Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC), Royal Society ve Nottingham Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

Mant olarak işaretlenmiş nükleotid bağlanması üzerine floresans yoğunluğunu değiştirmek 1. belirlenmesi. <ol><li> Uygun bir reaksiyon tampon maddesi içinde 1 uM kinesin (nihai konsantrasyonlar) için 1 uM mant-etiketli bir nükleotit ekleyin. Tipik mikrotübül büyüme ve istikrarı faydaları bir tampon (tartışma) kullanılır. Yaygın olarak kullanılan bir tampon 80 mM piperazin-bis-2-etansülfonik asit (PIPES) içeren pH6.9, 1 mM MgCI2 ve 1 mM etilen glikol-bis-2, iminoeter-tetraasetik asit (EGTA). Not: Tüm protokolde belirtilen kinesin konsantrasyonu, nükleotid bağlama bölgeleri (örneğin, motorlu etki) konsantrasyonu anlamına gelir. Farklı kinesinler monomerler, dimerler veya tetramerler olarak bulunur ve her bir molekül için birden fazla nükleotid bağlanma bölgesini içerebilir. </li><li> Bir kuluçka dönemine (1-3 dakika) ve standart bir florimetre kullanılarak sonra, MANT-işaretlenmiş nükleotid-kinesin kompleksi için emisyon spektrumunu ölçmek. 365nm bir eksitasyon dalga boyu ve kullanmaölçmek 1nm artışlarla 400-500 nm arasında ışığı yaydığı. </li><li> Aşama 1.1 &#39;de kullanılan aynı reaksiyon tampon maddesi içinde 1 mM bir çözeltisi mant olarak işaretlenmiş nükleotid olun. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi, tek bir nükleotid, MANT numune için emisyon spektrumunu ölçülür (bakınız Aşama 1.2). </li><li> Bu değer ile bölünerek (kinesin kullanılmadan doğrudan) çözelti içinde mant nükleotid spektrumunda tepe floresan yoğunluğunun dalga boyunda sinyaline normalize spektrumları. </li><li> (Örneğin, Şekil 2B) mantATP-bağlanmış ve / veya çözelti içinde mantADP bağlı kinesin ve mant nükleotid arasındaki floresans yoğunluğu farkları gözlemlemek için normalize spektrumları çizilir. </li></ol> MantATP için birleşme ve ayrılma oranı Katsayıların 2. Ölçüm <ol><li> -ücretsiz Tamponu 2 + herhangi bir uygun Mg en fazla 20 uM kinesin (tartışma) içindeki bir çözeltisine, (örneğin, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA,% 0.1 Tween 20) içinde, 1 ekleyinmM (son konsantrasyon) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 mM (son konsantrasyon) ditiyotreitol (DTT). Not: azaldıkça tampon Tween®20 ilavesi tavsiye edilir / tampon değişimi için kullanılan sütun üzerinde kinesin protein kaybını önler (Adımlar 2.3 ve 3.3) </li><li> 15 dakika boyunca 25 ° C&#39;da, çözelti inkübe edin. </li><li> (Malzemelerin listesine bakınız) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre bir yerçekimi akışlı, G-25 Sephadex jel filtrasyon kolonu kullanılarak kinesin ayırın ihtiva etmeyen nükleotid ve EDTA ihtiva eder. <ol><li> Uygun bir Mg +2 tamponu -ücretsiz en az 3 sütun hacmi ile sütun dengeye (Basamak 2.1). Kolona kinesin-içeren çözelti yükleyin. Magnezyum klorürün son konsantrasyonu kinesin çözeltisi toplanmasından sonra 1 mM olacak şekilde, boş tüp, 100 mM, magnezyum klorür çözeltisinin uygun bir hacmi ilave bir toplama tüpü hazırlayın. Magnezyum klorürün ilavesi anında yardımcı olur dayanıklılıknükleotid içermeyen kinesin se. </li><li> Uygun bir Mg 2 + -ücretsiz tampon kullanarak kinesin Zehir. Hızlı çalışmak için zaman önemlidir bu yüzden nükleotid ücretsiz Kinesinler kararsızdır. Buz üzerinde nükleotid-serbest Kinezin&#39;e saklayın ve 1-2 saat içinde kullanın. </li></ol></li><li> Sırasında ya da öncesinde nükleotid içermeyen kinesin hazırlanmasına nükleotid içermeyen kinesin nihai çözelti ile aynı tampon maddesi içinde bir reaksiyon mantATP konsantrasyon geliştirilmesidir. 0.1 ila 50 uM (adım 2.5 ve tartışmaya bakınız) arasında değişen tipik bir dizi kinesin mevcut konsantrasyonuna göre gerekli mantATP konsantrasyonlarının aralığı belirler. </li><li> Nükleotid-serbest kinesin&#39;in bir konsantrasyon dizi hazırlayın. MantATP her bir konsantrasyonu (2.4 adım) için, nükleotid içermeyen kinesin bir konsantrasyon, MANT-işaretlenmiş nükleotid kinesin nükleotid bağlayıcı siteler üzerinde 5-10 kat molar fazla olacak şekilde hazırlanmalıdır. </li><li> Durdu-flo üzerinde dalgaboyu ayarlayın365 nm florimetrede w ve uzun geçişli filtre kullanılarak&gt; 400 nm ışık yaydığı toplamak. </li><li> Durdurulan bir akış florimetresi (Şekil 3A