ברצוננו להודות תמיכה כספית מMRC בריטניה (G0800498). כמו כן, אנו רוצים להודות לפרופ &#39;JM Fritschy, אוניברסיטת ציריך, למתן נוגדן GABA -R למקטע ספציפי γ2 ופרופסור ר&#39; הארווי, בית הספר לרוקחות UCL, למתן pcDNA 3.1 (+) וקטורי ביטוי המכיל עמידות לאנטיביוטיקה גנים לייצור שורות תאי HEK293 transfected ביציבות.

<ol>
	<li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development.">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li><li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABA+excitatory/inhibitory+shift+in+brain+maturation+and+neurological+disorders.">The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).</li><li>Structure Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pharmacology,+and+function+of+GABAA+receptor+subtypes.">pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes.</a> Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).</li><li>Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+action:+opening+of+ligand-gated+ion+channels.">Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels.</a> Cell. 72, 31-41 (1993).</li><li>Homanics, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+gamma-aminobutyrate+type+A+receptor+beta3+subunit+have+epilepsy,+cleft+palate,+and+hypersensitive+behavior.">Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).</li><li>Gunther, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine-insensitive+mice+generated+by+targeted+disruption+of+the+gamma+2+subunit+gene+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).</li><li>Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptor+diversity+and+pharmacology.">GABA(A) receptor diversity and pharmacology.</a> Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).</li><li>Low, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+neuronal+substrate+for+the+selective+attenuation+of+anxiety.">Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety.</a> Science. 290, 131-134 (2000).</li><li>Rudolph, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine+actions+mediated+by+specific+gamma-aminobutyric+acid(A)+receptor+subtypes.">Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes.</a> Nature. 401, 796-800 (1999).</li><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).</li><li>Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity+of+the+GABAA+receptor+shapes+unique+pharmacological+profiles.">The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles.</a> Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).</li><li>Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+clustering+of+major+GABAA+receptor+subtypes+requires+the+gamma+2+subunit+and+gephyrin.">Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin.</a> Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).</li><li>Schweizer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gamma+2+subunit+of+GABA(A)+receptors+is+required+for+maintenance+of+receptors+at+mature+synapses.">The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).</li><li>Belelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+GABAA+receptors:+form,+pharmacology,+and+function.">Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).</li><li>Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors+is+determined+by+receptor+beta+subunits.">Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).</li><li>Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cell+surface+expression+of+heteromeric+and+homomeric+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).</li><li>Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-+and+input-specific+differences+in+the+number+and+subtypes+of+synaptic+GABA(A)+receptors+in+the+hippocampus.">Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).</li><li>Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+synapse-specific+clustering+of+GABA(A)+receptors.">Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors.</a> Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).</li><li>Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+heterogeneity+of+GABAergic+synapses.">Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).</li><li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex.">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+sensitivity+to+Zolpidem+of+IPSPs+activated+by+morphologically+identified+CA1+interneurons+in+slices+of+rat+hippocampus.">Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).</li><li>Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-dependent+synaptic+targeting+of+alpha(2)-subunit-containing+GABA(A)+receptors+in+synapses+of+hippocampal+pyramidal+cells+of+the+rat.">Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat.