hücre kaderi haritalama zebrafish içinde Mikroenjeksiyon yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, bu tekniğin uygulama hücre nakli yöntemleri 10</su...

Tüm diğer malzemeler, protokolde yer almaktadır.

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

Geliştirme sırasında bir genin rolünün araştırılması için gerekli bir araç gen demonte, aşırı ekspresyonu ve misexpression çalışmalar gerçekleştirmek için yeteneğidir. Zebrafish yılında (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Gelişmekte olan embriyonun içine RNA, DNA, proteinler, antisens oligonükleotidler ve diğer küçük moleküller mikroenjeksiyon araştırmacılar gen fonksiyonu keşfetmek için hızlı ve sağlam bir çalışma sağlar<em&gt; In vivo</em&gt;. Bu video makalede, biz nasıl hazırlamak ve microinject gösterecektir<em&gt; In vitro</em&gt; Sentezlenmiş EGFP mRNA ve translasyon engelleme morfolino oligo karşı<em&gt; Pkd2</em&gt; 1-hücre sahne zebrafish embriyolara otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (bireylerinde) ile ilgili bir gen. Daha sonra, GFP ifade ve fenotip analizi doğrulayarak mRNA ve morfolino microinjections başarısı analiz edecektir. Bu tekniğin geniş uygulama transgenik hayvanlar ve germ-line kimeralar üreten hücre kaderi haritalama ve gen taraması içerir. Bu yazıda tarif EGFP ve demonte aşırı ekspresyonu için bir protokol<em&gt; Pkd2</em&gt; MRNA ve morfolino oligonükleotid enjeksiyon.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. at JoVE.com

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K Görüntüleme.  Yale University School of Medicine. Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Video: Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biyoloji

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.