ve 3B Ankastre) kullanılarak 1 hacim / hacim oranı: mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlayarak, 1 nükleotid içermeyen kinesin uygun bir konsantrasyonu ile mantATP karıştırın. Not: Reaksiyona giren maddeler karıştırma üzerine% 50 oranında seyreltilir. Karışıklığı önlemek için nükleotid konsantrasyon öncesi ve sonrası karıştırma (örneğin, 3.0 / 1.5 mM) not edin. </li><li> MANT grup, ışıkla hesaba üstel fonksiyon ayrıca sürekli olumsuz bir eğim hattına mantATP her konsantrasyonunda ölçülen floresan yoğunluğundaki değişim monte (örneğin, floresan, bir 0 .exp (atıl .T k) + (M =. T + 0 genliği, c) k gözlenen hız sabitidir ve T,) Şekil 3B ve açıklamalara bakın zamandır. Bu krizleri bir tespitmantATP her konsantrasyonunda sabiti (k, obs) oranı. Her bir K atıl bir birleşme ve ayrılma oranı sabiti (Şekil 1, k, 1 ve k-1) olan bir evrişim. </li><li> (Örneğin, Şekil 3C) mantATP konsantrasyonuna karşı taslak haline getirilmesi suretiyle k, atıl, birleşme ve ayrılma oranı sabitleri Deconvolve. Degrade ve y-ekseni kesişim elde etmek için doğrusal bir fonksiyonu (yani, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) bu verileri uygun. Gradyan birimlerinin M-1 s-1 ile ilişkili mantATP (Şekil 1, k, 1) için oran sabiti temsil eder. Kesişim s-1 (tartışmaya bakınız) birimleri ile ayrılma oranı sabitesinin (Şekil 1, k-1) temsil etmektedir. Bu yaklaşım, aynı zamanda, ADP, birleşme ve ayrılma belirlemek için uygulanabilir: Notnükleotid olarak mantADP kullanılarak oran sabitleri (Şekil 1, k, k -4 4). </li></ol> MantADP için ayrışma oranı 3. Sabit ölçüm <ol><li> Uygun bir reaksiyon tampon maddesi içinde 2 uM kinesin eden bir çözeltiye, (örneğin, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA,% 0.1 Tween 20), 50 uM mantADP (nihai konsantrasyon) ilave edilir. </li><li> 30 dakika boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> G-25 Sephadex kolonu kullanılarak, seçilen reaksiyon tampon maddesi içine kinesin alışverişi tamponu ile aşırı mantADP ve diğer serbest nükleotid kaldır, üreticinin talimatlarına uygun olarak (malzemelerin listesine bakınız). Kinesin Motor alanı şimdi mantADP yüklü olmalıdır. </li><li> 365 nm durdu akış florimetrede dalgaboyu ayarlayın ve uzun geçişli filtre kullanılarak&gt; 400 nm ışık yaydığı toplamak. </li><li> 50 katı veya daha büyük olan Mola mantADP.kinesin kompleksi (~ 1 uM) karıştırındurdurulan bir akış florimetre (Şekil 4A ve 4B, Ankastre) kullanılarak 1 h / h oranında bir 1 etiketlenmemiş ATP r fazla. </li><li> Tek bir üstel fonksiyon artı MANT grubunun ışıkla ağartma açıklamak için sürekli negatif bir eğim hattı zamanla gözlenen floresan yoğunluğundaki azalma monte (örneğin, floresan, bir 0 .exp (atıl .T k) + (m.t + = Bir 0 genliği, burada c), k gözlenen hızı sabittir ve t, zamandır,) Şekil 4B ve tartışmaya bakınız. Bu uyum tespit K atıl s-1 (tartışmaya bakınız) birimleriyle ADP (Şekil 1, k 4) ayrılması için oranı sabitidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+kinesin+motor+proteins.">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation:+one+engine,+many+machines.">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li><li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase.">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li><li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules.">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li><li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors.">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li><li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors.">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+analogues+at+a+glance.">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization.">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li><li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin.">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li><li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase.">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li><li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+interaction+of+2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1:+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes.">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li><li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity.">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li><li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor.">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li><li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke.">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li><li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin.">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li><li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, 69-97 (2006).