Biz MRC İngiltere (G0800498) mali destek kabul etmek istiyorum. Biz de antibiyotik direnci içeren pCDNA 3.1 (+) ekspresyon vektörleri sağlamak için, GABA A -R altbirim-spesifik γ2 antikor ve Profesör R. Harvey, Eczacılık UCL Okulu sağlamak için, Profesör JM Fritschy, Zürih Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum kararlı biçimde transfekte edilmiş HEK293 hücre çizgilerinin üretilmesi için genler içerir.

<ol>
	<li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development.">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li><li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABA+excitatory/inhibitory+shift+in+brain+maturation+and+neurological+disorders.">The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).</li><li>Structure Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pharmacology,+and+function+of+GABAA+receptor+subtypes.">pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes.</a> Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).</li><li>Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+action:+opening+of+ligand-gated+ion+channels.">Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels.</a> Cell. 72, 31-41 (1993).</li><li>Homanics, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+gamma-aminobutyrate+type+A+receptor+beta3+subunit+have+epilepsy,+cleft+palate,+and+hypersensitive+behavior.">Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).</li><li>Gunther, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine-insensitive+mice+generated+by+targeted+disruption+of+the+gamma+2+subunit+gene+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).</li><li>Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptor+diversity+and+pharmacology.">GABA(A) receptor diversity and pharmacology.</a> Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).</li><li>Low, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+neuronal+substrate+for+the+selective+attenuation+of+anxiety.">Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety.</a> Science. 290, 131-134 (2000).</li><li>Rudolph, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine+actions+mediated+by+specific+gamma-aminobutyric+acid(A)+receptor+subtypes.">Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes.</a> Nature. 401, 796-800 (1999).</li><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).</li><li>Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity+of+the+GABAA+receptor+shapes+unique+pharmacological+profiles.">The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles.</a> Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).</li><li>Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+clustering+of+major+GABAA+receptor+subtypes+requires+the+gamma+2+subunit+and+gephyrin.">Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin.</a> Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).</li><li>Schweizer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gamma+2+subunit+of+GABA(A)+receptors+is+required+for+maintenance+of+receptors+at+mature+synapses.">The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).</li><li>Belelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+GABAA+receptors:+form,+pharmacology,+and+function.">Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).</li><li>Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors+is+determined+by+receptor+beta+subunits.">Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).</li><li>Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cell+surface+expression+of+heteromeric+and+homomeric+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).</li><li>Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-+and+input-specific+differences+in+the+number+and+subtypes+of+synaptic+GABA(A)+receptors+in+the+hippocampus.">Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).</li><li>Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+synapse-specific+clustering+of+GABA(A)+receptors.">Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors.</a> Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).</li><li>Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+heterogeneity+of+GABAergic+synapses.">Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).</li><li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex.">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+sensitivity+to+Zolpidem+of+IPSPs+activated+by+morphologically+identified+CA1+interneurons+in+slices+of+rat+hippocampus.">Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).</li><li>Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-dependent+synaptic+targeting+of+alpha(2)-subunit-containing+GABA(A)+receptors+in+synapses+of+hippocampal+pyramidal+cells+of+the+rat.">Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat.</a> Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).</li><li>Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartography+of+neurexin+alternative+splicing+mapped+by+single-molecule+long-read+mRNA+sequencing.">Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).</li><li>Siddiqui, T. J., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organizing+complexes.">Synaptic organizing complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+architecture+of+cell+adhesion+mediated+by+polymorphic+synaptic+adhesion+molecules+neurexin+and+neuroligin.">Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin.</a> Cell reports. 2, 101-110 (2012).</li><li>Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurexins+and+neuroligins+in+the+formation,+maturation,+and+function+of+vertebrate+synapses.">The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexins+induce+differentiation+of+GABA+and+glutamate+postsynaptic+specializations+via+neuroligins.">Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins.</a> Cell. 119, 1013-1026 (2004).</li><li>Dong, N., Qi, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstitution+of+functional+GABAergic+synapses+with+expression+of+neuroligin-2+and+GABAA+receptors.">Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors.</a> Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).</li><li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses.">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).</li><li>Ventimiglia, R., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 371-393 (1998).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+GABA(A)+receptor+subunits+in+relation+to+rat+striatopallidal+and+pallidopallidal+synapses.">Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses.</a> Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).</li><li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain:+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits.">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).</li><li>Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+thalamic+innervation+of+direct+and+indirect+pathway+medium-sized+spiny+neurons+in+mouse+striatum.">Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).</li><li>Lalchandani, R. R., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+collaterals+in+genetically+identified+medium+spiny+neurons+in+mouse+primary+corticostriatal+cultures.">Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures.</a> Physiological reports. 1, (2013).</li><li>Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+synaptic+localization+of+two+major+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptor+alpha+subunits+on+hippocampal+pyramidal+cells.">Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+expression+screen+for+synaptogenic+proteins+identifies+the+LRRTM+protein+family+as+synaptic+organizers.">An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers.</a> Neuron. 61, 734-749 (2009).</li><li>Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+autism-linked+MDGAs+and+neuroligins+suppresses+inhibitory+synapse+development.">Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development.</a> J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).</li><li>Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+discovery+of+glypican+as+a+receptor+for+LRRTM4+in+regulating+excitatory+synapse+development.">Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development.</a> Neuron. 79, 696-711 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol gerçekleştirmek için teknik olarak zor olmasa da, en doğru ve tekrarlanabilir ko-kültür deneyleri ulaşmak için takip edilmesi gereken birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, kültürlenmiş orta spinal nöronların optimal bir yoğunlukta tohumlanmıştır gerekir. Çok seyrek numaralı seribaşı ise, nöronlar çok yavaş geliştirmek eğilimindedir ve hayatta kalma büyük ölçüde azalır. Çok yoğun tohumlanır, Öte yandan, nöronlar HEK 293 hücreleri ile temas analizini ödün bu topaklaşma eğilimi. İkinci olarak, geçici olarak sabit bir şekilde önceden ko-kültür içine Platting için GABA bir Rs eksprese eden HEK293 hücrelerinde bir flüoresan raportör, GFP veya mCherry ifade etmek için önerilmektedir. Bu durum, bu hücreler ve nöronal kültürlerinde en nadir glial hücre arasındaki şekil ve büyüklük açısından benzerlik tehlikeye olabilir HEK293 hücrelerinde, güvenilir tanınmasına imkân verir. GFP veya MCherry cDNA ile verimli transfeksiyona elde edilmesi için, HEK293 hücre çizgileri üslü büyüme fazında olması ve6-yuvalı plakalar içinde uygun bir yoğunlukta tohumlanmıştır. Transfeksiyonu takiben seyrek ekim aşırı-besleme cDNA alarak gelen hücreleri önleyecektir süre hücreleri zayıf büyümesine neden olur. Transfeksiyondan bir gün% 90 konfluent - bunlar 70 arasında olduğu İdealde Hücreler olmalıdır. Bazı hücre çizgileri diğerlerine göre daha duyarlı Üçüncü olarak, transfeksiyon, kullanılan her bir hücre hattı için optimize edilmelidir. Kurucu GABA HEK293 hücrelerinde A, R&#39;nin sentezleme hücre hayatta kalma ve transfeksiyondan sonra geri hücrelerin yeteneğini azaltan olmasıdır. Ayrıca, hayatta kalma, bazı hücre çizgileri belirgin olarak diğerlerine göre daha duyarlı olan, HEK293 hücrelerinde ifade GABAA Rs türüne bağlıdır. Lipozomal bir reaktif kullanılarak transfeksiyonu, hızlı büyüyen hücre hatları yabancı proteinlerin ifade yüksek transfeksiyon verimi ve ifade düzeyleri hem de sağlamak için bir en uygun metottur. Bununla birlikte, bu reaktifin, yavaş gelişen hücre çizgileri için çok hasara neden olurhangi düzenli olmayan bir lipozom transfeksiyon reaktif kullanın. Bu lipozomal reaktife benzer bir şekilde çalışır, ancak etkili transfeksiyon için gerekli DNA miktarı önemli ölçüde azalır. Bu, daha yüksek hücre yaşamını sağlar (aşağı yukarı 80-90% 60, elüsyon için% lipozom tepkin madde ile karşılaştırıldığında) daha düşük transfeksiyon verimi (% 60). Son olarak, kontrol HEK293 ya α1 