</a> Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).</li><li>Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartography+of+neurexin+alternative+splicing+mapped+by+single-molecule+long-read+mRNA+sequencing.">Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).</li><li>Siddiqui, T. J., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organizing+complexes.">Synaptic organizing complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+architecture+of+cell+adhesion+mediated+by+polymorphic+synaptic+adhesion+molecules+neurexin+and+neuroligin.">Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin.</a> Cell reports. 2, 101-110 (2012).</li><li>Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurexins+and+neuroligins+in+the+formation,+maturation,+and+function+of+vertebrate+synapses.">The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexins+induce+differentiation+of+GABA+and+glutamate+postsynaptic+specializations+via+neuroligins.">Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins.</a> Cell. 119, 1013-1026 (2004).</li><li>Dong, N., Qi, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstitution+of+functional+GABAergic+synapses+with+expression+of+neuroligin-2+and+GABAA+receptors.">Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors.</a> Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).</li><li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses.">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).</li><li>Ventimiglia, R., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 371-393 (1998).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+GABA(A)+receptor+subunits+in+relation+to+rat+striatopallidal+and+pallidopallidal+synapses.">Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses.</a> Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).</li><li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain:+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits.">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).</li><li>Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+thalamic+innervation+of+direct+and+indirect+pathway+medium-sized+spiny+neurons+in+mouse+striatum.">Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).</li><li>Lalchandani, R. R., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+collaterals+in+genetically+identified+medium+spiny+neurons+in+mouse+primary+corticostriatal+cultures.">Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures.</a> Physiological reports. 1, (2013).</li><li>Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+synaptic+localization+of+two+major+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptor+alpha+subunits+on+hippocampal+pyramidal+cells.">Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+expression+screen+for+synaptogenic+proteins+identifies+the+LRRTM+protein+family+as+synaptic+organizers.">An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers.</a> Neuron. 61, 734-749 (2009).</li><li>Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+autism-linked+MDGAs+and+neuroligins+suppresses+inhibitory+synapse+development.">Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development.</a> J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).</li><li>Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+discovery+of+glypican+as+a+receptor+for+LRRTM4+in+regulating+excitatory+synapse+development.">Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development.</a> Neuron. 79, 696-711 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

למרות שפרוטוקול זה הוא לא קשה מבחינה טכנית לבצע, יש כמה שלבים קריטיים שיש אחריו כדי להשיג את מבחני שיתוף התרבות לשחזור מדויקים ביותר. ראשית, הנוירונים קוצניים בינוני תרבותיים חייבים להיות נזרעו בצפיפות אופטימלית. אם נזרע בדלילות מדי, תאי עצב נוטים לפתח לאט לאט ובהישרדות מופחתת במידה ניכרת. מצד השני, אם זורעים בצפיפות רבה מדי, תאי עצב נוטים לצבור אשר פוגע בניתוח של קשרים עם תאי HEK293. שנית, מומלץ להביע כתב ניאון, GFP או mCherry בHEK293 תאים ביציבות להביע Rs GABA, לפני platting אותם לתרבות המשותפת זמני. זה מאפשר זיהוי אמין של HEK293 תאים, אשר יכולים להיות בסכנה על ידי דמיון בצורה ובגודל בין תאים אלה ותא גליה שרד נדיר בתרבויות עצביות. כדי להשיג transfection יעיל עם GFP או mCherry cDNA, שורות תאי HEK293 צריכים להיות בשלב הצמיחה מעריכית וזורעים בצפיפות המתאימה ב6-גם צלחות. זריעה דלילה ואחרי transfection תגרום לתאים לגדול בצורה גרועה, ואילו ימנע התאים על פני זריעה מתופס cDNA. באופן אידיאלי, צריכים להיות נזרעו תאים, כך שהם