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li><li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro.">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li><li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules:+a+brief+historical+perspective.">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li><li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase.">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li><li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism.">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li><li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins.">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada, bir kinesin&#39;in için nükleotid devletler arasındaki geçişlerin kinetik gözlem ve analiz için protokolleri sunuyoruz. Bu protokoller, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak hızlı karıştırma yöntemi durdu akışı kullanmaktadır. Bu tip yöntem kinesinlerin 9-11,13-16 çeşitli nükleotid bağlanma ve ayrılma incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Fosfat serbest (Şekil 1, Aşama 3) gözlenmesini izin vermez açıklanan yöntemler. Bununla birlikte, durdurmalı akış bir floresan yoğunluğu değişim 17 bağlanması için fosfat üretimini fosfat algılama proteini kullanarak, bu geçiş gözlemlemek için kullanılabilir. Proteine ​​bağlanan genel olarak, flüoresans yoğunluğunda bir artış sergiler küçük flüorofor methylanthraniloyl (mant) kullanımı ile etiketlenmiş nükleotitler, sunulan yöntemler. Ayrıca, MANT florofor zaman R 2 &#39;veya 3&#39; pozisyon ya da konjügeibose, genellikle 9-12 nükleotid bağlanma, çözünme veya hidroliz üzerine çok az veya hiç etkisi yoktur. Mant-etiketli nükleotidler ticari kaynaklardan (malzemelerin listesine bakınız) kolayca elde edilebilir ve tek bir izomer 8 için saflaştınrken hızla yeniden dengeye olarak, 2 &#39;ve 3&#39; konjügat karışımları olarak sağlanmıştır. Mant-etiketli nükleotidler nükleotid bağlama ve ayrışma kinetikleri görülebildiği ile mükemmel bir bildirici molekül oluşturmak. , Floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılması tarif edilen deneyler üzerinden flüoresans yoğunluğunda bir gerçek zaman değişikliği okumak olduğu anlamına gelir. Bu reaktifler, hızlı karıştırma ve daha sonraki reaksiyon ile bağlantılı floresan değişikliklerin gerçek zamanlı gözlem sağlar durdurmalı akış floresan, bu deneyler, ideal hale getirir. Saptama yöntemi olarak karıştırma tekniği ve floresan gibi durdu akışı araya gelmesi göreceli olarak örnek EF bir sistem üretirficient. Örneğin, 0.8 gerektirir Şekil 3C&#39;de gösterilen veri elde etmek için - saflaştırılmış kinesin-13 1.0 mg, MCAK ve Şekil 4B&#39;de gösterilen veri elde etmek için, saflaştırılmış ~ kinesin-13, 0.3 mg MCAK gerektirir. Bir florofor olarak mant kullanımının bir dezavantajı, ışıkla eğilimli olmasıdır. Bu durdu-akış, kinesin yokluğunda, reaksiyon tampon maddesi ile mant olarak işaretlenmiş nükleotid ihtiva eden bir çözelti karıştırma ile reaksiyon kinetiği kinesin ayrı olarak görülmektedir. MANT grubu ağartılmış olduğunda, flüoresans yoğunluğunda bir yavaş azalması gözlenmektedir. MANT grubunun photobleaching tarif edilen protokollere kullanılan çizelgesinin aralığı üzerinde iyi bir doğrusal fonksiyonu ile tarif edilmektedir. Bu yüzden, ışıkla ağartma için veri düzeltmek için, basit bir şekilde tek bir parametre ile tarif edilen bir doğrusal fonksiyonu (örneğin, mt + c) &#39;yerine daha sık yassı bir temel hat ile tarif edilen bir taban içeren bir üstel fonksiyon için uygun etmektir. mantATP bağlama MantATP arasında Birleşme ve ayrışmaya ilişkin oran sabitleri mikrotübül yokluğunda kinesin nükleotid bağlanma yeri ile bağlantılı olarak kalır (Kısım 2) ADP ölçülürken, çıkarılmalıdır. Bu