Nos gustaría reconocer el apoyo financiero del Reino Unido MRC (G0800498). También nos gustaría agradecer al Profesor JM Fritschy, Universidad de Zurich, para proporcionar el anticuerpo GABA AR-subunidad específica γ2 y profesor R. Harvey, Escuela de Farmacia de la UCL, para proporcionar el pcDNA 3.1 (+) vectores de expresión que contiene resistencia a los antibióticos genes para la producción de líneas celulares transfectadas de forma estable HEK293.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Aunque este protocolo no es técnicamente difícil de realizar, hay varios pasos críticos que se deben seguir para alcanzar los ensayos de co-cultivo más precisos y repetibles. En primer lugar, las neuronas espinosas medias cultivadas deben ser sembradas a una densidad óptima. Si sembrado demasiado escasa, las neuronas tienden a desarrollar muy lentamente y la supervivencia se reduce en gran medida. Por otro lado, si se sembraron demasiado densamente, las neuronas tienden a agregarse que compromete el análisis de los contactos con las células HEK293. En segundo lugar, se recomienda para expresar transitoriamente un reportero fluorescente, GFP o mCherry en células HEK293 que expresan establemente GABA A Rs, antes de platting ellos en el co-cultivo. Esto permite el reconocimiento fiable de las células HEK293, que puede verse comprometida por la semejanza en forma y tamaño entre estas células y raras células glía sobrevivir en cultivos neuronales. Para lograr la transfección eficiente con GFP o ADNc mCherry, las líneas celulares HEK293 tienen que estar en la fase de crecimiento exponencial ycabeza de serie en la densidad adecuada en placas de 6 pocillos. Siembra Sparse seguido por transfección hará que las células crezcan mal, mientras que sobre-siembra evitará que las células de tomar el ADNc. Idealmente, las células deben ser sembradas para que estén entre el 70 - 90% de confluencia en el día de la transfección. En tercer lugar, la transfección debe ser optimizado para cada línea celular utilizada, ya que algunas líneas celulares son más sensibles que los demás. Esto es debido a GABA Una expresión constitutiva R en células HEK293 reduce la supervivencia celular y la capacidad de las células para recuperarse después de la transfección. Por otra parte, la supervivencia depende del tipo de Rs GABA A expresada en células HEK293, con algunas líneas celulares de ser significativamente más sensible que los otros. La transfección usando el reactivo liposomal es un método óptimo para la expresión de proteínas extrañas en líneas de células de crecimiento rápido, proporcionando tanto la alta eficiencia de la transfección y el nivel de expresión. Sin embargo, este reactivo causa demasiado daño a las líneas de células de crecimiento lento, porque utilizamos regularmente un reactivo de transfección liposomal no. Esto funciona de forma similar al reactivo liposomal pero la cantidad de ADN necesario para la transfección eficiente se reduce significativamente. Esto permite una mayor supervivencia de las células (aproximadamente el 80 - 90% en comparación con 60% usando reactivo liposomal) pero con menor eficiencia de transfección (60%). Por último, el número de HEK293 control o α1 / β2 / γ2 HEK293 que expresan las células añadidas a cultivos neuronales necesita ser optimizado. Adición de muy pocas células compromete el éxito del análisis de los contactos entre las células HEK293 y las neuronas, porque se vuelven muy raro. Por el contrario, la adición de demasiadas células HEK293 causa la muerte de las células neuronales dentro de pocas horas. Cultivos de neuronas espinosas medianas embrionarias idealmente deben ser preparados usando tejido estriado disecados de edad embrionaria 15 - 17. Sin embargo, a menudo sucede que los embriones son un poco más joven o más viejo que la edad óptima. En este caso, el número de neuronas sembradas en Culturanecesitará variar. El tejido que es menor de E15 puede necesitar ser sembradas a una densidad ligeramente inferior, mientras que el tejido que es mayor de E17 puede necesitar ser sembradas a una densidad más alta, para permitir la supervivencia celular óptimo. Además, puede ser necesario añadir a los cultivos de más edad para prevenir el crecimiento de la glía, que es más abundante en el tejido mayores arabinósido de citosina (Ara-C). Al crear co-cultivos, es importante a la placa el número optimizado de HEK293 transfectadas o α1 / β2 / γ2 células HEK293 que expresan, como se mencionó anteriormente. Sin embargo, puede ser necesario para determinar esto para cada línea celular individual, debido