בין 70 - ומחוברות 90% ביום transfection. שלישית, transfection חייב להיות מותאם לשורת תאים כל שימוש, כמו כמה שורות תאים רגישות יותר מהאחרים. סיבה לכך הוא GABA המכונן ביטוי R בHEK293 תאים מפחית הישרדות תא ואת יכולתם של תאים להתאושש לאחר transfection. יתר על כן, הישרדות תלויה בסוג של RS GABA לידי ביטוי בתאי HEK293, עם כמה שורות תאים להיות משמעותית יותר רגישות יותר מהאחרים. Transfection באמצעות מגיב liposomal הוא שיטה אופטימלית לביטוי חלבונים זרים בשורות תאים גדלו במהירות, לספק הן יעילות transfection הגבוהה ורמת ביטוי. עם זאת, מגיב זה גורם יותר מדי נזק לשורות תאים גדלו לאט, לבו אנו משתמשים מגיב transfection אינו liposomal באופן קבוע. זה עובד בצורה דומה למגיב liposomal אבל כמות ה- DNA דרושה לtransfection יעיל מצטמצמת משמעותית. זה מאפשר הישרדות תא גדולה יותר (בערך 80-90% בהשוואה ל -60% באמצעות מגיב liposomal) אבל עם יעילות נמוכה transfection (60%). לבסוף, מספר HEK293 שליטה או α1 / β2 / γ2 HEK293 לבטא בתאים הוסיפו לתרבויות עצביות צריכה להיות מותאם. הוספה מעט מדי תאים פוגעת בניתוח המוצלח של מגעים בין תאי HEK293 ותאי עצב, כי הם הופכים להיות מאוד נדירים. לעומת זאת, הוספת תאי HEK293 רבים מדי גורמת למוות של תאים עצביים בתוך כמה שעות. אידיאלי צריכים להיות מוכנות תרבויות נוירון הקוצני הבינוני עובריים באמצעות רקמת striatal גזור מגיל עוברי 15 - 17. עם זאת, זה קורה לעתים קרובות כי הם עוברים מעט צעירים או מבוגרים מהגיל האופטימלי. במקרה זה, את מספר תאי העצב שנזרע בתרבות תהיהצריך להיות מגוון. רקמה שהיא צעיר מן E15 ייתכן שתהיה הצורך נזרעה בצפיפות נמוכה במקצת, תוך רקמה שהיא מבוגר יותר מE17 ייתכן שיהיה הצורך נזרע בצפיפות גבוהה יותר, כדי לאפשר להישרדות תא אופטימלית. יתר על כן, arabinoside ציטוזין (Ara-C) ייתכן שיהיה הצורך להוסיף לתרבויות ישנות יותר כדי למנוע צמיחה של גליה, שהוא יותר בשפע ברקמה בוגרת. בעת יצירת שיתוף תרבויות, חשוב לצלחת המספר מותאם של HEK293 transfected או α1 / תאים לבטא β2 / γ2 HEK293, כאמור לעיל. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך כדי לקבוע את זה לכל שורת תא בודדת, בגלל הבדלים בהישרדות שלהם. בדרך כלל 30,000 תאים בנפח מרבי של 50 μl יש להוסיף גם כל צלחת 24 גם, שכבר מכילה 500 μl של מדיום תרבות העצבי, כמו זו מבטיחה כי המדיום העצבי המותנה אינו מדוללת יותר מדי וכי התנאים בתוך כל טוב נשאר קבוע למדי, למשל </em&gt; הריכוז של גורמי גדילה. הוספת כמויות גדולות יותר מ -50 μl היטב כל אחד היה בדרך כלל להרוג תאי העצב. אחד החסרונות העיקריים של שיטת שיתוף התרבות הוא שהתרבויות עצביות נוצרות מהתאים ניתק גדלו כמו monolayer, מה שאומר שהנוירונים הוסרו ממייקרו-הסביבה הרגילה שלהם ואינם מסוגלים להקים את הארגון אנטומי הרגיל שלהם. לכן הם חסרים את הקשרים המתאימים, תשומות ומולקולות מופרשות מהתאים אחרים שעשויים להשפיע על השלבים הראשונים של התפתחות סינפסה. לדוגמא, בvivo נוירונים קוצניים בינוניים מעוצבבים בצפיפות על ידי תשומות glutamatergic מהקליפה, התלמוס ואזורים אחרים במוח 34, לעומת זאת, בתרבויות העצבית שלנו סינפסות glutamatergic לא יוצרות כי תשומות אלה שניזוקו במהלך הנתיחה של רקמת striatal. איך ההיעדרות של סינפסות glutamatergic פונקציונליות בתאי עצב קוצניים בינוניים תרבותיים AFFects היכולת שלהם ליצור סינפסות GABAergic אחד עם השני ו / או HEK293 תאים המבטא GABA Rs נותרת פתוחה. ניתן לטפל בשאלה זו בקלות על ידי נוירונים culturing הקוצניים בינוניים יחד עם נוירונים בקליפת המוח ומאפשרים כך glutamatergic כדי ליצור סינפסות תפקודית 35 לפני התוספת של תאי HEK293. גישה חלופית תהיה לתכנן מערכת מודל שיתוף תרבות המבוססת על תרבויות פרוסה organotypic, אשר לשמור על חלק מcytoarchitecture שעשויה להיות חשוב להתבגרות והיווצרות הסינפסה. עם זאת, יש לי תרבויות הפרוסה organotypic neuropil צפופה והטרוגנית שיכול לסכן את הניתוח שבוצע כאן. חסרון נוסף חשוב של שימוש במבחני התרבות משותפת הוא שGABA Rs הביע על פני השטח של תאי HEK293 לא התקבצו כפי שהם נמצאים בתאי עצב, אם כי נראה שלא יהיה צורך להיווצרות הסינפסה נתנה ביטוי על פני השטח גבוה מספיק 30. לדוגמא, בrמוח אודנט ובתרבויות בהיפוקמפוס, מקטע GABA R α1 נמצא במרבית הסינפסות GABAergic בכל תחומי הפוסט-סינפטי של תאים פירמידליים. עם זאת, α2 ממוקם במיוחד בתת-קבוצה של סינפסות בsomata ודנדריטים אך מועשר במגזר הראשוני האקסון, כפי שנחשפו על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים 36. בהתחשב בעובדה שהיווצרות הסינפסה בשיתוף התרבויות עדיין יכולה להיות מזוהה באופן מהימן וניתח 30, זה מצביע על כך שהצפיפות של RS GABA על פני התא של תאי HEK293 עשויה להיות דומה ל, או אפילו גבוהה יותר מהצפיפות של קולטנים אלה בתוך הסינפטי אשכולות בתאי עצב. זה יכול להסביר, לפחות חלקית, מדוע חלבונים סינפטיים הידבקות, כגון neuroligin, וחלבוני צפיפות פוסט-סינפטי, כגון gephyrin, אינם נחוצים להיווצרות הסינפסה בשיתוף התרבויות, אם Rs GABA התאסף כראוי נמצאים במספיק צפיפות. זה מתועד היטב שרופי GABA הן מבחינה מבנית ותפקודי הטרוגנית, ושהרכב מקטע הקולטן קובע לוקליזציה subcellular ותכונות פרמקולוגיות. לדוגמא, שילוב