mantATP, birleşme ve ayrılma (Şekil 1, aşama 1) ADP ayrışma ayrı olarak görülmektedir sağlar. Bu kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin (2.1 adım) üzerinden EDTA en az 50-kat fazlası ile inkübe edilir elde etmek. EDTA Mg 2 + iyonları nükleotid 11 salınımına neden nükleotid-bağlayıcı cebinden, uzaklaşmak için Mg 2 + neden tecrit. Yürütülmesi 2.1 adım Bu nedenle, - 2.3, bu Mg +2 ücretsiz tampon kullanmak hayati önem taşımaktadır. Nükleotid-serbest kinesin protein tampon ücretsiz nükleotid gelen ve EDTA hem ayırmak için alışverişinde olduğunu. Bu ayrılık, bir tek yerçekimi akışı ge gerçekleştirmek içinl filtrasyon kolon yeterlidir basit ve (malzemelerin listesini görmek) kullanmak için hızlıdır. Nükleotid serbest kinesin ile mantATP etkileşimi, birleşme ve ayrılma oranı sabiti (2.8 aşamasının) kıvrım giderme sağlamak için mantATP konsantrasyonda (Basamak 2.4) aralığında gerçekleştirilir. Bu tip deney arkasındaki teori, ayrıca tek mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlar, bu deneyler içinde referans 18&#39;de açıklanmaktadır. Bu, farklı konsantrasyonları arasında yıkama aşamasına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Büyük olasılıkla mantATP konsantrasyonu arttıkça durdu akış florimetrede hassasiyetini ayarlamak için gerekli olacaktır. MantATP konsantrasyonu her zaman sözde birinci dereceden koşulları sağlamak için kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin konsantrasyonuna göre en az 5 kat fazla olmalıdır. MantATP konsantrasyonu artar Bununla birlikte, sinyal değişimi düşüşler kinesin bağlanan nükleotid fraksiyonu olarak gömülmek hale gelir. Therefo, kinesin konsantrasyonu da mantATP her yeni konsantrasyonu artırılır, bu tür yeniden mantATP konsantrasyonu, nükleotid bağlanma sitelerinin (2.6 adım) fazla 10 kat molar fazlalık daha asla daha fazladır. mantADP Ayrılma MantADP için birleşme ve ayrılma oranı sabitleri mantATP (Kısım 2) için tarif edilen aynı yöntemle belirlenebilir açabilir. Bir kinesin ADP ayrışması doğrudan mantADP.kinesin kompleks, etiketlenmemiş ATP (adım 3.5) fazlası ile karıştırılır mantADP (Aşama 3.1-3.3) nükleotid bağlanma sitesi önyüklemeyle gözlenebilir. Fazla etiketsiz ATP kinesin&#39;in için mantADP yeniden bağlanmasının önler ve böylece mantADP örgütlenme ayrı olarak uyulması gereken ayrışma reaksiyonu (Şekil 1, k 4) verir. Bu tahlilde, etiketlenmemiş ATP konsantrasyonu nuc en azından bir 50 kat fazla mol olmalıdırbağlanma yeri oligonükleotid. Bu deneyde arkasındaki teori de bu doğrudan yöntem, Aşama 2.8 &#39;de tarif edilen Y-eksenine göre sabit bir ekstrapolasyon ayrışma hızı için daha doğru bir değer verir referans 18&#39;de açıklanmaktadır. Mikrotübüller İçerme Açıklanan yöntemler aynı zamanda mikrotübül mevcudiyetinde nükleotid bağlama ve ayrışma kinetiklerini belirlemek için kullanılabilir. Mikrotübüller önce durdu-akış karıştırma nükleotid ihtiva eden bir şırıngaya konur: Şekil 3B ve 4B alt şırınga (Insets). Bu mikrotübülleri, uygun olarak, bu yapılandırmada, kinesin aynı zamanda nükleotid karşılayacaktır. Stabilize mikrotübüller tübülin polimerin ömrü, stabilize edici kimyasal ya kullanımı ile uzatılmış olduğu, kullanılan örneğin &#39;guanosin-5 gibi taksol veya nonhydrolysable GTP analoğu gibi - [(α, β) -methyleno] trifosfat (GMPCPP, malzeme listesine bakınız). Bu sıvı azot 9,19 birçok ay boyunca saklanabilir mikrotübülleri yapmak GMPCPP sahip tübülin polimerizasyonu iki çevrim kullanmak mümkündür. Önceden hazırlanmış mikrotübül kullanılması nedeniyle, bu tahliller yapmak için pratik güçlüklerle azaltır. Tahlillerinde mikrotübül dahil etmek için, bir mikrotübül stabilite için uygun olan bir reaksiyon tamponu kullanılması önemlidir. Tercih tamponu (BRB80 olarak da bilinir), 80 mM PIPES pH 6.9, 1 mM MgCI2, 1 mM EGTA 20,21 ihtiva eden en yaygın olarak kullanılan tampon madde ile, borularla vardır. Açıklanan yöntemler kinesinlerin ile kullanımı sınırlı değildir, ancak uyarlanmış herhangi bir nükleotid bağlayıcı proteine ​​uygulanabilir. Örneğin, benzer yöntemlerin moleküler motorlar 12,22 arasında miyozin ailesi ve mant etiketli guanozin nükleotitlerin kullanılması daha uzun ve üyelerinin ATP devir döngüsü uygulanmıştırBu tip yöntemler, proteinleri, GTP ye hidrolize 23,24.