a las diferencias en su supervivencia. Típicamente 30.000 células en un volumen máximo de 50 l, debe añadirse a cada pocillo de una placa de 24 pocillos, que ya contiene 500 l de medio de cultivo neuronal, ya que esto asegura que el medio acondicionado no neuronal se diluye demasiado y que las condiciones dentro de cada pocillo permanecer bastante constante, por ejemplo, </em&gt; La concentración de factores de crecimiento. Adición de volúmenes superiores a 50 l a cada pocillo sería generalmente matar a las neuronas. Una de las principales desventajas de la técnica de co-cultivo es que los cultivos neuronales son creados a partir de células disociadas cultivadas como una monocapa, lo que significa que las neuronas se han eliminado de su microambiente normal y no son capaces de establecer su organización anatómica normal. Por lo tanto carecen de las conexiones adecuadas, insumos y moléculas secretadas por otras células que pueden influir en las etapas iniciales del desarrollo de la sinapsis. Por ejemplo, in vivo neuronas espinosas medias están densamente inervadas por entradas glutamatérgicas de la corteza, el tálamo y otras regiones del cerebro 34, sin embargo, en nuestros cultivos neuronales sinapsis glutamatérgicas no forman debido a que estas entradas están dañados durante la disección del tejido estriatal. ¿Cómo la ausencia de las sinapsis glutamatérgicas funcionales en las neuronas espinosas medias cultivadas affeja su capacidad para formar sinapsis GABAérgicas entre sí y / o células HEK293 que expresan GABA A Rs sigue siendo una cuestión abierta. Esta pregunta podría ser fácilmente dirigida por el cultivo de neuronas espinosas medianas junto con las neuronas glutamatérgicas corticales lo que les permite formar sinapsis funcionales 35 antes de la adición de las células HEK293. Un enfoque alternativo sería diseñar un sistema modelo de co-cultivo basado en cultivos de cortes organotípicos, que mantienen algo de la citoarquitectura que puede ser importante para la maduración y la formación de sinapsis. Sin embargo, cultivos de cortes organotípicos tienen neuropil densa y heterogénea que puede comprometer el análisis realizado aquí. Otra desventaja importante del uso de ensayos de co-cultivo es que GABA A Rs expresada en la superficie de las células HEK293 no se agrupan como lo son en las neuronas, aunque esto no parece ser necesario para la formación de sinapsis dado una expresión en la superficie lo suficientemente alto como 30. Por ejemplo, en el rOdent cerebro y en cultivos de hipocampo, la α1 subunidad GABA A R se encuentra en la mayoría de las sinapsis GABAérgicas en todos los dominios postsinápticos de las células piramidales. Sin embargo, la α2 se encuentra específicamente en un subconjunto de las sinapsis en el somas y dendritas pero es altamente enriquecido en el segmento inicial del axón, según lo revelado por inmunofluorescencia y microscopía electrónica 36. Dado que la formación de sinapsis en los co-cultivos todavía se puede detectar de forma fiable y se analizó 30, esto sugiere que la densidad de GABA A Rs en la superficie celular de las células HEK293 puede ser similar a, o incluso mayor que la densidad de estos receptores dentro sináptica clusters en las neuronas. Esto puede explicar, al menos en parte, por qué las proteínas sinápticas de adhesión, tales como neuroligin, y proteínas de densidad postsinápticas, tales como gephyrin, no son necesarios para la formación de sinapsis en los co-cultivos, si los Rs adecuadamente ensamblados GABA A están presentes en suficiente densidad. Está bien documentado que el GABA A Rs son estructuralmente y funcionalmente heterogénea, y que la composición de la subunidad del receptor determina su localización subcelular y propiedades farmacológicas. Por ejemplo, la incorporación de las 2 subunidades es conocido por ser un requisito previo para la localización sináptica de GABA A Rs mientras que la subunidad es casi exclusivamente presente en extrasinápticos GABA A Rs. Los receptores que incorporan sólo αβ combinaciones también se cree que están localizados predominantemente a los dominios extrasinápticos 12- 14. Ya sea que esta especificidad se mantiene en nuestro sistema de co-cultivo puede ser fácilmente probado por transfección transitoria de 2 o subunidades ADNc en las líneas celulares HEK293 que expresan de forma estable α y β subunidades, antes de añadirlos a cultivos neuronales. Nuestros experimentos preliminares utilizando este enfoque han sugerido que los contactos sinápticos se forman fácilmente sólo en presencia de la subunidad 