sayısı / β2 / γ2 HEK293 nöron kültürleri ile ilave ifade eden hücrelerin optimize edilmesi gerekmektedir. Onlar çok nadir olur çünkü çok az hücre ekleme, HEK293 hücreleri ve nöronlar arasındaki temasların başarılı analizini uzlaşma. Tersine, çok fazla HEK293 hücrelerinin eklenmesi birkaç saat içinde nöronal hücre ölümüne neden olur. Embriyonik orta dikenli nöron kültürleri ideal embriyonik 15 yaş disseke striyatal doku kullanılarak hazırlanmış olmalıdır - Ancak 17. sık sık embriyolar optimal yaşında biraz daha genç veya daha yaşlı olduğunu olur. Bu durumda, bu durum nöron sayısının kültür tohumlanmış olacakdeğiştirilebilir olması gerekir. E15 daha küçük olan bir ince E17 optimum hücre hayatta kalmasını garantileyen, daha yüksek bir yoğunlukta ekildi gerekebilir daha eski olan doku iken, biraz daha düşük bir yoğunlukta ekildi gerekebilir. Ayrıca, sitosin arabinosid (ARA-C) yaşlı dokuda daha fazladır glia büyümesini önlemek için, daha eski kültürlere ilave edilmesi gerekebilir. Ko-kültürler oluşturulurken, yukarıda belirtildiği gibi, bu transfekte edilmiş HEK293 ya α1 / β2 / γ2 HEK293 ifade eden hücrelerin optimum sayısı plaka önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni hayatta kalmak farklılıkları, her bir hücre hattı için bu belirlemek için gerekli olabilir. Bu koşullandırılmış ortam nöronal çok seyreltilmez sağlar ve tipik olarak 50 ul maksimum hacimde 30,000 hücre, daha önce nöronal kültür ortamında 500 ul ihtiva eden bir 24-yuvalı tabak, her bir oyuğuna ilave edilmelidir koşullar, bu Her içinde iyi, örneğin oldukça sabit kalır </em&gt; Büyüme faktörlerinin konsantrasyonu. Iyi hacimleri her fazla 50 ul ekleyerek genellikle nöronlar öldürecekti. Ko-kültür tekniğin en önemli dezavantajlarından biri, nöronal kültürler nöron normal mikro-çıkarılır ve normal anatomik organizasyonu kuramadý edilmiş olduğu anlamına gelir, bir tek tabaka olarak yetiştirilen ayrışmış hücrelerden oluşturulmuş olmasıdır. Bu nedenle sinaps gelişmenin ilk aşamalarını etkileyebilecek diğer hücrelerden uygun bağlantıları, giriş ve salgılanan molekülleri yoksundur. Örneğin, in vivo orta dikenli nöronlar yoğun bu girişler striyatal doku diseksiyonu sırasında zarar görmesinden dolayı Glutamaterjik sinapslar oluşturmak yok bizim nöronal kültürlerde, ancak, korteks, talamus ve diğer beyin bölgelerinde 34 Glutamaterjik girdiler ile innerve. Ne kültürlenmiş orta spinal nöronlarının fonksiyonel glütamaterjik sinapslarda büyük olmaması affects GABA A R&#39;leri ifade birbirleriyle ve / veya HEK293 hücreleri ile GABA&#39;erjik sinaps oluşturmak için kendi yetenek açık bir soru kalır. Bu soru, kolayca kortikal glutamaterjik nöronlar böylece onları 35 önceden HEK293 hücrelerine eklenmesinden fonksiyonel sinaps oluşturmak için izin birlikte orta spinal nöronların kültürlenmesi ile ele alınabilir. Alternatif bir yaklaşım, olgunlaşması ve sinaps oluşumu için önemli olabilir hücre mimarisini bazı korumak organotipik kesit kültürlerinde dayanan bir ko-kültürü modeli tasarım yaklaşımları olacaktır. Ancak, Organotipik dilim kültürleri burada yapılan analiz tehlikeye düşürebilecek yoğun ve heterojen neuropil var. Bu, yeteri kadar yüksek bir yüzey ekspresyonunu 30 belirli bir sinaps oluşumu için gerekli olmadığı görülmüştür, ancak ko-kültür deneyleri kullanılarak bir diğer önemli dezavantajı, GABA A TL bu nöronlar gibi toplaşmamıştır: HEK 293 hücreleri yüzeyinde ifade olmasıdır. Örneğin, rOdent beyin ve hipokampal kültürlerde, α1 GABA A, R&#39;nin alt birim arasında piramit şeklindeki hücreler her postsinaptik etki çoğu GABA sinapslar içinde bulunur. Ancak, α2 özellikle somata üzerindeki sinapslar ve dendritler bir alt kümesi bulunur ama immunofloresans ve elektron mikroskopisi 36 bildirdiği gibi son derece akson ilk segmentinde zenginleştirilmiştir. Eş kültürlerinde sinaps oluşumu hala güvenilir bir şekilde tespit edilebilir olduğu göz önüne alındığında, 30 analiz, bu HEK293 hücrelerinin hücre yüzeyinde GABAA Rs yoğunluğu sinaptik olan bu reseptörlerin yoğunluğundan daha benzer ya da daha yüksek olabileceğini düşündürmektedir nöronlarda kümeleri. Bu, en azından bu tür gephyrin gibi neuroligin sinaptik yapışma proteinleri, ve postsinaptik yoğunluğu proteinler, uygun bir şekilde monte edilmiş GABA A TL yeterli mevcut ise, eş kültürlerinde sinaps oluşumu için gerekli değildir bu yüzden kısmen üzere, açıklayabilir yoğunluğu. İyi GABA A Rs yapısal ve işlevsel heterojen olduğu belgelenen ve reseptör birim bileşimi onların hücre içi lokalizasyonu ve farmakolojik özelliklerini belirler. Alt birim hemen hemen sadece mevcut extrasynaptic GABA A Rs olduğu Örneğin, 2 alt birimlerin dahil GABAA Rs sinaptik lokalizasyonu için bir şart olduğu bilinmektedir. Sadece kombinasyonları αβ dahil reseptörleri de ağırlıklı extrasynaptic etki 12- 14 lokalize olduğu düşünülmektedir. Bu özgüllük Bizim eş-kültür sistemine muhafaza olup olmadığı kolayca, geçici olarak nöron kültürleri ile eklemeden önce, sabit bir şekilde α ve β alt-birimlerini eksprese eden HEK293 hücre çizgilerine 2 ya da alt birim cDNA&#39;lar transfekte edilmesiyle test edilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak yapılan ön deneyler sinaptik iletişim kolaylıkla tarifhamesinden belirten, sadece 2 alt biriminin varlığında oluşmuş olduğunu ileri sürmüşlerdirin vivo olarak gözlenen, özgüllük, in vitro olarak korunmuş olması muhtemeldir (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, farklı α alt birimleri içeren GABA A Rs seçici presinaptik nöronların belirli tipleri ile oluşan sinaptik kişileri yerelleştirilmiş. Örneğin, globus pallidus olarak, α1-GABA A TL genel striatopallidal (STR-GP), sırasıyla, dendrit ve orta spinal nöronların somatik bölgelerinde yer almaktadır palliopallidal (GP-GP) sinaps, bulunur. Α3-GABA A Rs orta dikenli nöronların perisomatic bölgelerde bulunan ve bu nöronların distal dendritlerde bulunan ve striatum 32 girişlerine tarafından öncelikle temas α2-GABA A Rs ederken, yerel GP akson teminatlar ile temas ettirilir. Sinapsların ve farklı nöronal bölümlerinde farklı belirli α alt birimlerinin sentezlenmesi, aynı zamanda, Hipp gibi diğer beyin bölgelerinde ortaya konmuşturocampus 21 ve 18,20 neokorteks. Bu bulgular spesifik inhibitör sinapslar beyinde nasıl oluştuğunu olarak soruyu. Presinaptik terminal belirli bir tip yapışma temas noktaları içine belirli GABA A R alt tiplerinin yerleştirilmesini neden mi? Reseptörleri plazma zarı ekleme belirli bir kökeni aksonal terminallerinin yapışması için bir ön koşul olan kendi alt-birimi bileşimi göre, spesifik hücre içi yerle kaçırılan mı? Bugüne kadar, bu sorular cevapsız kalır. Bu tür ko-kültür model sistem olarak indirgenmiş modeli sistemlerinde kullanımı, sistem önemlisi, DNA yapılan ve reaktifler uygulama transfeksiyonu kolayca uyum sağlar ve bu nedenle, bu karmaşık sorulara cevap başlatmak için izin, canlı hücre görüntüleme analizi için de uygundur 30. Bu nedenle, bu model sistemi kullanarak bildiğimiz GABA bir Rs farklı türleri dahil olmak üzere tek tek moleküller, rolü test başlayabilirn sinaptik kişileri mevcut olması. Bir başka avantaj dakika içinde sonrası hızlı bir şekilde, bu model sistemi formunda sinaps, deney süresini azaltmak olmasıdır. Benzer ko-kültürü modeli sistemleri, başarılı bir şekilde yeni synaptogenic molekülleri 27,37,38 taranması için geçmişte kullanılmıştır. Merkezi sinir sistemi nasıl geliştiğini anlamak, olgunlaşır ve örnek davranış veya biliş için kontrol çok girift nöronlar arasındaki bağlantıları oluşturmaktadır, temel öneme sahiptir. Bu uzak esas ancak gelişimi esnasında tanıma ve hücre-hücre iletişiminin bireysel aşamalarını düzenleyen moleküler mekanizmaların ortaya koymayı ile elde edilir. Nedeniyle saf karmaşıklığı, Bu bir çok selüler etkileşimlerin moleküler ayrıntıları şu sadece düşürülmüş sistemleri hassasiyetle incelenebilir. Bununla birlikte bu proteinlerin çoklu kombinasyonlar sentezleyen ve nasıl inceleyerek bu sistemlerin karmaşıklığını artırmak içinbunlar, örneğin, genetik silme yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında bazı avantajlara sahiptir etkileşim. Bir gen silme etkilerinin kesin yorumlanması Genellikle, özellikle gelişmekte olan beyinde, orijinal lezyonların maskeleme etkilerini telafi eden mekanizmalarla bağlantılıdır değişikliklerden tehlikeye olmasıdır. Burada anlatılan basit ama bilgilendirici ko-kültür tekniği sinaps oluşumu GABA A Rs yapısal rolünün bir keşif izin ve GABA A R ve diğer hücre yapışma molekülleri ve / veya sinaptik matriks proteinleri birbirleri ile etkileşim nasıl araştırmak için bir olasılık açtı sinaptogenez sırasında. Sinaptik matriks proteinleri son zamanlarda Glutamaterjik sinaps oluşumu 39 önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ki verilen özel bir öneme sahiptir. Onlar &#39;normal ve rehberlik moleküler mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için potansiyele sahip çünkü ko-kültür modelleri daha da geliştirilmesi önemlidir# 8217; beyin gelişimi ve dolayısıyla bu mekanizmaları epilepsi, şizofreni, otizm spektrum bozuklukları ve diğerleri gibi birçok nörogelişimsel hastalıklar, değişmiş nasıl anlayışımızı artırmak.

GABA en bol uyarıcı nörotransmiter glutamat 1 önceki embriyonik beyinde bulunan erken nörotransmitterlerin biridir. Gelişimi sırasında, GABA eksitotoksisiteyi yaratmadan hücre çoğalması, göç ve nöral ağların oluşumunu düzenleyen önemli bir rol oynayan, olgunlaşmamış nöronlar depolarizes ve heyecanlandırıyor. Yetişkin beyin GABA A reseptör kanalları için olan ters potansiyel nedeniyle klorid hücre içi konsantrasyonundaki bir azalma daha negatif potansiyellere kaydırılır. Bu değişim, paralel, yukarı-regülasyonu hücre dışına klorür taşımaları potasyum klorür ko-transporter (KCC2), ve neden, ve aşağı regülasyonu olan sodyum-potasyum klorür transporter (NKCC1), ve ters etkisi 2. Beyinde, GABA, esas olarak, hızlı veya yavaş sinaptik önlenmesine aracılık eder GABA A ya da GABAB ya reseptörlerine, ilgili bağlananly. GABA A TL ayrıca heteropentamerik iyonotropik veya ligand-kapılı Cys-köprüsü iyon kanalları olarak da bilinen reseptörlerinin bir sınıfıdır. GABA iki molekül, bikarbonat iyonları, klorür iyonlarının ve daha düşük bir dereceye kadar geçirgen olan reseptörün aktivasyonu için gereklidir. Klorit iletimindeki artış sinaptik sonrası nöronu 3 aktive edilmesinde depolarize edici, uyarıcı etkinlikleri etkinliğini azaltmaktadır. GABA A Rs yapısal çeşitlilik uzun fonksiyonel ve farmakolojik özellikleri onların geniş belirlemede önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir. Ortak olan α (1-6), β (1-3), γ (1-3), π, ε, δ ve θ 3: Doğal GABA A TL olarak sınıflandırılan çok sayıda izoformları ile alt üniteden oluşan hetero pentamerler olan Büyük bir N-terminali hücre-dışı