Kinesinler yüksek oranda korunan bir motor fonksiyonun 1 ile karakterize edilen bir protein süper-familyası vardır. Kinesin motor fonksiyonun bir nükleotid bağımlı bir şekilde mikrotübül ile etkileşime girer. Kinesin aile üyeleri mikrotübül dinamiklerini 2,3 düzenleyen olmayan translocating mikrotübül son bağlayıcı kinesinlerin Mikrotübüllerin boyunca yönlendirilmiş bir şekilde yük taşımak translocating kinesinlerin, fonksiyonları bir dizi görüntüler. Kinesinler, 4-6 iskeleti mikrotübül ile etkileşimlerini düzenleyen adensosine-5&#39;-trifosfat (ATP) ciro kullanın. ATP, ADP ADP.Pi ya da nükleotid bağlı olabilir (Şekil 1) için mikrotübül kinesin motor fonksiyonun ve dolayısıyla afinite konformasyonu, nükleotid durumuna göre değişir. Bir kinesin&#39;in moleküler mekanizmasını anlamak için, ATP ciro ve mikrotübül etkileşim arasındaki ilişkinin bir anlayış gereklidir.refore, kinesin alanda önemli bir amacı, farklı nükleotid durumlarının fonksiyonel özellikleri ve mikrotübüllerin varlığında ve yokluğunda her ikisinin arasındaki geçişlere kinetiklerini nitelendirilmesidir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Bir kinesin&#39;in için basit ATP ciro döngüsü Şekil 1. Dört olası durumlar oluşur:. Nükleotid-free (Φ) dört geçişler her bir ileri ve bir ile karakterize, ADP.P i-bağlı, ATP bağlı ve ADP-bağlı Geriye hız sabiti (k x ve sırasıyla -x k). ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşim mekanik döngüsüne bağlanmış anlamak için, bir kuru microtub yokluğunda sınırlayıcı ATP ciro döngüsünde hangi aşamasını belirlemek gerekirModüller, ve sonra çevrim mikrotübül varlığı ile değiştirilmektedir biçimini belirler. En basit ATP çevirme süresi dört ayrı kimyasal adımlardan oluşur: (1) ATP boş yere bağlanabilen (Φ ve boş, yani nükleotid içermeyen kinesin temsil eder); (2) ATP bölünmesi; (3) ayrışma fosfat ve (4) ADP ayrılma (Şekil 1). Oran-sınırlayıcı aşama tamamlandıktan ATP devir döngüsü için hız sabitini belirler. Bu nedenle, tek tek geçişler her ölçülmüş ve tam devir için hız sabiti ile karşılaştırılır sınırlayıcı oran olan adım belirlemek için. Yöntem burada açıklanmayan genel ATP çevirme süresi hızı sabitini ölçmek için değil Burada referans 7&#39;de bulunabilir, tek tek kimyasal aşamalar için oran sabitleri belirlenebilir edildiği metotları da tarif eder. Bir nükleotid hidroliz proteinin çevirme süresi bireysel geçişleri çalışma mevcut yöntemler vardır. Burada sunulan yöntemler sunar advantagflorofor ile işaretlenmiş nükleotidlerin methylanthraniloyl özelliklerinin e 8 genellikle protein bağlanması üzerine, flüoresans yoğunluğunda bir değişme sergilemekte mant, olarak adlandırılır. Küçük boyutlu riboz (Şekil 2A) ile birleştirildiğinde, genellikle nükleotid bağlayıcı ya da hidroliz 9-12 kinetikleri üzerinde çok az ya da hiçbir etkisi yoktur, anlamına gelir, çünkü MANT grubu kullanılır. Burada, bir kinesin ATP ciro döngüsünde nükleotid bağlama ve ayrışma gözlenmesine imkan vermek için durdurmalı akış floresan ile bağlantılı olarak mant-işaretlenmiş nükleotidlerin kullanımını anlatan protokolleri sunuyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

