Bu çalışma Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / EFN için Jeunes Chercheurs), Fondation Voir et oyunsu ve Fondation Bettencourt Schueller (EFN Genç Araştırmacı Hibe), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, EFN için kalıcı pozisyon) tarafından desteklenen ve (SCF için R01-EY13295) Sağlık Ulusal Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü. Ayrıca, Institut de la Vizyon Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique ve bölüm de Paris tarafından finanse edilmektedir.

Bu POS izolasyon deney zaman alıcıdır ve POS depolamadan önce etiketlenmiş eğer tamamlamak için 12 saat kadar gerektirebilir. protokol 1997 10 SC Finnemann ve arkadaşları tarafından 1987 31 RS Molday ve arkadaşları tarafından yayınlanan ve modifiye bir kağıt adapte edilmiştir. Hayvanlar Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) Beyanında Araştırma Derneği göre ele alınmıştır. Protokoller gözden ve Üniversite Pierre ve Marie Curie-Paris 06 Charles Darwin Etik Kurulu ve Fordham Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Genel Kurma <ol><li> Mümkün Kesim sonrası taze domuz 80 veya inek gözleri gibi taze kısa sürede elde edilir ve karanlıkta soğutulmuş tutmak. Şirket aynı şekilde devam böylece sağlayıcısına talimatları sağlayın. Bu protokol, 80 gözler için optimize edilmiştir. IçinDaha fazla gözlerle devam ve büyük hisse almak (örneğin, 160 gözlerden), çözüm miktarları iki katına ve Ultrasantrifügasyon 2 mermi yerine; Havuz örnekleri daha sonra toplama aşamasında (adım 2.2.2 bakınız). </li><li> Kırmızı emniyet ışığı lamba, emici pedler bankta kurmak, (Malzeme tablosu) mendil. (... Vitreus kullanılmayan göz parçaları,) 15 cm yemekleri ve biyolojik tehlikeli atık toplama torbaları için hazırlayın. Dar Labcoat, eldiven, kol koruyucuları ve gözlük takın. </li><li> Önlemler: <ol><li> Sonra tüm çözümleri Öncesi soğuk her aşamasında soğuk tutmak. Mümkün olduğunca buz üzerinde soğutulmuş gözleri ve degradeler tutun. </li><li> Ultrasantrifüje edildikten sonra toplama aşaması görsel pigmentler ve photopigments aktif formunun turuncu-pembe bir renk kaybı ışıkla ağartma bilmek kadar mümkün olduğu kadar karanlıkta gözler ve elde edilen dokuların tutun. </li></ol></li></ol> 2. Protokol Eylemleri <ol><li> Çözüm ve geçişlerini hazırlayın: <ol><li> Çözülme taurin stoku tamamen 37 ° C su banyosu kullanılarak. </li><li> İnhibitörler, stok çözeltilerden tüm çözümler (Tablo 1, stok çözeltileri) hazırlayın ve iyice her çözelti için bir manyetik karıştırıcı kullanılarak, diğer katkı maddeleri ile sükroz karıştırın. <ol><li> % 20 sakroz nihai bir konsantrasyona kadar homojenleştirme çözeltisi 15 ml hazırlayın, 20 mM asetat pH 7.2 Tris, 2 mM MgCl2, 10 mM glikoz ve 5 mM taurin. </li><li> (% 70 sukroz stok kullanarak)% 25 sukroz, 20 mM Tris asetat pH 7.2, 10 mM glikoz ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere% 25 sukroz çözeltisi hazırlayın. </li><li> (Sakaroz tozu kullanarak)% 60 sakroz ve nihai bir konsantrasyona kadar% 60 sukroz çözeltisi hazırlayın, 20 mM asetat pH 7.2, 10 mM glükoz ve 5 mM tris taurin. </li><li> 20 mM Tris asetat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere, yıkama 1 çözelti hazırlayın. </li><li> Yıkama 2 çözeltisi hazırlayın% 10 sukroz, 20 mM Tris asetat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir nihai konsantrasyona seyreltildi. </li><li> % 10 sukroz, 20 mM sodyum