alanını, dört transmembran (TM) ve TM&#39;lerin 3 ve 4 4 arasında büyük bir hücre içi alanı içeren zar topolojisi.Bu alt birimlerinin genetik silinmesini taşıyan fareler doğumdan 5,6 sonra ölmek için β3 ve γ2 alt birimleri, sinaptik inhibisyonu ve organizma hayatta kalmak için gerekli. Bunun aksine, α alt birimi tek tek izoformları, anksiyete, sedasyon, uyarılma ve diğerleri gibi farklı davranışlar ile bağlantılı beyin özel sinaptik bağlantıların fonksiyonu için önemli olan, fakat, ayrı ayrı, yaşam 7-9 için gerekli değildir. GABA A Rs güçlü sedatif, hipnotik, anksiyolitik ve benzodiazepinler, barbitüratlar, nörosteroidler ve anestezik 7,10,11 gibi antikonvülzan etkileri ile ilaçların çeşitli eylem ana yerleridir. Sinaptik GABA A TL tipik olarak γ2 altbirim (en yaygın β2 veya β3) iki β alt birimi ve iki α alt birimi (α1, α2, α3 veya α5) 12,13 ihtiva etmektedir. Extra-sinaptik reseptörlerinin baskın sınıfı, kombinasyon halinde δ alt ünitesinden oluşurİki α-birimden (α4 veya α6) ve iki β alt birimlerine (β2 veya β3), 14 ile. Plazma zarına aksonlar, dendrit ya soma ve sokulmasından GABAA Rs alt hücre lokalizasyonu, β-alt-birimlerinin 15,16 varlığına bağlıdır. Ancak, farklı GABA A R seçici eklenmesi spesifik α alt birimden (α1, α2, α3 veya α5) 7,17,18 varlığı ile iyi korelasyon sinapsların farklı türlerde alt tipleri. Önemlisi, farelerde α1 veya α2 alt biriminin silinmesi inhibitör sinapsların 19 de ultrastrüktürel değişikliklere neden olur. Bu GABA A sinaps oluşumunu düzenleyen doğrudan bir rol oynayabileceğini kendilerini rs düşündürmektedir. Kanıt GABA&#39;erjik sinaps gelişimi nöronal hedefleri de farklı inhibitör akson türleri ve öbeklendirilmiştir reseptörleri tarafından temas eden olaylar hassas bir şekilde koordine dizisi olduğunu gösteririnhibitör sinaps her sınıf seçici ve 17,20-22 işlevsel alıştırılır. GABA&#39;erjik sinaps spesifisitesinin temel ilke öncesi ve postsinaptik ortakları sinaptik bağlantıları başlatılması sırasında birbirini tanımasını nasıl olduğu sorusunu gündeme getirmektedir. İn vitro ko-kültür deneyleri, sinaps oluşumu bazı mekanizmaların çalışma ve bu işlem tek tek sinaptik geçişli proteinlerin rolünü test etmek için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Sinaps oluşumu ve olgunlaşması aracılık ettiği iki-yönlü olarak işlev gören ortak bir şekilde trans-sinaptik etkileşimli protein kombinasyonlarının biri Neurexins (Nrxns) ve Neuroligins (NLS) bulunmaktadır. Nrxns çok farklı izoform 23 sebebiyet veren kendi laminin neurexin-seks hormonu bağlayıcı protein alanları içindeki alternatif birleştirme sergileyen presinaptik proteinlerdir. Nrxns başka proteinlerle de etkileşime giren birlikte, NLS bunların her yerde postsinaptik pa olduğu düşünülmektedir24 rtners. Birlikte bu proteinler yakın ve sert appozisyonun 25 presinaptik ve postsinaptik membranlar tutarak katkıda bulunur. En bol iki izoformu uyarıcı ve inhibitör sinaps, sırasıyla 26 mevcut olan NL-1 ve NL-2 bulunmaktadır. Trans-sinaptik protein etkileşimlerini incelemek üzere tasarlanmış ilk ko-kültür modeli sistemlerinde biri, nöronal olmayan hücrelerin farklı kullanılan, örneğin aşırı ifade NL- üzere, insan embriyonik böbrek (HEK) 293 hücreleri gibi en yaygın olarak ölümsüz hücre çizgileri 2. Bu hücreler pontin nöronlarla kültürlenmiştir zaman, HEK hücre yüzeyine yakın presinaptik protein birikimi sinaps benzeri kontaktların oluşumunu gösteren gözlenmiştir. Bu ko-kültürlerde çözünebilir β-neurexin ilavesi Nrxns ve UL&#39;lere arasında, trans-sinaptik etkileşimleri sinaptik iletişim oluşumu 27 için gerekli olduğunu düşündürmektedir temas oluşumunu inhibe etmiştir. Ayrıca, geçici sentezlemeCOS β-neurexin ayrışan hipokampal glutamaterjik ve GABAerjik nöronlar postsinaptik proteini gephryin ve GABA A, R&#39;nin alt birimlerinin ile uyarılan ifadesi, birlikte kültürlenmiş bir (Cı V-1 (O rigin olarak) maymun ve S V40, genetik malzeme taşıyan), hücrelerin Bu iki hücre tiplerinde 28 arasındaki temas noktalarında γ2 ve α2. Sinaps oluşumunu araştırmak için kullanılan bir ko-kültür modeli başka örnek geçici GABA A R ile α2 / β3 / γ2 ve NL-2 ve hipotalamus nöronları 29 karışık bir nüfus alt birimleri transfekte HEK293 hücrelerinin, çıkıyor. Bu çalışma, NL-2&#39;nin ifadesi önleyici sinaps oluşumu için mutlak bir gereklilik olduğu sonucuna varıldı. Ancak, son ko-kültür çalışmasında, stabil olarak aktarılan α1 / β2 / γ2 GABA A HEK293 hücrelerinde TL fonksiyonel sinaps oluşturmak için yeterli olduğu bulunmuştur birlikte kültüre edildiğinde, GABAerjik MedEk-trans-sinaptik ya da sinaps sonrası yapışma proteinleri için gerek kalmadan yum dikenli nöronlar. NL-2 GABA A Rs 30 ile birlikte eksprese edilmiştir, ancak, sinaps oluşumu ve mukavemetinde önemli bir artış gözlenmiştir. Bu, bu ko-kültürü modeli sistemi, daha önce tarif edildiği model sistemler, en açık artan bir hassasiyet ve sinaptik kontak algılama güvenilirliği üzerinde avantajlara sahip olduğunu göstermektedir. Sinaptik temasların saptanmasında genel iyileşmeye katkıda bulunan iki önemli faktörler şunlardır: i), ayrı ayrı hücrelerin yüzeyi GABA A, Rt alt-birimlerinin yüksek ve tutarlı bir ifade ile stabil olarak transfekte edilmiş HEK 293 hücre çizgilerinin kullanılması. Bu tutarlılık, farklı ko-kültür koşulları arasındaki nicel karşılaştırmalar kolaylaştırır. ii) embriyonik striatuma 31 kültüre GABA&#39;erjik orta dikenli