Mikrotübül ilişkili motor proteinlerinin kinesin süperailesi hem ATP hidrolizler ve mikrotübülleri bağlayan bir karakteristik motorlu etki alanını paylaşır. Kinesinler ATP ciro ve mikrotübül etkileşim hem süperailesinin genelinde farklılıklar gösterebilir. Bu farklılıkların, kargo taşımacılığı, Mikrotubullerin sürgülü, mikrotübül depolimerizasyona ve mikrotübül stabilizasyonu gibi çeşitli fonksiyonları belirli kinesinlerin terzi. Bir kinesin&#39;in etki mekanizmasını anlamak için ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşimin mekanik döngüsü birleştiğinde nasıl anlamak önemlidir. ATP çevirme süresi incelemek için, bir yaklaşım; çevriminde tek tek adımları görselleştirmek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılmasıdır. ATP ciro döngüsündeki her bir nükleotid geçiş kinetiklerini belirlemek tam döngüsü tespit edilmesi için oran-sınırlayıcı aşama ya da aşamalara sağlar. Bir kinesin için, içerisinde, hız kesici aşama bilmek önemlidirkinesin mikrotübüller ile etkileşime girdiğinde mikrotübül yokluğu, bu adım, genel olarak birkaç bin kat olarak hızlanır. Mikrotübüllerin yokluğunda Bu daha sonra tamamen kinesin ATP çevirme süresi anlama mikrotübül mevcudiyetinde ile karşılaştırılır. Tek tek nükleotid geçişler kinetiği genellikle elle özellikle mikrotübül varlığında, reaktifleri, gözlenmek için çok hızlıdır. Hızlı bir karıştırma cihazının, kinetik bir kaç milisaniye gibi kısa bir zaman ölçeği içinde gözlemlenen sağlayan bir durdurmalı akış florimetresi olarak, bu tür geçiş izlemek için de kullanılabilir. Burada, durdu akışı ile hızlı karıştırma reaktiflerin bir kinesin ATP çevirme süresi incelemek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak kullanıldığı protokolleri açıklar.