fosfat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere, yıkama 3 çözelti hazırlayın. </li></ol></li><li> Manyetik bir karıştırıcı ile gradyan yapıcı istikrarlı ve% 60 çözelti eklenir çıkmak için en yakın odası içinde bir karıştırma çubuğu ile ekleyin. Uygun döküm hızı elde etmek için, borunun çıkışında yerleştirilen bir kesme P200 pipet ucu kullanarak. </li><li> Ince seyreltilmesi ve önceden soğutulmuş ultrasantrifüjdeki tüpleri her çözümden (80 gözler için, yani toplam 6 tüpler) 12 ml kullanılarak% 25 biriyle% 60 sakaroz çözüm karıştırılarak doğrusal degradeler Cast. Iyi kademeli-seyreltilmesi% 60 sukroz solüsyonu karıştırın. Çok hızlı sorunsuz ve çözüm dökme, gradyan akış hızını sakinleştirmeye. NOT: Sürekli, doğrusal degrade almak için, sağ tamamı degrade kutu kurma için çözeltinin yüzeyinde pipet ucu açıklığı tutmakn. </li><li> Geçişlerini istikrar için yaklaşık 1 saat boyunca buz üzerinde bekletin. Yüklenen kadar soğutulmuş geçişlerini tutun. Degrade aksamaması için tüpler sallamayın. </li></ol></li><li> Doku koleksiyonu: <ol><li> Loş kırmızı ışık altında dokuları toplayın. Bir yandan içine bir göz atın ve uzak göz tutarken jilet kenarı ile ön karıştırmak (sıçramasını önlemek için, Şekil 1). 2 yarısı (kornea artı sklera içine en az 5 mm) içine ön gözün kesmek için jilet kullanın. Lensini çıkarın ve bir parmak böylece retinanın açığa ucu üzerinde tutulabilir böylece içini Göz yuvası çevirin. </li><li> Bir açıyla jilet kullanarak, yavaşça kolayca ayırarak ve Tapetum yüzeyinden, pembemsi bir tabaka olarak görünen ve optik sinir başı (Şekil 1) kesilmiş, retina kazımak. 2 x 50 mL tüpler buz üzerinde homojenizasyon çözeltisi 15 ml içeren, her tüm retina toplayın. </li><li> Retina homogenization: <ol><li> Farklı hücre tabakaları bozabilir PR hücre fragman POS geri kalanı kapalı POS kırmak ve retina süspansiyon homojen hale getirmek amacıyla 2 dakika süreyle elle kuvvetli bir şekilde süspansiyon çalkalayın. </li><li> Temiz bir gazlı bez bir çift katmanı üzerinden filtre 3x geniş doku parçaları kaldırmak ve akış yoluyla temiz 50 ml tüpler (Şekil 1) toplamak için. retina süspansiyon yavaşça, verimi en üst düzeye çıkarmak, her süzüldükten sonra geriye kalan parçalanmış dokuların serbest bırakmak için gazlı bez üzerine basın, oldukça kalın olan. </li></ol></li></ol></li><li> Fotoreseptör dış segment fragmanı (POS) izolasyon: <ol><li> % 60 sukroz gradyanı (Şekil 1) - 30 x 6 ml üzerinde ultrasantrifüjdeki tüpleri taze soğutulmuş sürekli 25 her içeren 24 ml tüp başına 7 ml - Yavaşça, 6 civarında ham retina hazırlık yatıyordu. Rotor kullanılacak uygun olarak karşı tüpleri dengeleyin. 4 ° C&#39;de 50 dakika boyunca 106,000 x g&#39;de ultrasantrifüj. </li&gt; <li> Aspirasyon (Şekil 2A) tarafından degrade üst üçte turuncu-pembe bandın üstünde çözümün en çıkartın. Bir behere bir cut-off P1000 ucu ile turuncu-pembe bant toplayın. Çamaşır suyu (biyolojik atık) kullanarak nötralize sonra geri kalanını atın. </li><li> Buz soğukluğunda Wash 1 çözelti 5 hacim -, 4 ile seyreltin. Gerektiği kadar 30 ml tüpler içine ayırın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüjleyin. Dikkatle süpernatant atın. </li><li> Yukarıda ayrıntılı olarak 10 ml pelet tekrar 10 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de 2 çözümü ve spin yıkayın. 