2, lo que indica que la especificidadespecifici- observado in vivo es probable que se conserva in vitro (datos no presentados). Además, Rs GABA A que incorporan diferentes subunidades α se localizan selectivamente a los contactos sinápticos formadas con tipos específicos de neuronas presinápticas. Por ejemplo, en el globo pálido, el RS α1-GABA A se encuentran generalmente en striatopallidal (str-GP) y (GP-GP) sinapsis palliopallidal, que se encuentran en las dendritas y regiones somáticas de las neuronas espinosas medianas, respectivamente. Los Rs α3-GABA A se encuentran en regiones perisomática de neuronas espinosas medias y se ponen en contacto por axón colaterales GP locales, mientras que los Rs α2-GABA A se encuentran en las dendritas distales de estas neuronas y en contacto principalmente por las entradas desde el cuerpo estriado 32. Expresión de subunidades α específicos en diferentes tipos de sinapsis y en diferentes compartimentos neuronales también se ha demostrado en otras áreas del cerebro, tales como hippocampus 21 y neocórtex 18,20. Estos resultados plantean la cuestión de cómo se forman las sinapsis inhibitorias específicas en el cerebro. ¿La adhesión de un tipo específico de terminal presináptica inducen la inserción de los subtipos específicos de GABA A R en los puntos de contacto? ¿Los receptores de víctimas de la trata de localizaciones subcelulares específicas de acuerdo a su composición de la subunidad, donde su inserción en la membrana plasmática es un requisito previo para la adhesión de los terminales axonales de origen específico? Hasta la fecha, estas preguntas siguen sin respuesta. El uso de sistemas de modelos reducidos, tales como el modelo de sistema de co-cultivo, nos permite empezar a responder esta pregunta complejas porque el sistema es fácilmente susceptible de transfección de construcciones de ADN y la aplicación de los reactivos y, sobre todo, es adecuado para el análisis de imágenes de células vivas 30. Por lo tanto, el uso de este modelo de sistema que podemos empezar a probar el papel de las moléculas individuales, incluyendo diferentes tipos de GABA A Rs, saben para estar presente en los contactos sinápticos. Otra ventaja es que las sinapsis en el formulario modelo de sistema rápidamente, en cuestión de minutos a horas, la reducción de la duración de los experimentos. Sistemas modelo de co-cultivo similares fueron empleados con éxito en el pasado para la detección de las nuevas moléculas sinaptogénica 27,37,38. La comprensión de cómo se desarrolla el sistema nervioso central, madura y forma conexiones entre las neuronas tan intrincadamente con el control, por ejemplo, el comportamiento o la cognición, es de fundamental importancia. Este objetivo distante sólo se logrará mediante la delimitación de los mecanismos moleculares que gobiernan los pasos individuales de reconocimiento y la comunicación de célula a célula durante el desarrollo. Debido a la enorme complejidad, los detalles moleculares de estas múltiples interacciones celulares en la actualidad pueden ser estudiados con precisión sólo en sistemas reducidos. Sin embargo, la capacidad de aumentar la complejidad de estos sistemas mediante la expresión de múltiples combinaciones de proteínas y el estudio de cómoque interactuar tiene algunas ventajas en comparación con, por ejemplo, los enfoques supresión genética. Esto es debido a la interpretación precisa de los efectos de una sola deleción del gen es a menudo comprometida por cambios asociados con mecanismos de compensación de enmascaramiento de los efectos de las lesiones originales, particularmente en el cerebro en desarrollo. La técnica de co-cultivo pero informativo simple descrito aquí ha permitido un descubrimiento de la función estructural de GABA A Rs en la formación de sinapsis y se abrió la posibilidad de investigar cómo Rs GABA A y otras moléculas de adhesión celular y / o proteínas de la matriz sinápticas interactúan entre sí durante la sinaptogénesis. Proteínas de la matriz sinápticas son de especial interés dado que recientemente se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la formación de sinapsis glutamatérgica 39. Un mayor desarrollo de modelos de co-cultivo es importante, ya que tienen el potencial para avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que guían la &quot;normal y# 8217; el desarrollo del cerebro y por lo tanto aumentan nuestra comprensión de cómo estos mecanismos se alteran en muchas enfermedades del neurodesarrollo, tales como la epilepsia, la esquizofrenia, los trastornos del espectro autista y muchos otros.