MANT grubunun, flüoresans yoğunluğunda bir artış tipik olarak kinesin için mant olarak işaretlenmiş nükleotid bağlanması üzerine gözlenmiştir. Bununla birlikte, böyle bir sinyal değişikliğin büyüklüğü, söz konusu olan kinesin bağlıdır. Bu nedenle, bu kinetik deneyler için ilerlemeden önce bir flüoresan yoğunluğu değişim varlığını ve büyüklüğünü hem de teyit etmek için denge ölçümlerini gerçekleştirmek için yararlıdır. MantATP ve mantADP için tipik floresan spektroskopisi, ve kinesin-13, MCAK ile kompleks hem de Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir. Bu veriler MCAK bağlanması üzerine mantATP ve mantADP her ikisi tarafından gösterilen floresan yoğunluğu artışı vurgulamaktadır. Bir kinesin&#39;in için mant nükleotid bağlanması üzerine floresan yoğunluğundaki değişim dernek ve ATP ve ADP hem dissosiasyonuna bildirmek için kullanılır (Bölüm 2 ve 3). MCAK durumunda, bir flüoresan yoğunluğu bir fark mantATP.kinesin ve mantADP.kinesin arasında görülmektedir <sus&gt; 9. Şekil 3 A, nükleotid içermeyen kinesin ile mantATP karıştırma üzerine cereyan eden, reaksiyon göstermektedir. Kinesin-13&#39;e mantATP bağlanması * ile oluşan floresan yoğunluğundaki artışı gösteren Örnek bilgileri, MCAK Şekil 3B&#39;de gösterilmiştir. Şekil 3B&#39;de gösterilen tipte veri mantATP bir konsantrasyon aralığında toplanır. MantATP konsantrasyonuna karşı belirlenen hız sabitleri (K gözlenen) bir grafiği Şekil 3C &#39;de gösterilmiştir. Bir doğrusal bir fonksiyonu bu verileri takılması (yani, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) atıl (2.8 Adım) k katkıda hız sabitleri dekonvulasyon sağlar. Bu nedenle, esas ve mantATP için ayrışma oranı sabiti hem belirlenmesini sağlayan (Şekil 1, k, 1 ve k, <em&gt; -1 sırasıyla). Şekil 4A, etiketlenmemiş ATP fazlası ile mantADP.kinesin karıştırma üzerine cereyan eden, reaksiyon göstermektedir. Şekil 4B&#39;de veriler kinesin-13, MCAK ayrıldıktan sonra mantADP için gözlenen floresan yoğunluğu azalmayı göstermektedir. MantADP ayrılması için (adım 3.6), bir üstel fonksiyon için hız sabitini bu verileri uydurularak doğrudan belirlenir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Fluorofor methylanthraniloyl (mant) ile etiketlenmiş nükleotidler Şekil 2. ATP çevirme süresi bireysel adımları izole etmek için kullanılır. Riboz üzerindeki yerine 2 &#39;veya 3&#39; ya da konjüge MANT fluorofor konumunu gösteren mantATP (A) yapısı. (B) çözeltisi (mAXP) olarak mantATP ve mantADP Normalize floresan spektrumu ve bir mantATPkinesin&#39;in MCAK (MATP + MCAK ve mADP + MCAK) ile kompleksi d mantADP. MantATP spektrumu çözelti içinde mantADP için azami floresan normalize çözelti içinde mantATP için azami floresans ve mantADP spektrumları için normalize edilir bulunmaktadır. MCAK ile karıştırılmış, MANT nükleotidlerin spektrumları 1 dakika karıştırma sonrası toplanır. Olarak protokolde açıklanan reaktifler ve florimetrenin ayarları konsantrasyonu 1.1 ve 1.2 adımları. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> MantATP arasında, bağlantı oranı sabitinin Şekil 3. ölçümü. (A) durdu-akış ile yer mesaja karıştırma alır tepkiyi gösteren şematik: mantATP (MATP) nükleotid-free Kinezin&#39;e bağlanır. Proteinine bağlanması üzerine, MANT grubu artar floresans yoğunluğu. (B) &#39;Flüoresan sinyali, değişiklik (siyah) MCAK ile mantATP (25 M) (5 M nu karıştırma üzerine gözlenencleotide içermeyen). Bu veri (tartışma) mant floroforun ışıkla hesapları tek bir üstel fonksiyonu artı sabit negatif eğim bir çizgi, sığdırma (kesik kırmızı) Ankastre:. Önce durdu akış florimetrede karıştırma şırınga içeriği. nükleotid içermeyen MCAK ile mantATP reaksiyonu için hesaplanmış bir (C) hız sabitleri (K atıl) mantATP konsantrasyonu ile karşılaştırıldı. Bu grafik, M-1 s birimleri ile, bağlantı oranı sabitinin (Şekil 1, k, 1) olan gradyanı -1 ve y-dinleme ayrılma oranı sabit kalır (Şekil 1, k-1) ile olan bir doğrusal bölgesine sahip olacaktır s birimleri -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> . MantADP ile yüklenmiş kinesin etiketlenmemiş ATP fazla bir katma seyreltilir: mantADP için ayrışma oranı sabiti Şekil 4 ölçümü (A) şematik akış durduruldu-sonrası karıştırma yer alan reaksiyon görünümüdür. Böylece ayrıştırma mantADP mantADP Birliği (tartışmaya bakınız) arka reaksiyonunu önlemek, etiketlenmemiş ATP ile değiştirilir. MANT grubunun flüoresan yoğunluğu, proteinin ayrıldıktan sonra azalmaktadır. Kinesin MCAK gelen mantADP dissosiye üzerine gözlenen (B) Floresans bir azalma. Floresan sinyali (siyah) (tartışma) mant grubun ışıkla hesabını tek bir üstel artı sürekli olumsuz bir eğim çizgisine uygun (kesikli kırmızı) &#39;dir. Belirlenen hız sabiti mantADP (Şekil 1, k ayrılması için hız sabitidir4) Ankastre:.. Durdurulmuş akış florimetrede karıştırma önce şırınga içeriği <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Kinesinler mikrotübüllerle nükleotid-bağımlı etkileşimi ile karakterize edilir: mikrotübül bir etkileşim döngüsü birleştiğinde ATP ciro bir döngü. Burada, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ve durdurmalı akış floresan kullanılarak kinesin ATP çevirme süresi bireysel nükleotid geçişler kinetiği analiz protokolleri açıklar.