15 ml pelet tekrar 3 kez yıkanır ve 10 dakika boyunca 3000 x g hızında tekrar dönerler. Wash 2 santrifüj önce gerekli tüplerin sayısını azaltmak ve 3 çözümleri yıkayın birkaç pelet süspansiyonlar birleştirin. </li></ol></li><li> POS etiketleme olmadan aliquoting: <ol><li> 20 ml DMEM - 10 süspanse POS. Seyreltme 10 490 ul DMEM (01:50) &#39;de ul ve whirled POS yanı sıra uzatılmış sayısıhücre sayım odası (Şekil 2B). ML başına POS parçacıklar halinde verim ve konsantrasyon hesaplayın. NOT: - 8 x 10 9 POS 80 domuz gözleri verim örneğin yaş ve gerginlik domuz / inek ve gözlerinin büyüklüğü, çoğunlukla bağlı olarak değişir, iyi bir hazırlık 5 değişmektedir. </li><li> Nihai DMEM hacmi karar (tipik olarak 10-20 mi) ve% 2.5 sükroz bir son konsantrasyon elde etmek üzere sukroz ekleyin. </li><li> Örneğin, istenilen büyüklükte alikotlarının hazırlayın / göz 40 ul, 96 oyuklu bir deney için 2 ml&#39;lik bir yeniden süspansiyon hacmi için tüp başına 5 x 10 7 POS. Oda sıcaklığında 2300 x g&#39;de 5 dakika boyunca 1 kısım Spin ve topak boyutunu değerlendirmek. POS kez donmuş ve çözülmüş olmaMAlıdır gibi farklı uygulama birimleri için çeşitli kısım boyutları hazırlayın. </li><li> Bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C &#39;de, POS alikotları dondurun. NOT: Bu süspansiyonun tam bölenleri birçok ay boyunca stabildir. Bizim ellerde, etiketsiz veya etiketli POS en az bir yıl süreyle saklanabilir. </li></ol></li><li> POS etiketleme ve Alikotlama: NOT: Biz genellikle fagositoz deneyleri ölçümü için POS etiketlemek için FITC kullanın, ancak diğer boyalar kullanılan yanı sıra ihtiyaçlarına bağlı olarak olabilir. <ol><li> 1.4 ml 0.1 M Na-2 CO 3, pH 11.5 (Tablo 2, stok çözeltileri) ile 2.6 ml 0.1 M NaHCO 3 pH 8.4 karıştırılarak 0.1 M Na karbonat tampon pH 9.5 içinde 2.5 mg / ml bir konsantrasyonda yeniden süspanse 1: 10 mg FITC bir tüpe konulmuştur. Olmayan yeniden süspansiyon haline getirilmiş, FITC katı pelet maksimum hızda 5 dakika boyunca hafif ve spin korurken, oda sıcaklığında 1 saat süre ile döndürür. </li><li> Yıkama 3 çözeltisi (ya da DMEM), 10 ml POS pelet yeniden süspanse edin ve 80 gözler için FITC 2 ml solüsyon ilave edin. -80 ° C &#39;de dondurulmuş bir artık, FITC saklayın. Oda sıcaklığında en az 1.5 saat için döndürün. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun. </li><li> Bölüm 2.3.4&#39;de tarif edildiği gibi, hemen hemen hiç FITC yüzer f görülmeyene kadar sonra bir kez ya da iki kez DMEM içinde iki kere yıkayın 3 çözeltisi kullanılarak etiketli POS yıkayınreaksiyona karşı. DMEM yeniden süspanse POS ve sayma ve şişelemeden (bölüm 2.4) için etiketsiz POS gibi devam edin. </li></ol></li><li> Deneylerde POS kullanılması: <ol><li> Çözülme oda sıcaklığında POS ve floresan etiketli ise mümkün olduğu kadar karanlıkta tutun. RT&#39;de 2.300 xg&#39;de 5 dakika Spin. Süpernatant aspire. </li><li> Deney tarafından belirlenen hemen tahlil çözeltinin uygun hacmi içinde yeniden süspanse edin. POS meydan farklı zamanlarda durumunda, mağaza birkaç saat zaman noktaları arasında karanlıkta oda sıcaklığında POS yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Üç adım veya durumlar optimize saflaştırma için önemlidir: dereceli döküm ve hassas gradyan borular manipülasyon kalitesi, soğutulmuş ve toplama aşamasında kadar karanlıkta dokuları tutarak, retina homojenatlarının çalkalama gücü PR geri kalanından uygun POS izolasyon elde etmek için hücresidir. Bazı sorunlar düzgün turuncu bant görmeye ortaya çıkarsa, bunlar dolayı yukarıdaki üç nedenden biri (aynı zamanda Sonuçları bölümün ikinci paragrafa bakın) büyük olası...