bir nöron saf nüfusun kullanımı allo komplikasyonları ve karışık nöronal nüfus ve kullanımından kaynaklanan belirsizlikleri kaldırırsi, örneğin, sinaps oluşumu sırasında birbiriyle mukayese edilebilir, en uygun olan, postsinaptik GABA A, R&#39;nin tiplerinin tespiti. Sinaps oluşumu öncesi ve postsinaptik hücre yapışması komplekslerinin içinde birçok trans-sinaptik sinyalleri içerdiği düşünülmektedir. Nedeniyle sinaptik sinyalleri ve hücre adezyon moleküllerinin sırf sayılar çift yönlü doğası, bu sinaps oluşumunda yer alan temel bileşenleri tespit etmek zordur. Bu nedenle, bir nöronal olmayan hücre içine tek bir hücre yapışma proteini transfekte (bu durumda, in vivo, GABAerjik orta spinal nöronların için iki en yaygın post-sinaptik hedefler, α1 / β2 / γ2 veya α1 / β3 / γ2 GABA A TL 32), büyük ölçüde postsinaptik yüzeyde temin şekilde trans-sinaptik sinyallerin karmaşıklığını azaltır ve sinaps oluşmasını teşvik bu proteinin etkinliğini hassas analiz edilmesine olanak sağlamıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1601">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name</td>
			<td style="width:627px;">Company/Individual</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:396px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11960-044</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15070-063</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10106-169</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">21103-049</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glucose</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G8769</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HBSS (10X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14180-046</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15630-056</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">PBS (1X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10010-031</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td>
			<td rowspan="2" style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">V790-20</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V860-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V870-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Stable HEK&#945;1&#946;2&#947;2 line</td>
			<td style="width:627px;">Sanofi-Synthelabo, Paris</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1149</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">G418 disulfate salt (Geneticin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5013</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Phleomycin D1 (Zeocin)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">R25001</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10687-010</td>
			<td style="width:396px;">Danger: toxic, irritant and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25300-054</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use Danger: Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6282</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Laminin</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L2020</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">100 &#956;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">734-0004</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C1768</td>
			<td style="width:396px;">Danger: Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Chelating agent (Versene)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15040-033</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:469px;">liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15338-100</td>
			<td style="width:396px;">Alternative transfection method: Effectene Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td>
			<td style="width:627px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:111px;">301425</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11058-021</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">105311C5</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal A</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10888-022</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:111px;">27810.364</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glycine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1726</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A3294</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:469px;">Guinea pig anti-&#947;2 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Prof. Jean Marc Fritschy</td>
			<td rowspan="3" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">J. Comp. Neurol. 359 (1) 154&#8211;194 (1995).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:627px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">H5141</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB351</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-synapsin antibody</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">106-011</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-&#946;2/3 antibody (BD17)</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB341</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:469px;">Rabbit anti-&#945;1 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Professor Anne Stephenson</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP1085</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP124S</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A31553</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A21422</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A11008</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;"><a name="RANGE!A49">Mounting reagent (Prolong Gold)</a></td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">P36930</td>