GABA es uno de los primeros neurotransmisores que se encuentran en el cerebro embrionario, anterior a la más abundante excitatorio neurotransmisor glutamato 1. Durante el desarrollo, GABA despolariza y excita las neuronas inmaduras, jugando un papel clave en la regulación de la proliferación celular, la migración y la formación de redes neuronales sin inducir excitotoxicidad. En el cerebro adulto, el potencial de inversión para GABA A los canales del receptor se desplaza hacia potenciales más negativos debido a una disminución en la concentración intracelular de cloruro. Este cambio se debe a la sobre regulación de potasio-cloruro de co-transportador (KCC2), que transporta cloruro de fuera de la célula, y, en paralelo, la regulación por disminución del transportador-potasio-cloruro de sodio (NKCC1), que tiene el efecto contrario 2. En el cerebro, GABA se une principalmente a los receptores de GABA, ya sea A o GABA B para mediar en la inhibición sináptica rápida o lenta, respectivaLy. GABA A Rs son una clase de receptores ionotrópicos también conocidos como heteropentamérico o Cys-loop canales iónicos activados por ligando. Se requieren dos moléculas de GABA para la activación del receptor, que es permeable a los iones cloruro y en un grado menor, los iones de bicarbonato. El aumento en la conductancia de cloruro disminuye la eficacia de despolarizantes, eventos excitatorios en la activación de la neurona postsináptica 3. La diversidad estructural del GABA A Rs ha sido reconocida como un factor clave en la determinación de su amplia gama de propiedades funcionales y farmacológicas. Nativo de GABA A Rs son hetero-pentámeros compuestas de subunidades con múltiples isoformas clasificados como: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π y θ 3, con un común topología transmembrana que comprende un dominio grande N-terminal extracelular, cuatro dominios transmembrana (TMS), y un dominio intracelular importante entre TMs 3 y 4 4. Laβ3 y γ2 subunidades son esenciales para la inhibición sináptica y la supervivencia organismo, debido a ratones portadores de supresión genética de estas subunidades mueren después del nacimiento 5,6. En contraste, las isoformas individuales de la subunidad α son importantes para la función de las conexiones sinápticas específicas en el cerebro asociados con diferentes comportamientos tales como la ansiedad, sedación, excitación, y otros, pero no lo son, individualmente, esencial para la vida 7-9. GABA A Rs son los principales sitios de acción para una variedad de fármacos con potente sedante, hipnótico, ansiolítico y efectos anticonvulsivos, tales como benzodiacepinas, barbitúricos, anestésicos y neuroesteroides 7,10,11. Synaptic GABA A Rs normalmente contienen una subunidad γ2, dos subunidades β (más comúnmente β2 o β3) y dos subunidades α (α1, α2, α3 o α5) 12,13. La clase predominante de los receptores extra-sináptica contiene la subunidad δ en combinacióncon dos subunidades α (α4 o α6), y dos subunidades β (β2 o β3) 14. Localización subcelular de GABA A Rs a los axones, dendritas o soma, y la inserción en la membrana plasmática dependen de la presencia de β-subunidades 15,16. Sin embargo, la incorporación selectiva de diferentes subtipos de GABA A R en distintos tipos de sinapsis se correlaciona bien con la presencia de subunidades α específicos (α1, α2, α3 o α5) 7,17,18. Es importante destacar que, la supresión de α1 o α2 subunidad en ratones provoca cambios ultraestructurales en las sinapsis inhibidoras 19. Esto sugiere que el GABA A Rs sí mismos pueden jugar un papel directo en la regulación de la formación de sinapsis. La evidencia indica que el desarrollo de sinapsis GABAérgicas es una secuencia precisamente coordinado de eventos, en el que tanto los objetivos neuronales contactados por diferentes tipos de axones inhibitorios y los receptores que se agrupan encada clase de sinapsis inhibitoria son selectivos y funcionalmente en sintonía 17,20-22. Este principio fundamental de la especificidad en las sinapsis GABAérgicas plantea la cuestión de cómo los socios de pre y postsinápticos se reconocen entre sí durante el inicio de los contactos sinápticos. Los ensayos in vitro de co-cultivo se han aplicado con éxito para estudiar algunos de los mecanismos de la formación de sinapsis y para probar el papel de las proteínas de la hendidura-que abarca sinápticas individuales en este proceso. Una de las combinaciones de proteínas comunes trans-sinápticos interactuantes que funcionan bidireccionalmente para mediar en la formación de sinapsis y la maduración, son el neurexinas (Nrxns) y neuroliginos (NLS). Nrxns son proteínas presinápticas que exhiben splicing alternativo dentro de sus dominios de la proteína de unión a hormonas laminina-neurexin sexo, dando lugar a muchas isoformas diferentes 23. Mientras que el Nrxns también interactúan con otras proteínas, NLs se cree que son su pa postsináptica ubicuartners 24. En conjunto, estas proteínas contribuyen a la celebración de las