של 2 יחידות משנה ידוע כתנאי מוקדם ללוקליזציה סינפטיים של RS GABA תוך המקטע הוא כמעט אך ורק בהווה בRs GABA extrasynaptic. קולטנים המשלבים רק αβ שילובים הם חשבו גם להיות מקומיים בעיקר לתחומי extrasynaptic 12- 14. בין אם ספציפי הזה נשמר במערכת התרבות המשותפת שלנו, ניתן לבדוק בקלות על ידי זמני transfecting 2 או למקטע cDNAs לשורות תאי יציבות להביע HEK293 תת-יחידות α וβ, לפני שמוסיף אותם לתרבויות עצביות. הניסויים הראשוניים שלנו באמצעות גישה זו הראו כי קשרים סינפטיים נוצרים בקלות ורק בנוכחות של למקטע 2, המציין כי הספציפיficity נצפה in vivo עשוי להישמר במבחנה (מידע לא מוצג). יתר על כן, Rs GABA שילוב תת-יחידות α שונות באופן סלקטיבי מקומי לקשרים סינפטיים נוצרו עם סוגים ספציפיים של תאי עצב presynaptic. לדוגמא, בpallidus גלובוס, Rs α1-GABA נמצאים בדרך כלל בstriatopallidal (STR-GP) וסינפסות palliopallidal (GP-GP), אשר ממוקמות על דנדריטים ואזורים גופניים של נוירונים הקוצניים בינוניים, בהתאמה. Rs α3-GABA נמצא באזורי perisomatic של נוירונים קוצניים בינוניים והם פנו בביטחונות האקסון GP מקומיים, תוך Rs α2-GABA נמצאים על דנדריטים הדיסטלי של הנוירונים האלה ויצרו קשר עם בעיקר על ידי תשומות מסטריאטום 32. ביטוי של תת-יחידות α ספציפיות בסוגים שונים של סינפסות ובתאים עצביים שונים הודגם גם באזורים אחרים במוח כגון hippocampus 21 ו18,20 הניאוקורטקס. ממצאים אלה מעלים את השאלה כיצד סינפסות המעכבות הספציפיות נוצרות במוח. האם ההידבקות של סוג מסוים של מסוף presynaptic לגרום החדרת תת GABA R הספציפי לנקודתי מגע? האם קולטנים נסחרים למקומות subcellular ספציפיים לפי הרכב המקטע שלהם, שבו הכנסת קרום הפלזמה שלהם היא תנאי הכרחי להידבקות של מסופי axonal ממוצא מסוים? עד כה, על השאלות אלה נותרו ללא מענה. השימוש במערכות מודל מופחת כגון מערכת מודל שיתוף התרבות, מאפשרים לנו להתחיל לענות על שאלות מורכבות זה מכיוון שהמערכה היא בקלות נוחה לtransfection של בונה DNA ויישום של חומרים כימיים ו, ​​חשוב מכך, הוא מתאים לניתוח הדמיה תא חי 30. כך, באמצעות מערכת מודל זה אנו יכולים להתחיל בבדיקת התפקיד של מולקולות בודדות, כוללים סוגים שונים של RS GABA, יודעיםn להיות נוכח בקשרים סינפטיים. יתרון נוסף הוא שהסינפסות בצורת מערכת מודל זה במהירות, בתוך דקות עד שעות, צמצום משך טיפול בניסויים. מערכות מודל שיתוף תרבות דומה הועסקו בעבר בהצלחה למסך למולקולות synaptogenic רומן 27,37,38. הבנה כיצד מערכת העצבים המרכזית מתפתחת, מתבגר וקשרים בין תאי עצב צורות כל כך מסובכים לשליטה, לדוגמא, התנהגות או קוגניציה, הוא בעל חשיבות עליונה. מטרה רחוקה זה תושג רק על ידי התוויית המנגנונים המולקולריים הקובעים את שלביה השונים של הכרה ותקשורת תא אל התא במהלך התפתחות. בשל מורכבות, הפרטים המולקולריים של אינטראקציות תאיות רבות אלה יכולים כיום ללמוד עם דיוק רק במערכות מופחתות. עם זאת, היכולת להגדיל את המורכבות של מערכות אלה בהבעת שילובים מרובים של חלבונים ולומדים כיצדהם פועלים יש כמה יתרונות בהשוואה ל, למשל, גישות מחיקה גנטיות. סיבה לכך הוא הפרשנות מדויקת של ההשפעות של מחיקת גן יחיד נפגעת לעתים קרובות על ידי שינויים הקשורים במנגנונים מפצים מסווים את ההשפעות של נגעים מקוריים, במיוחד במוח המתפתח. טכניקת שיתוף התרבות אך אינפורמטיבי הפשוטה שתוארה כאן אפשרה גילוי של התפקיד המבני של RS GABA בהיווצרות הסינפסה ונפתחה אפשרות לחקור כיצד Rs GABA ומולקולות הידבקות תא אחרות ו / או חלבוני מטריצה ​​הסינפטי לתקשר אחד עם השני במהלך synaptogenesis. חלבוני מטריצת Synaptic הם בעלי עניין המיוחד לאור עובדה שיש להם לאחרונה הוכח לשחק תפקיד מפתח בהיווצרות הסינפסה glutamatergic 39. פיתוח נוסף של דגמי התרבות המשותפת הוא חשוב כי יש להם הפוטנציאל לקדם את הידע של המנגנונים המולקולריים המנחים את &#39;ורגיל שלנו# 8217; התפתחות מוח ובכך להגביר את ההבנה של איך מנגנונים אלה שינו בהרבה מחלות התפתחותיות, כמו אפילפסיה, סכיזופרניה, הפרעות ספקטרום האוטיסטי ועוד רבים אחרים שלנו.

GABA הוא אחד מהנוירוטרנסמיטרים הקדומים ביותר שנמצאו במוח העוברי, שקדמה להנוירוטרנסמיטר גלוטמט מעורר הנפוץ ביותר 1. במהלך פיתוח, GABA depolarizes ומרגש את תאי עצב לא בוגרים, ששיחק תפקיד מפתח בויסות התפשטות תאים, הגירה והיווצרות של רשתות נוירונים ללא גרימה להפעלת יתר רעיל. במוח הבוגר, פוטנציאל ההיפוך לערוצי קולטן GABA מוסט לפוטנציאל שלילי יותר כתוצאה מירידה בריכוז תאית של כלוריד. שינוי זה נגרם על ידי עד-רגולציה של שיתוף טרנספורטר אשלגן כלורי (KCC2), אשר מעביר כלוריד מחוץ לתא, ובמקביל, את תקנה של טרנספורטר נתרן-אשלגן כלורי (NKCC1), שבו יש ההשפעה ההפוכה 2. במוח, GABA נקשר בעיקר לאו GABA או GABA-B קולטנים לתווך עיכוב הסינפטי מהיר או איטי, בהתאמהly. Rs GABA הוא קבוצה של קולטנים המכונים גם ionotropic heteropentameric או תעלות יונים Cys לולאה מגודרת ליגנד. שתי מולקולות של GABA נדרשות להפעלה של הקולטן, אשר הוא חדיר ליוני כלוריד ובמידה פחותה יותר, יונים ביקרבונט. העלייה במוליכות כלוריד מקטינה את היעילות של depolarizing, אירועים מעוררים בהפעלת תא עצב הפוסט-סינפטי 3. גיוון מבני של RS GABA כבר זמן רב מוכר כגורם מפתח בקביעת מגוון הרחב שלהם מאפיינים פונקציונליים ותרופתיים. Rs ילידי GABA הוא הטרו-pentamers המורכב מיחידות משנה עם isoforms מרובה סווגה כ: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π וθ 3, עם משותף טופולוגיה הטרנסממברני הכוללת תחום גדול N- מסוף תאי, ארבעה תחומים הטרנסממברני (TMS), ותחום תאיים עיקרי בין זיכרונות 3 ו -4 4.