Retinasında, görme beyinde görsel alana kadar nöronlar arasındaki iletilebilir bir sinyal haline dönüştürülmeden önce, opsins adı ışığa moleküllerin izomerizasyonu ile tetiklenir. Bu moleküller, fotoreseptör hücrelerinin dış segment bölümlerini (PR) oluşturan krep benzeyen membranöz disklerin yığınlarının içinde gömülü. Işık ve oksidatif stres dolayısıyla önemli seviyelere sürekli maruz tabi olmak, PR sürekli potansiyel oksidatif hasarı sınırlamak için dış segmentleri yenilemek. Fotoreseptör dış segmentleri komşu retina pigment epitel (RPE) hücrelerinin apikal mikrovilluslu yakın temas halindeyiz. RPE hücreleri, kan-retina bariyerinin dış kısmını oluşturan ve melanin pigmentleri, fotoreaktif opsin bileşeni Retinal&#39;in yeniden izomerizasyonuna sağlayan besin ve g yoluyla ışık ışınları söndürme gibi fotoreseptör sağlık ve fonksiyonu 1 için çok önemli olan çok sayıda görev, sağlamakPR metaboliti bertaraf katılan faktörler rowth. Buna ek olarak, RPE hücreleri POS geçirdi ve onların bileşenleri, memeli retina 2,3 sirkadiyen ritim tarafından düzenlenen bir günlük işgal geri dönüşüm ortadan kaldırmak. sundurma POS boşluk PR hayatta kalmak için kesinlikle gereklidir. Tamamen kaldırılmıştır zaman, POS enkaz birikir ve PRs hızlı görme kaybı 4,5 neden dejenere. Ritmik profil kaybetti ve sabit aktivitesi ile değiştirilirse, PR ve RPE kusurlar yaş 6 birikir. Bu nedenle, bu da fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı fenotipler anlaşılması için in vitro RPE fagositoz moleküler düzenleme karakterize etmek için çok önemlidir. İlginçtir, RPE hücrelerinde moleküler makineleri apoptotik hücreleri temizlemek için makrofajlar tarafından kullanılan bir çok benzer ve her ikisi de fagositik enkaz 7-9 maruz fosfatidilserin tanınması bağlıdır. Yine, RPE hücreleri ve makrofajlar ph düzenleyenmakrofajlar karşılaşma anda apoptotik hücrelerin hemen ortadan kaldırılması için tercih olarak agocytosis farklı, RPE hücreleri ritmik dış kesimleri ile sürekli temas rağmen bir günde sadece bir kez POS yutmak ise. Bu henüz tam olarak anlaşılmış değildir özgü düzenleme mekanizmalarını önerir. RPE fagositik makine implike moleküllerin bir çoğu bu tanımlanmış ya da izole edilmiş bir POS ve hücre kültürü fagositoz tahlillerin kullanımı sayesinde doğrulanmıştır. onun ligandı MFG-E8 ile koordineli olarak RPE apikal hücre yüzeyinde bulunan alfa beta5&#39;in integrin reseptörü, ardından MerTK tirozin kinaz reseptörü 13-15 yoluyla içselleştirilmiş olan POS 10-12, özellikle bağlanır. CD36 çöpçü reseptör POS alımı katılmak ve hızını 16,17 etkilemek için gösterilmiştir, ve POS yüzeyi 18 oksitlenmiş fosfolipidlerin bir sensör olarak kullanılabilir. Içselleştirilmesi F-aktin hücre iskeleti-eşek işe ihtiyacıBöyle anneksin 2 19, miyozin II 20 ve miyozin VIIA 21,22 olarak ociated proteinler. In vitro olarak doğal ya da oksitlenmiş POS da az sindirilmiş oksitlenmiş POS 23-28 birikimine bağlı, in vivo olarak, RPE hücreleri yaşlanma fenotipleri anlamak için kullanılmaktadır. akış önleme hücrelerinden hasıl RPE hücrelerinin üretimi, hayvanların ya da hasta 29,30,27 nakledilen önce hücrelerin özelliğe kanıtlamak için kullanılan izole edilmiş bir POS için yeni bir uygulama başlatmıştır. İlk 1987 yılında 31 Molday ve arkadaşları tarafından tarif, sığır POS izolasyonu için protokol (11- sis retina taşıyan) ağartılmamış retina photopigment karakteristik portakal görünümü gözlem sürekli sakaroz Yokuşta retina homojenatlarının bir Ultrasantrifügasyon adımını birleştirir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde, deli dana hastalığı riskini en aza indirmek amacıyla alınan önlemler