membranas presináptica y la postsináptica en aposición estrecha y rígida 25. Las dos isoformas más abundantes son NL-1 y NL-2 que están presentes en las sinapsis excitatorias e inhibitorias, respectivamente 26. Uno de los sistemas modelo de co-cultivo primeras, destinadas a investigar las interacciones de proteínas trans-sinápticos, emplean diferentes tipos de células no neuronales, las líneas celulares más comúnmente inmortales tales como embrionarias de riñón humano (HEK) 293 células, que sobre-expresa NL- 2. Cuando estas células se cultivaron con neuronas PONTINO, se observó una acumulación de proteínas presinápticas en estrecha proximidad a la superficie de las células HEK, que indica la formación de los contactos sinápticos similares. La adición de β-soluble neurexin a estos co-cultivos inhibió la formación de contactos, lo que sugiere que las interacciones trans-sinápticas entre Nrxns y NLs son necesarias para la formación de contacto sináptico 27. Por otra parte, la expresión transitoriade β-neurexin en células COS (C V-1 (simio) en O rigin, y que lleva el material genético S V40) co-cultivadas con glutamatérgica hipocampo disociada y neuronas GABAérgicas inducida por la expresión de la proteína gephryin postsináptica y de subunidades GABA A R γ2 y α2 en los puntos de contacto entre estos dos tipos de células 28. Otro ejemplo de un modelo de co-cultivo utilizado para estudiar la formación de sinapsis involucrado células HEK293, transfectadas transitoriamente con GABA A R subunidades α2 / β3 / γ2 y NL-2, y una población mixta de neuronas hipotalámicas 29. Este estudio concluyó que la expresión de NL-2 es un requisito absoluto para la formación de sinapsis inhibidoras. Α1 Sin embargo, en el reciente estudio de co-cultivo, transfectadas establemente / β2 / γ2 GABA A Rs se encontraron en las células HEK293 que ser suficiente para inducir la sinapsis funcionales cuando se co-cultivaron con med GABAérgicasneuronas espinosas ium, sin la necesidad de proteínas de adhesión trans-sinápticos o postsinápticos adicionales. Sin embargo, se observó un aumento importante en la formación de sinapsis y la fuerza cuando se co-expresó NL-2 con GABA A Rs 30. Esto indica que este modelo de sistema de co-cultivo tiene ventajas sobre los sistemas modelo descritos anteriormente, la mayoría evidentemente un aumento de la sensibilidad y la fiabilidad de la detección de contacto sináptico. Dos factores importantes que contribuyen a la mejora general en la detección de los contactos sinápticos son: i) El uso de líneas celulares transfectadas de forma estable HEK293 con la expresión de alto y consistente de las subunidades GABA A R en la superficie de las células individuales. Esta consistencia facilita las comparaciones cuantitativas entre diferentes condiciones de co-cultivo. ii) El uso de una población pura de las neuronas GABAérgicas espinosas medio cultivado desde el cuerpo estriado embrionario 31 elimina complicaciones y ambigüedades que resultan del uso de poblaciones neuronales mixtos y allows, por ejemplo, la selección de los tipos de GABA A R postsinápticos más apropiados que se pueden comparar entre sí durante la formación de sinapsis. Se cree que la formación de las sinapsis para involucrar a muchas señales de trans-sinápticas dentro de los complejos de adhesión celular pre y postsinápticos. Debido a la naturaleza bi-direccional de la señalización sináptica y la enorme cantidad de moléculas de adhesión celular, es difícil identificar los componentes clave que participan en la formación de sinapsis. Por lo tanto, la transfección de una sola proteína de adhesión celular en una célula no neuronal (en este caso, los dos objetivos postsinápticos más comunes de las neuronas GABAérgicas medio espinosas en vivo, α1 / β2 / γ2 o α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) en gran medida reduce la complejidad de las señales de trans-sináptica disponibles en la superficie postsináptica y permite el análisis cuantitativo preciso de la eficacia de esta proteína en la promoción de la formación de sinapsis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1601">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name</td>
			<td style="width:627px;">Company/Individual</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:396px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11960-044</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15070-063</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10106-169</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">21103-049</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glucose</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G8769</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HBSS (10X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14180-046</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15630-056</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">PBS (1X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10010-031</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td>