β3 וγ2 תת-יחידות חיוניות לעיכוב הסינפטי והישרדות האורגניזם, כי עכברים שנשאו מחיקה גנטית של תת-יחידות אלה למות לאחר לידת 5,6. בניגוד לכך, isoforms הבודד של מקטע α הם חשוב לתפקוד של קשרים סינפטיים ספציפיים במוח הקשורים להתנהגויות שונות כגון חרדה, הרגעה, גירוי, ואחרים, אבל הם לא, בנפרד, חיוניים לחיים 7-9. Rs GABA הם האתרים העיקריים של פעולה עבור מגוון רחב של תרופות עם תרופת הרגעה חזקה, היפנוטי, טיפול בחרדות ותופעות פרכוסים, כגון בנזודיאזפינים, ברביטורטים, neurosteroids והרדמת 7,10,11. Rs Synaptic GABA מכיל בדרך כלל תת-יחידת γ2, שתי תת-יחידות β (הנפוץ ביותר β2 או β3) ושתי תת-יחידות α (α1, α2, α3 או α5) 12,13. המעמד הדומיננטי של קולטנים נוספים סינפטי מכיל מקטע δ בשילובעם שתי תת-יחידות α (α4 או α6), ושתי תת-יחידות β (β2 או β3) 14. לוקליזציה subcellular של GABA R כדי אקסונים, דנדריטים או סומה, והחדרה לתוך קרום הפלזמה תלויה בנוכחות של β-יחידות משנה 15,16. עם זאת, שילוב סלקטיבי של GABA שונה R תת לסוגים שונים של סינפסות וקושר היטב עם הנוכחות של תת-יחידות α ספציפיים (α1, α2, α3 או α5) 7,17,18. חשוב לציין, מחיקה של מקטע α1 או α2 בעכברים גורמת לשינויים ultrastructural בסינפסות מעכבות 19. הדבר מצביע על כך GABA RS עצמם עשויים למלא תפקיד ישיר בויסות היווצרות הסינפסה. ראיות מצביעות על כך שהתפתחות סינפסה GABAergic היא רצף בדיוק-מתואם של אירועים, בם שתי המטרות עצבי קשר סוגים שונים של אקסונים המעכבים וקולטנים המקובצים בכל כיתה של סינפסה המעכבת הנן סלקטיביים, ופונקציונלי קשובים 17,20-22. עיקרון יסוד זה של ייחוד בסינפסות GABAergic מעלה את השאלה, כיצד השותפים טרום postsynaptic להכיר אחד את השני במהלך הייזום של קשרים סינפטיים. במבחני חוץ גופית התרבות המשותפת יושמו בהצלחה ללמוד על כמה מהמנגנונים של היווצרות הסינפסה ועל מנת לבחון את תפקידם של חלבונים פורשי שסע הסינפטי בודדים בתהליך הזה. אחד השילובים הנפוצים טרנס-סינפטי האינטראקציה החלבון המתפקדים דו directionally לתווך היווצרות הסינפסה והתבגרות, הם Neurexins (Nrxns) וNeuroligins (NLS). Nrxns הם חלבוני סינפטי כי תערוכת שחבור חלופי בתוך תחומים החלבון שלהם laminin-neurexin-המיני מחייב הורמון, והוליד isoforms שונים 23. בעוד Nrxns גם אינטראקציה עם חלבונים אחרים, NLS נחשב לרשות הפוסט-סינפטי בכל מקום שלהםrtners 24. יחד חלבונים אלה תורמים למחזיקים קרומי סינפטי ופוסט-סינפטי בפרד קרוב ונוקשה 25. שני isoforms הנפוץ ביותר הוא NL-1 וNL-2 אשר נמצא בסינפסות מעוררות ומעכבות, בהתאמה 26. אחת ממערכות מודל שיתוף התרבות הקדומות ביותר, שנועדו לחקור אינטראקציות חלבון טרנס-סינפטי, מועסק סוגים שונים של תאים שאינם עצביים, שורות תאים הנפוצות ביותר האלמותיות כגון כליה העוברית האנושי (HEK) 293 תאים, לNL--Express על 2. כאשר התאים אלה בתרבית עם תאי עצב pontine, הצטברות של חלבוני סינפטי בקרבת פני השטח של תאי HEK נצפתה, המצביעה על היווצרותו של קשר כמו סינפסה. תוספת של β-neurexin המסיס לשיתוף תרבויות אלה עכבה את הקמתה של אנשי קשר, המצביעה על כך אינטראקציות הטרנס-סינפטי בין Nrxns וNLS נחוצות למגע הסינפטי היווצרות 27. יתר על כן, ביטוי חולףשל β-neurexin בCOS תאים (V-1 C (קופי) בrigin O, ונושא את החומר הגנטי S V40) שיתוף תרבותי עם glutamatergic ניתק בהיפוקמפוס ונוירונים GABAergic ביטוי מושרה של gephryin חלבון הפוסט-סינפטי ושל תת-יחידות GABA R γ2 וα2 בנקודות מגע בין שני סוגי התאים אלה 28. דוגמא נוספת של מודל שיתוף תרבות משמש ללמוד היווצרות הסינפסה מעורבת HEK293 תאים, זמני transfected עם GABA R תת-יחידות α2 / β3 / γ2 וNL-2, ואוכלוסייה מעורבת של תאי עצב ההיפותלמוס 29. מחקר זה הגיע למסקנה כי הביטוי של NL-2 הוא דרישה הכרחית להיווצרות של סינפסות מעכבות. α1 עם זאת, במחקר התרבות המשותפת האחרון, transfected ביציבות / β2 / γ2 GABA Rs בHEK293 תאים נמצאו מספיק כדי לגרום סינפסות הפונקציונלית כאשר שיתוף תרבותי עם מד GABAergicנוירונים ium קוצניים, ללא צורך בחלבוני הדבקת טרנס-סינפטי או פוסט נוספים. עם זאת, עלייה בולטת בהיווצרות הסינפסה וכוח נצפתה כאשר NL-2 היה במשותף עם אותה הביע GABA Rs 30. זה מצביע על כך מערכת מודל שיתוף תרבות זו יש יתרונות על פני מערכות מודל שתוארו לעיל, רוב כנראה רגישות ואמינות של זיהוי קשר הסינפטי מוגברים. שני גורמים חשובים המסייעים לשיפור הכללי בזיהוי של קשרים סינפטיים הם: i) השימוש בשורות תאי HEK293 transfected ביציבות עם ביטוי גבוה ועקבי של תת-יחידות GABA R על פני השטח של תאים בודדים. עקביות זו מאפשרת השוואות כמותיות בין תנאי שיתוף תרבות שונים. ii) השימוש באוכלוסייה טהורה של תאי עצב קוצניים בינוני GABAergic תרבית מסטריאטום העוברי ביום 31 במסיר סיבוכים ואי-בהירויות הנובעות מהשימוש באוכלוסיות עצביות מעורבות וallows, למשל, בחירה של סוגי postsynaptic המתאימים ביותר GABA