			<td style="width:396px;">Use at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Bu nöron-HEK 293 hücre ko-kültür model sistemi için protokol ince optimum hücre yaşamasına izin ayarlı olmuştur. Bu sistemde, sinaps benzeri kontaktların oluşumu ve analiz, bir işlevsel reseptörü içine monte üç GABA A, R&#39;nin alt birimlerinin sabit ve sürekli ekspresyonuna dayanır. Bu nöron kültürleri ile eklemeden önce, HEK293 hücre yüzeyinde alt birim ekspresyonunu test etmek için imüno sito kimyasal analiz kullanmak için önemlidir. Bu deneylerde, α1, β2 ve γ2 birimden (Şekil 1A) veya α1, β3 ve γ2 birimden (Şekil 1B), hücre yüzey ifadesi, bu alt-birimlerin hücre-dışı epitopuna bağlanabilir alt-spesifik antikorlar kullanılarak tespit edildi. HEK293 yüzeyinde, bu alt-birimleri arasında eş-lokalizasyonu yüksek derecede gösterilmiştir. GABA A yüzey ifadesi ve ko-lokalizasyonunu doğrulandıktan sonraHEK293 hücreleri, ko-kültürlerde R, alt-birimleri α1 / β2 / γ2 GABA A, R&#39;nin alt birimleri ve 14 gün boyunca (in vitro 14 gün (DIV)) kültürlendi orta spinal nöronların eksprese eden HEK293 hücreleri kullanılarak hazırlanmıştır. Ko-kültür Hücreler sabitlendi, 24 saat boyunca kuluçkaya bırakıldı ve immünositokimya ve konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilmiştir. Kontakt Analizi GAD65-pozitif GABA&#39;erjik akson terminalleri kontrol HEK293 hücreleri (Şekil 2A, 2B) ile tek tük kişileri oluştuğunu belirtti. 4 saat sonra tespit temasların sayısı HEK 293 hücre başına 7.3 ± 0.9, ve bu sayı kültür nöronları için HEK293 hücrelerinin ilave 24 saat sonra HEK 293 hücre başına 5.5 ± 0.5 bağlantıları (ortalama ± SEM) düşürülmüştür. Buna karşılık, GAD65-pozitif GABA&#39;erjik akson terminalleri GABA A R&#39;leri ifade HEK293 hücreler ile çok sayıda sinaps gibi kişileri kurdu. HEK293 hücrelerinin ekledikten sonra 4 saatte elde edilen kontakların sayısı HEK293 hücre başına 28.3 ± 4.7 idi ve bu sayının daha da artması oldu52.1 ± 6.3 D ko-kültür, 24 saat (Şekil 2A, 2B) HEK 293 hücre başına (ortalama ± SEM). Bu sinaps benzeri iletişim olup olmadığını belirlemek için, &#39;aktif,&#39; yani veziküler verici serbest desteklenen bir vezikül-luminal etki alanına özel anti-synaptotagmin Cy5-konjüge edilmiş antikor, kuluçkalama 23 saat sonra eş-kültür ortamına ilave edildi. Bu antikor, sadece presinaptik sinir terminalleri içine dahil edildiği zaman, sinaptik vezikül lumen ve nörotransmitter serbest bırakılması sırasında, sinaptik aralık içinde hücre dışı sıvı arasında bir gözenek oluşur. Salınmasını takiben, gözenek Cy5-konjüge edilmiş floresan antikor vezikül içinde synaptotagmin bağlı synaptotagmin bırakarak kapatır. Bu şekilde, aktif nöro-ileticinin salıverilmesine yapan sadece veziküller antikor ile etiketlenir. Birkaç Bu deneylerde herhangi bir kumanda arasındaki temaslar HEK293 hücreleri ve orta dikenli nöron terminalleri olsaydı &#39;aktif &amp; #8217; HEK293 hücrelerinde presinaptik GAD65 / synaptotagmin floresans ve MCherry floresan (Şekil 3A) arasında eş-lokalizasyonu eksikliği ile gösterildiği gibi. Buna karşılık, birçok etkin &#39;iletişim orta spinal sinir terminalleri ve α1 / β2 / γ2 salgılayan GAD65 / synaptotagmin ve mCherry arasındaki eş-lokalizasyonu yüksek derecede ortaya koyduğu gibi, HEK293 hücreleri, spesifik olarak HEK293 hücrelerinde ifade edilen (arasında oluşmuştur Şekil 3B). Orta spinal nöronların ile HEK293 hücrelerinin sentezleyen GABA A, R&#39;nin farklı bir alt tipi, aynı zamanda, in vitro olarak sinaps benzeri oluşumunu teşvik olup olmadığını test etmek için, adres ortak-kültürlenir α1 / β3 / γ2. Yine, kontrol HEK293 hücreleri ender ulaşan sinapsin pozitif presinaptik terminali ile temas alınan ± 0.48, 10.8 ko-kültür (Şekil 4A, sol, 4B) &#39;de, 24 saat sonra HEK 293 hücre başına temas (ortalama ± SEM). Bununla birlikte, HEK293 hücreleri sentezleyensinapsin pozitif presinaptik ko-kültür 24 saat sonra HEK293 hücre başına 25.3 ± 0.27 (ortalama ± SEM) kişileri ulaşan orta dikenli nöron terminalleri (Şekil 4A hakkı ile sinaps gibi rehber α1 / β3 / γ2 GABA A TL formu önemli ölçüde daha fazla, 4B). Onların gücü α1 / β2 / γ2 içeren GABA A R&#39;leri kuvvetine göre daha düşük olsa bu α1 / β3 / γ2 GABA A TL HEK293 hücrelerinde ifade olduğunu gösterir, aynı zamanda sinaptik iletişim oluşumunu teşvik edebiliyoruz. Bu deneyler laboratuvarda geliştirilen ko-kültürü modeli sistemi bu işlemde GABAA Rs farklı alt tipi etkinliğinin sayısal in vitro sinaptik iletişim oluşumu analizinin yanı sıra değerlendirmesine izin verir olduğuna işaret etmektedir. Bu deneyler ayrıca, GABAerjik sinaps kritik fonksiyonel bileşenlerini olmanın yanı sıra bu GABA A Rs, göstermek önemli bir rol oynayabilirtanınması ve bağımsız bir şekilde, diğer sinaptik yapışma proteinlerinin önleyici sinirlerle ve uygun nöronal hedef hücreleri arasında olduğu, sinaptik temasların oluşum sürecinde. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1. immünositokimyasal GABA A, R&#39;nin α1 ekspresyon analizi / β2 / γ2 veya sabit bir HEK293 hücre hattında α1 / β3 / γ2. GABA A, R&#39;nin alt ünitelerinin hücre dışı alanları tanıyan antikorlar, hücre yüzeyinde eksprese etiket reseptörleri kullanıldı. ( A), HEK 293 hücre hattı ifade α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) ve yüksek düzeyde γ2 (Cy5). (B), HEK 293 hücre hattı ifade α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) ve γ2 (Cy5)yüksek seviyelerde alt-birimlerini. Ölçek çubuğu:. 10 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2. GABA&#39;erjik orta dikenli nöronlar ko-kültür HEK293 hücrelerinin ifade α1 / β2 / γ2- ile sinaps gibi kişileri oluşturur. (A), (sağ mavi,), floresan anti-GAD65 antikorları ile presinaptik terminallerin etiketleme (yeşil) ve veya GABA A, R&#39;nin γ2 alt birimi (kırmızı sol olarak) mCherry ile HEK293 hücreleri, bunlar arasında eş-lokalizasyonu noktaları ortaya ko-kültür, 4 veya 24 saat sonra, sinaps benzeri kontaktların oluşumunu gösteren belirteçler. Ölçek çubuğu:. 10 mikron (B) sinaps gibi co kantitatif analizi<html> rmal. Her a optik bölümünde göz ile sayılabilecektir DIC görüntüleme ve / veya ekspresyon MCherry, ve GAD-65 pozitif puncta (yeşil) ve HEK293 hücrelerinde yüzeyi arasındaki temasların sayısı ile ortaya çıktığı gibi, HEK293 hücreleri, şekil dayanarak belirlenmiştir Z yığın serisi (8-10) görüntüleme yazılımı kullanılarak hücre başına, ve kişiler / hücre sayısı olarak ifade edilmiştir. Grafik ko-kültür, 4 ve 24 saat sonra orta dikenli nöronların ve kontrol HEK293 hücreleri (açık gri) veya α1 / β2 / γ2-HEK293 hücreleri (siyah) arasındaki temasların sayısını gösterir (ortalama ± SEM, n = her 8 İki bağımsız deneyden gelen durum). Bu rakam Fuchs ve ark modifiye edilmiştir. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> reklam / 52.115 / 52115fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Şekil 3. GABA A RS sinaps gibi GAD65 için pozitif orta dikenli nöron terminaller arasındaki ko-kültür 24 saat sonra oluşan kontakları (Alexa Fluor 405 mavi) ve (A) kontrol HEK293 hücrelerinin. Immunolabeling aktif sinaptik bağlantıları oluşumunu teşvik veya (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 hücreler, geçici mCherry transfekte hem (kırmızı) inşa. Aktif iletişim presinaptik terminallerde hem vesikül lümen etki alanına özel anti-synaptotagmin antikoru (Cy5) ve GAD65 özgü antikor arasında eş-lokalizasyonu ile tanımlanır, ve MCherry HEK293 hücrelerinde ifade edilmiştir. Ölçek çubuğu:. 10 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> igure 4 &quot;fo: içerik-width =&quot; 6in &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52.115 / 52115fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Şekil 4. GABA&#39;erjik orta dikenli nöronlar ko-kültür HEK293 hücrelerinin ifade α1 / β3 / γ2- alt birimi ile sinaps gibi kişileri oluşturur. (A), bir anti-synapsin (sol) antikorlarının (yeşil) ve kontrol HEK293 hücreleri veya α1 olan presinaptik terminallerin floresan etiketleme / β3 / γ2 HEK293 hücrelerinin ifade eden, her iki geçici olarak (kırmızı) mCherry ile transfekte edilmiş, noktalarını ortaya ko-kültür 24 saat sonra sinaps gibi temasların oluşumunu gösteren bu işaretlerin arasında co-lokalizasyon. Ölçek çubuğu: 10 mikron (B). Sinaps gibi temasların kantitatif analizi. HEK293 hücreleri MCherry ifade ile tespit edildi ve sinapsin bir pozitif puncta (yeşil) ve HEK293 hücrelerinde yüzeyi arasındaki temasların sayısı Z yığın serinin her bir optik bölümünde göz ile sayıldı (8-10) görüntüleme yazılımı kullanılarak hücre başına ve rehber / hücre sayısı olarak ifade edilir. Grafik orta dikenli nöronlar ve kontrol HEK293 hücreleri (açık gri) veya α1 / β3 / γ2-HEK293 hücreleri (siyah) ko-kültür 24 saat sonrası arasında temasların sayısını gösterir (ortalama ± SEM, n = 8-12 hücreleri iki bağımsız deneyden her koşul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors at JoVE.com

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Ontojenliği sırasında inhibitör GABA&#39;erjik sinaps oluşumunu koordine moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu işlemleri incelemek için, fonksiyonel GABA A reseptörleri eksprese eden stabil olarak transfekte edilmiş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri ile birlikte kültürlendi embriyonik orta spinal GABAerjik nöronlar içeren bir ko-kültürü modeli sistemini geliştirdik.

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA&#39;erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade<sub&gt; A</sub&gt; Reseptörler

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

inhibitory-synapse-formation-co-culture-model-incorporating-gabaergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

17.3K Görüntüleme.  University College London.  Ontojenliği sırasında inhibitör GABA'erjik sinaps oluşumunu koordine moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu işlemleri incelemek için, fonksiyonel GABA A reseptörleri eksprese eden stabil olarak transfekte edilmiş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri ile birlikte kültürlendi embriyonik orta spinal GABAerjik nöronlar içeren bir ko-kültürü modeli sistemini geliştirdik. 

Video: Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Nörobilim

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Yalıtımlı LacZ ifade Sitometrisi kullanarak Fare İç Kulak Dokular Hücreler

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...