			<td rowspan="2" style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">V790-20</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V860-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V870-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Stable HEK&#945;1&#946;2&#947;2 line</td>
			<td style="width:627px;">Sanofi-Synthelabo, Paris</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1149</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">G418 disulfate salt (Geneticin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5013</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Phleomycin D1 (Zeocin)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">R25001</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10687-010</td>
			<td style="width:396px;">Danger: toxic, irritant and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25300-054</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use Danger: Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6282</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Laminin</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L2020</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">100 &#956;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">734-0004</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C1768</td>
			<td style="width:396px;">Danger: Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Chelating agent (Versene)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15040-033</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:469px;">liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15338-100</td>
			<td style="width:396px;">Alternative transfection method: Effectene Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td>
			<td style="width:627px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:111px;">301425</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11058-021</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">105311C5</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal A</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10888-022</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:111px;">27810.364</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glycine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1726</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A3294</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:469px;">Guinea pig anti-&#947;2 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Prof. Jean Marc Fritschy</td>
			<td rowspan="3" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">J. Comp. Neurol. 359 (1) 154&#8211;194 (1995).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:627px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">H5141</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB351</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-synapsin antibody</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">106-011</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-&#946;2/3 antibody (BD17)</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB341</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:469px;">Rabbit anti-&#945;1 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Professor Anne Stephenson</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP1085</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP124S</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A31553</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A21422</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A11008</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;"><a name="RANGE!A49">Mounting reagent (Prolong Gold)</a></td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">P36930</td>
			<td style="width:396px;">Use at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
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inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

El protocolo para esta neurona-HEK293 sistema modelo de células de co-cultivo se ha afinado para permitir la supervivencia celular óptimo. En este sistema, la formación de los contactos sinápticos como y su análisis se basa en la expresión estable y coherente de todas las tres subunidades GABA A R que se ensamblan en un receptor funcional. Por tanto, es importante utilizar análisis inmunocitoquímico de prueba para la expresión de la subunidad en la superficie de células HEK293 antes de añadirlos a cultivos neuronales. En estos experimentos, se detectó expresión en la superficie celular de α1, β2 y γ2 subunidades (Figura 1A), o α1, β3 y γ2 subunidades (Figura 1B), utilizando anticuerpos de la subunidad específica que se unen a los epítopos extracelulares de estas subunidades. Se demostró un alto grado de co-localización entre estas subunidades en la superficie HEK293. Después de confirmar la expresión en la superficie y co-localización de GABA ASubunidades R en HEK293 células, co-cultivos se prepararon