R שניתן להשוות אחד עם השני במהלך היווצרות הסינפסה. היווצרות של סינפסות היא חשב לערב הרבה אותות טרנס-סינפטי בתוך מתחמי הידבקות תא טרום postsynaptic. בשל האופי הדו-כיוונית של איתות הסינפטי והמספרים העצומים של מולקולות הידבקות תא, קשה לזהות מרכיבים מרכזיים מעורבים בהיווצרות הסינפסה. כך, transfecting חלבון הידבקות תא בודד לתא הלא-עצבי (במקרה זה, שתי המטרות postsynaptic הנפוצות בעולם לנוירונים קוצניים בינוני GABAergic in vivo, α1 / β2 / γ2 או α1 / β3 / γ2 GABA Rs 32) מאוד מפחית את המורכבות של אותות טרנס-סינפטי זמינים על פני השטח postsynaptic ומאפשר ניתוח כמות מדויק של יעילותו של חלבון זה בקידום היווצרות הסינפסה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1601">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name</td>
			<td style="width:627px;">Company/Individual</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:396px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11960-044</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15070-063</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10106-169</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">21103-049</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glucose</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G8769</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HBSS (10X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14180-046</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15630-056</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">PBS (1X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10010-031</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td>
			<td rowspan="2" style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">V790-20</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V860-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V870-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Stable HEK&#945;1&#946;2&#947;2 line</td>
			<td style="width:627px;">Sanofi-Synthelabo, Paris</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1149</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">G418 disulfate salt (Geneticin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5013</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Phleomycin D1 (Zeocin)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">R25001</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10687-010</td>
			<td style="width:396px;">Danger: toxic, irritant and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25300-054</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use Danger: Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6282</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Laminin</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L2020</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">100 &#956;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">734-0004</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C1768</td>
			<td style="width:396px;">Danger: Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Chelating agent (Versene)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15040-033</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:469px;">liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15338-100</td>
			<td style="width:396px;">Alternative transfection method: Effectene Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td>
			<td style="width:627px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:111px;">301425</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11058-021</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">105311C5</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal A</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10888-022</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:111px;">27810.364</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glycine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1726</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A3294</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:469px;">Guinea pig anti-&#947;2 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Prof. Jean Marc Fritschy</td>