nedeniyle, domuz gözlerin kullanımı increasi haline gelmiştirngly belirgin. Burada açıklanan protokol domuz veya numune alınır ve uzun bir süre boyunca saklanabilir sığır gözlerden POS büyük miktarlarda elde etmek için nasıl kullanılacağını gösterir. Bu POS hazırlanması ve analiz 32,33,21,22 başına hayvan çok sayıda kullanımını gerektiren, kemirgen gözlerden POS hazırlanması ihtiyacını ortadan kaldırmaktadır. Buna ek olarak, floresan molekülleri kullanarak depolama önce POS etiketleme ile ilgili ayrıntılar ölçmek ve fagositoz tahlil 32,10 sonra etiketleme POS göre bazı uygulamalar için basitleştirilmiş ve karşılaştırılabilir bir şekilde POS görselleştirmek için, verilir. Bu nedenle, bu büyük stoklar deneyler birçok farklı tipte yeniden üretilebilirlik ve kullanım kolaylığı için izin verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

Retina pigment epitel (RPE) hücreler, fotoreseptör dış segmentleri (POS) harcanan yaşlı uzak parçalarının fagositoz hayati fonksiyonlarından biri Analizi in vitro yapılabilir. Fototransdüksiyon makineleri içeren membranöz diskler yığınları ile fotoreseptör dış segmentleri sürekli retinada yenilenmektedir. Harcanan POS RPE hücreleri tarafından günlük olarak elimine edilir. Kemirgen, domuz / sığır ve insan RPE hücreleri, benzer bir şekilde, çeşitli türlerden POS tanır. Küçük değişkenlik deneylerin büyük bir dizi performans sağlamak için, POS büyük bir stok domuz gözlerinin izole edilir ve eşit miktarlarda dondurulmuş olarak saklanır. Bu protokol, karanlıkta muhafaza edildiğinde, turuncu bir renk gösterir photopigments özelliklerini yararlanır. Loş kırmızı ışık altında, yarım kesilmiş açılan eyecups bir tampon içinde retinae toplanır. retinal hücre süspansiyonu, homojen bir devamlı sükroz gradyanı üzerinde süzüldü ve sütuna yüklenir. Cen sonratrifugation POS karakteristik turuncu bir renge sahiptir gradyanının üst kısmında ayrı bir bant bulunur. POS daha sonra toplandı, bükülmüş, yıkama tampon içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, sırasıyla, sayılır ve bölünür. Bu şekilde elde edilen POS fagositoz tahlilleri ve POS uygulamasından sonra, çeşitli zamanlarda protein aktivasyonu, lokalizasyonu veya etkileşim analizi için kullanılabilir. Alternatif olarak, POS ör. Florofor ile etiketlenebilir örn., FITC, daha sonra floresan bağlayıcı POS miktarının veya yutulma için aliquoting önce. Diğer olası uygulamalar oksidatif stres ya da RPE hücrelerinin yaşlanma etkilerini incelemek için stres koşulları ile birlikte modifiye POS veya POS meydan kullanımını içerir.

lineer sakroz derecesi ve ultra-santrifüj kombinasyonu yoğunluğu retinal süspansiyon, farklı bileşenlerin ayrılmasına izin verir. Ağır büyük retina döküntü ve RPE hücreleri gradyanı (Şekil 2A) tabanına veya yakınındaki batar. Retinadan Çakmak POS ve hafif tek tek hücreler veya hücre enkaz santrifüj dönemi sonunda degrade üst yarısını ulaşmak için ayrı bantları göç. Santrifüj adım sonrasına kadar karanlıkta gözleri ve örnekleri tutarak, POS içeren grup derhal pa...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Retina Pigment Epitel Hücreleri üzerinde Fagositoz Tahliller için Domuz veya Sığır fotoreseptör dış Kesimleri Büyük Ölçekli Arıtma

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Görüntüleme.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Video: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

Havayolu Epitel Hücreleri üzerinde Lenfositik mikrotanecikler ve proapoptotik Etkisi Algılama Üretimi

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi<em&gt; Drosophila</emEmbriyolar

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...