usando HEK293 células que expresan las subunidades α1 / β2 / γ2 GABA A R y las neuronas espinosas medianas cultivadas durante 14 días (14 días in vitro (DIV)). Las células en co-cultivo se incubaron durante 24 h, se fija y se analizaron usando inmunocitoquímica y microscopía confocal. Análisis de contactos indicó que GABAérgicas terminales de los axones GAD65-positivas forman sólo los contactos esporádicos con las células HEK293 de control (Figura 2A, 2B). El número de contactos detectados en 4 horas fue de 7,3 ± 0,9 por célula HEK293, y este número se redujo a 5,5 ± 0,5 conexiones (media ± SEM) por célula HEK293 a las 24 horas después de la adición de las células HEK293 a las neuronas cultivadas. Por el contrario, los terminales GAD65-positivas axones GABAérgicas formaron numerosos contactos-sinapsis como con células HEK293 que expresan GABA A Rs. El número de contactos obtenidos a las 4 horas después de la adición de las células HEK293 fue 28,3 ± 4,7 células HEK293, y este número era mayor aumentod a 52,1 ± 6,3 (media ± SEM) por célula HEK293 a las 24 horas en el co-cultivo (Figura 2A, 2B). Para determinar si estos contactos-sinapsis como eran &#39;activa&#39;, es decir, apoyaron la liberación del transmisor vesicular, se añadió una vesícula luminal de dominio específico anti-anticuerpo sinaptotagmina Cy5-conjugado con el medio de co-cultivo después de 23 horas de incubación. Este anticuerpo sólo se incorpora en los terminales nerviosos presinápticos cuando se forma un poro entre el lumen de las vesículas sinápticas y el fluido extracelular en la hendidura sináptica durante la liberación de neurotransmisores. Después de la liberación, el poro se cierra, dejando la sinaptotagmina anticuerpos fluorescentes Cy5-conjugado unido a sinaptotagmina dentro de la vesícula. De esta manera, sólo las vesículas que participan activamente en la liberación de neurotransmisores están etiquetados con el anticuerpo. En estos experimentos pocos o ningún contacto entre el control de las células HEK293 y las terminales de las neuronas espinosas medianas eran &quot;activo &amp; #8217; como se muestra por la falta de co-localización entre el presináptica GAD65 / fluorescencia sinaptotagmina y mCherry de fluorescencia en las células HEK293 (Figura 3A). Por el contrario, se formaron muchos contactos &quot;activas&quot; entre las terminales de las neuronas espinosas medianas y α1 / β2 / γ2-que expresan las células HEK293, según lo revelado por un alto grado de co-localización entre GAD65 / sinaptotagmina y mCherry, expresa específicamente en las células HEK293 ( Figura 3B). Α1 Para probar si un subtipo diferente de GABA A R también puede promover la formación de sinapsis-como in vitro, hemos co-cultivadas / β3 / γ2 expresando células HEK293 con neuronas espinosas medias. Una vez más, las células de control HEK293 rara vez recibieron contactos con terminales presinápticas sinapsina positivo alcanzando 10,8 ± 0,48 contactos por célula HEK293 después de las 24 horas en el co-cultivo (Figura 4A izquierda, 4B) (± SEM significar). Sin embargo, las células HEK293 que expresanα1 / β3 / γ2 forma GABA A Rs significativamente más contactos sinapsis como con sinapsina positivo terminales presinápticas de las neuronas espinosas medias que alcanzan 25.3 ± 0.27 (media ± SEM) contactos por célula HEK293 después de las 24 horas en el co-cultivo (Figura 4 A la derecha, 4B). Esto indica que α1 / β3 / γ2 GABA A Rs expresado en células HEK293 también son capaces de promover la formación de contacto sináptico, aunque su potencia es menor que la potencia de α1 / β2 /-γ2 que contiene GABA A Rs. Estos experimentos indican que el sistema modelo de co-cultivo desarrollado en nuestro laboratorio permite el análisis cuantitativo de la formación de contacto sináptico in vitro así como la evaluación de la eficacia de diferentes subtipos de GABA A Rs en este proceso. Estos experimentos demuestran además que Rs GABA A, además de ser componentes funcionales críticos de las sinapsis GABAérgicas, pueden jugar un papel claveen el proceso de reconocimiento y formación de contactos sinápticos entre neuronas inhibitorias y las células diana neuronales apropiados, independientemente de otras proteínas de adhesión sinápticas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. inmunocitoquímica análisis de la expresión de GABA A R α1 / β2 / γ2 o α1 / β3 / γ2 en líneas estables de células HEK293. Los anticuerpos que reconocen los dominios extracelulares de las subunidades GABA A R se utilizaron para los receptores de la etiqueta expresadas en la superficie celular. ( A) línea celular HEK293 que expresa α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) y γ2 (Cy5) en niveles altos. (α1 B) línea celular HEK293 que expresa (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) y γ2 (Cy5)subunidades en niveles altos. Barra de escala:. 