			<td rowspan="3" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">J. Comp. Neurol. 359 (1) 154&#8211;194 (1995).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:627px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">H5141</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB351</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-synapsin antibody</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">106-011</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-&#946;2/3 antibody (BD17)</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB341</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:469px;">Rabbit anti-&#945;1 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Professor Anne Stephenson</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP1085</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP124S</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A31553</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A21422</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A11008</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;"><a name="RANGE!A49">Mounting reagent (Prolong Gold)</a></td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">P36930</td>
			<td style="width:396px;">Use at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

הפרוטוקול עבור מערכת מודל שיתוף תרבות תאי נוירון HEK293 זה כבר מכוון היטב כדי לאפשר את הישרדות תא אופטימלית. במערכת זו, היווצרות של אנשי קשר כמו סינפסה-וניתוחם מסתמך על ביטוי יציב ועקבי של כל שלוש יחידות משנה GABA R שיותכו קולט פונקציונלי. לכן חשוב להשתמש בניתוח immunocytochemical למבחן לביטוי למקטע על פני השטח של תא HEK293 לפני הוספתן לתרבויות עצביות. בניסויים אלה, ביטוי פני תא של α1, β2 ותת-יחידות γ2 (איור 1 א), או α1, β3 וγ2 יחידות משנה (איור 1), זוהה באמצעות נוגדנים למקטע ספציפי שנקשרים לאפיטופים תאיים של תת-יחידות אלה. רמה גבוהה של שיתוף לוקליזציה בין תת-יחידות אלה על פני השטח HEK293 הודגמה. לאחר אישור הביטוי על פני השטח ושיתוף הלוקליזציה של GABAתת-יחידות R בתאים, שיתוף תרבויות HEK293 הוכנו באמצעות HEK293 תאים לבטא יחידות משנה α1 / β2 / γ2 GABA R ונוירונים קוצניים בינוני בתרבית למשך 14 ימים (14 ימים במבחנה (DIV)). תאים בשיתוף התרבות הודגרו למשך 24 שעות, קבועים ונותחו באמצעות immunocytochemistry ומיקרוסקופיה confocal. ניתוח של קשר ציין כי מסופי האקסון GAD65 חיובי GABAergic נוצרו רק אנשי קשר סדירים עם שליטת HEK293 התאים (איור 2 א, 2 ב). מספר אנשי הקשר שזוהו בשעה 4 שעות היה 7.3 ± 0.9 לכל תא HEK293, ומספר זה ירד לרמה של 5.5 ± 0.5 חיבורים (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 ב 24 שעות לאחר הוספת תאי HEK293 לנוירונים בתרבית. בניגוד לכך, מסופי האקסון GABAergic GAD65 החיוביים נוצרו קשר כמו סינפסה-רב עם HEK293 תאים המבטאים Rs GABA. מספר אנשי הקשר שהושג ב 4 שעות לאחר הוספת תאי HEK293 היה 28.3 ± 4.7 לכל תא HEK293, ומספר זה היה עלייה נוספתד ל52.1 ± 6.3 (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 ב 24 שעות בשיתוף התרבות (איור 2A, 2B). כדי לקבוע אם מגעים הללו כמו סינפסה-היו &#39;פעילים&#39;, כלומר נתמך לשחרר משדר לפוחי, נוגדן Cy5 מצומדות- אנטי-synaptotagmin תחום ספציפי שלפוחית-luminal התווסף למדיום התרבות המשותפת לאחר 23 שעות של דגירה. נוגדן זה משולב רק למסוף עצב presynaptic כאשר צורות נקבוביות בין לומן שלפוחית ​​הסינפטית ונוזל החוץ תאי במרווח הסינפטי בשחרור הנוירוטרנסמיטר. לאחר שחרור, הנקבובית נסגר, עוזב את synaptotagmin נוגדן פלואורסצנטי Cy5 מצומדות- מצורף לsynaptotagmin בתוך השלפוחית. בדרך זו, רק שלפוחית ​​מעורבת באופן פעיל בשחרור הנוירוטרנסמיטר מסומנים עם הנוגדן. בניסויים אלה כמה אם אנשי קשר או אי התאמה בין השליטה HEK293 תאים ומסופי נוירון הקוצני הבינוני היו &#39;פעיל &amp; #8217; כפי שמוצג על ידי חוסר שיתוף הלוקליזציה בין GAD65 / הקרינה סינפטי synaptotagmin וקרינת mCherry בHEK293 תאים (איור 3 א). בניגוד לכך, אנשי קשר &quot;פעילים&quot; רבים נוצרו בין המסופים בינוני נוירון הקוצני וα1 / β2 / γ2 להביע תאי HEK293, כפי שנחשף ברמה גבוהה של שיתוף לוקליזציה בין GAD65 / synaptotagmin וmCherry, הביע באופן ספציפי בתאי HEK293 ( איור 3 ב). α1 כדי לבדוק אם תת-סוג של GABA R שונה גם יכול לקדם היווצרות כמו סינפסה-במבחנה, יש לנו שיתוף תרבותי / β3 / γ2 לבטא בתאי HEK293 עם הנוירונים קוצניים בינוניים. שוב, HEK293 תאי שליטה לעתים רחוקות קיבלו קשר עם מסופי presynaptic synapsin חיובי לכת 10.8 ± 0.48 (ממוצע ± SEM) אנשי קשר לכל תא HEK293 לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (משמאל איור 4 א, ​​4 ב). עם זאת, תאי HEK293 להביעα1 / β3 / γ2 צורת GABA Rs יותר באופן משמעותי אנשי קשר כמו סינפסה-עם מסופי synapsin החיובי presynaptic של נוירונים הקוצניים בינוני לכת 25.3 ± 0.27 אנשי קשר (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (מימין איור 4 א, 4 ב). זה מצביע על כך α1 / β3 / γ2 GABA Rs לידי ביטוי בתאי HEK293 גם יכול לקדם היווצרות קשר הסינפטי, אם כי העוצמה שלהם היא נמוכה יותר מהעצמה של α1 / β2 / RS GABA המכילים γ2. ניסויים אלה מצביעים על כך שמערכת מודל שיתוף התרבות שפותחה במעבדה שלנו מאפשרת ניתוח כמותי של קשר היווצרות הסינפטי במבחנה, כמו גם הערכה של יעילותן של תת-סוגים שונים של RS GABA בתהליך זה. ניסויים אלה מראים עוד כי GABA R, בנוסף להיותו רכיבים פונקציונליים קריטיים של סינפסות GABAergic, עשוי לשחק תפקיד מפתחבתהליך של הכרה ויצירת קשרים סינפטיים בין נוירונים מעכבים ותאי המטרה עצביים המתאימים, באופן עצמאי של חלבוני הדבקה הסינפטי אחרים. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. Immunocytochemical ניתוח ביטוי של α1 GABA R / β2 / γ2 או α1 / β3 / γ2 בשורות תאי HEK293 יציבים. נוגדנים הכרה בתחומים תאיים של תת-יחידות GABA R שמשו לקולטנים תווית הביעו על פני התא. ( ) Α1 להביע שורת תאי HEK293 (אלקסה פלואוריד 488), β2 (אלקסה פלואוריד 555) וγ2 (Cy5) ברמות גבוהות. (Α1 שורת תאי B) HEK293 להביע (אלקסה פלואוריד 488), β2 (אלקסה פלואוריד 555) וγ2 (Cy5)תת-יחידות ברמות גבוהות. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> נוירונים קוצניים בינוני איור 2. GABAergic יצירת קשרים כמו סינפסה-עם α1 / β2 / γ2- לבטא בתאי HEK293 בשיתוף התרבות. (א) תיוג של פלורסנט מסופי presynaptic עם אנטי GAD65 נוגדנים (בירוק) וHEK293 תאים עם mCherry (באדום, משמאל) γ2 מקטע או GABA R (בכחול, מימין), חשפו נקודות של לוקליזציה שיתוף בין אלה סמנים המצביעים על היווצרותו של קשר כמו סינפסה-אחרי 4 או 24 שעות בשיתוף התרבות. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר (ב) ניתוח כמותי של שיתוף כמו סינפסה-<html> ntacts. HEK293 תאים זוהו על פי צורתם כפי שנחשפו על ידי הדמיה דסק&quot;ש ו / או ביטוי mCherry, ומספר אנשי הקשר בין GAD-65 puncta החיובית (בירוק) ואת פני השטח של תאי HEK293 נספר על ידי העין בכל חלק אופטי של סדרת Z-מחסנית (8 - 10) לכל תא באמצעות תוכנת ההדמיה, ומתבטאות במספר אנשי קשר / תא. הגרף מציג את מספר אנשי הקשר בין הנוירונים בינוניים קוצניים ושליטה HEK293 תאים (אפור בהיר) או α1 / תאים / γ2-HEK293 β2 (שחור) לאחר 4 ו 24 שעות בשיתוף התרבות (ממוצע ± SEM, n = 8 בכל אחד מצב משני ניסויים בלתי תלויים). נתון זה שונה מפוקס ואח &#39;. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> מודעה / 52,115 / &quot;width =&quot; 52115fig3highres.jpg 600 &quot;/&gt; Rs 3. GABA איור לקדם היווצרות של אנשי קשר פעילים הסינפטי. Immunolabeling של אנשי קשר כמו סינפסה-נוצרו לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות בין מסופי הנוירון קוצניים הבינוני חיוביים לGAD65 (אלקסה פלואוריד 405 ציאן) ו- (א) בתאים HEK293 שליטה, או / Β2 / γ2 HEK293 תאים-α1 (B), שניהם זמניים transfected עם mCherry לבנות (אדום). אנשי קשר פעילים מזוהים על ידי שיתוף לוקליזציה בין הנוגדן לומינל שלפוחית ​​תחום ספציפי נגד synaptotagmin (Cy5) ונוגדן GAD65 הספציפי הן במסופי presynaptic, וmCherry לידי ביטוי בתאי HEK293. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> igure 4 &quot;FO: = תוכן רוחב&quot; &quot;src =&quot; 6in / קבצים / ftp_upload / 52,115 / &quot;width =&quot; 52115fig4highres.jpg 600 &quot;/&gt; נוירונים קוצניים בינוני איור 4. GABAergic יצירת קשרים כמו סינפסה-עם α1 / β3 / מקטע γ2- להביע HEK293 תאים בשיתוף התרבות. תיוג פלורסנט של מסופי presynaptic עם אנטי synapsin אני נוגדנים (בירוק), ושליטה HEK293 תאים (משמאל), או α1 () / β3 / γ2 לבטא בתאי HEK293, שני transfected הזמני עם mCherry (באדום), חשף נקודות לוקליזציה שיתוף בין סמנים אלה מעידים על היווצרות קשר כמו סינפסה-לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר (B). ניתוח כמותי של אנשי קשר כמו סינפסה. HEK293 תאים זוהו על ידי ביטוי mCherry, ומספר אנשי הקשר בין synapsin אני חיובי puncta (בירוק) ואת פני השטח של תאי HEK293 נספר על ידי העין בכל חלק אופטי של סדרת Z-מחסנית (8-10) לכל תא באמצעות תוכנת הדמיה, ומתבטא במספר אנשי קשר / תא. הגרף מציג את מספר אנשי הקשר בין הנוירונים בינוניים קוצניים ושליטה HEK293 תאים (אפור בהיר) או α1 / תאים / γ2-HEK293 β3 (שחור) לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (ממוצע ± SEM, n = 8-12 תאים ב כל מצב, משני ניסויים בלתי תלויים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors at JoVE.com

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

המנגנונים המולקולריים הלתאם את ההיווצרות של סינפסות GABAergic המעכבת במהלך ontogeny אינם ידועים. ללמוד את התהליכים האלה, שפיתחנו מערכת מודל שיתוף תרבות אשר משלבת נוירונים GABAergic הקוצנית בינונית עובריים בתרבית יחד עם תאי הכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) transfected ביציבות להביע קולטני GABA פונקציונלי.

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA<sub&gt;</sub&gt; רצפטורים

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

inhibitory-synapse-formation-co-culture-model-incorporating-gabaergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

17.3K Views.  University College London.  המנגנונים המולקולריים הלתאם את ההיווצרות של סינפסות GABAergic המעכבת במהלך ontogeny אינם ידועים. ללמוד את התהליכים האלה, שפיתחנו מערכת מודל שיתוף תרבות אשר משלבת נוירונים GABAergic הקוצנית בינונית עובריים בתרבית יחד עם תאי הכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) ...

Video: Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...