10 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. GABAérgicas neuronas espinosas medianas forman contactos sinapsis como con α1 / β2 / γ2- que expresan las células HEK293 en co-cultivo. (A) el etiquetado fluorescente de terminales presinápticas con anticuerpos anti-GAD65 (en verde) y las células HEK293 con mCherry (en rojo, izquierda) o el GABA A subunidad γ2 R (en azul, a la derecha), reveló los puntos de co-localización entre estos marcadores que indican la formación de contactos-sinapsis como después de 4 o 24 horas en co-cultivo. Barra de escala:. 10 mm (B) Análisis cuantitativo de la sinapsis como co<html> ntacts. Células HEK293 fueron identificados en base a su forma tal como se revela mediante formación de imágenes DIC y / o expresión mCherry, y el número de contactos entre GAD-65 puncta positivo (en verde) y la superficie de las células HEK293 se contó por el ojo en cada sección óptica de una serie Z-pila (8 - 10) por célula utilizando el software de formación de imágenes, y se expresa como el número de contactos / célula. El gráfico muestra el número de contactos entre neuronas espinosas medianas y control de células HEK293 (gris claro) o α1 / β2 células / γ2-HEK293 (negro) después de 4 y 24 horas en el co-cultivo (media ± SEM, n = 8 en cada condición a partir de dos experimentos independientes). Esta cifra ha sido modificado desde Fuchs et al. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <html> ad / 52115 / 52115fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 3. GABA A Rs promueven la formación de los contactos sinápticos activos. Immunolabeling de contactos como sinapsis formadas después de 24 horas en co-cultivo entre terminales de las neuronas espinosas medias positivas para GAD65 (Alexa Fluor 405 cian) y control de las células HEK293 (A), o (B) / β2 / γ2 células HEK293-α1, tanto transfectadas transitoriamente con mCherry construyen (rojo). Contactos activos son identificados por la co-localización entre el dominio específico luminal vesícula anticuerpo anti-sinaptotagmina (Cy5) y anticuerpo-GAD65 específica tanto en terminales presinápticos, y mCherry expresan en células HEK293. Barra de escala:. 10 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> igura 4 &quot;fo: contenido-width =&quot; &quot;src =&quot; 6 pulgadas / archivos / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 4. GABAérgicas neuronas espinosas medianas forman contactos sinapsis como con α1 / β3 / subunidad γ2- expresar HEK293 células en co-cultivo. (A) etiquetado fluorescente de terminales presinápticas con anti-anticuerpos sinapsina I (en verde), y de control de las células HEK293 (izquierda), o α1 / β3 / γ2 expresando células HEK293, tanto transfectadas transitoriamente con mCherry (en rojo), reveló puntos de co-localización entre estos marcadores que indican la formación de contactos sinápticos como después de 24 h en co-cultivo. Barra de escala: 10 mm (B). El análisis cuantitativo de los contactos como sinapsis. Células HEK293 fueron identificados por la expresión mCherry, y el número de contactos entre sinapsina I-positivo puncta (en verde) y la superficie de las células HEK293 se contó por el ojo en cada sección óptica de una serie Z-pila (8 - 10) por célula utilizando el software de formación de imágenes, y se expresa como el número de contactos / célula. El gráfico muestra el número de contactos entre neuronas espinosas medianas y control de células HEK293 (gris claro) o α1 / β3 células / γ2-HEK293 (negro) después de 24 horas en el co-cultivo (media ± SEM, n = 8-12 células en cada condición, a partir de dos experimentos independientes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>

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Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Los mecanismos moleculares que coordinar la formación de sinapsis inhibidoras GABAérgicas durante la ontogenia son en gran parte desconocido. Para estudiar estos procesos, hemos desarrollado un sistema modelo de co-cultivo que incorpora las neuronas GABAérgicas espinosas medias embrionarias cultivadas junto con células transfectadas de manera estable de riñón embrionario humano 293 (HEK293) que expresan receptores funcionales GABA A.

La formación de sinapsis inhibitorias en una Co-cultura modelo que incorpora GABAérgicas Mediano espinosas neuronas y células HEK293 que expresan establemente GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptores

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

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JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

17.3K vistas.  University College London.  Los mecanismos moleculares que coordinar la formación de sinapsis inhibidoras GABAérgicas durante la ontogenia son en gran parte desconocido. Para estudiar estos procesos, hemos desarrollado un sistema modelo de co-cultivo que incorpora las neuronas GABAérgicas espinosas medias embrionarias cultivadas junto con células transfectadas de manera estable de riñón embrionario humano 293 (HEK293) que expresan receptores funcionales GABA A. 

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