Floresan-Akış durdu ve Etiketli Nükleotidlerinin Kullanım kinesinlerin ATP Ciro Döngüsü Analiz için

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K Görüntüleme.  University of Nottingham.  Kinesinler mikrotübüllerle nükleotid-bağımlı etkileşimi ile karakterize edilir: mikrotübül bir etkileşim döngüsü birleştiğinde ATP ciro bir döngü. Burada, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ve durdurmalı akış floresan kullanılarak kinesin ATP çevirme süresi bireysel nükleotid geçişler kinetiği analiz protokolleri açıklar. 

Video: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

Hazırlanması ve Samaryum Diiodide Kullanımı (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) In Organic Synthesis: Samaryum Barbier Reaksiyonu HMPA ve Ni (II) tuzlarının Mekanistik Rolü

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Kimya

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

Hamilelik sırasında Sıçan Karaciğer dokusunda yağ asitleri arasında kompozisyon değişiklikleri analiz Gaz Kromatografi Kullanımı

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan&#39;a bağlı İzleme

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

Beyaz Fosfor harekete geçirmek Karbonil dekore Karbenlerin hazırlanması ve kullanımı

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Bioconjugation ve radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt;, Zr-DFO-etiketli antikorlar

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

Schlieren Fotoğraf Kullanımına Ortam kütle spektrometresi görselleştirme

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Bir Kullanarak Altın Nanopartiküller Verimli Radyoaktif bir Optimize Protokolü<sup&gt; 125</sup&gt; I-etiketli Azid Protez Grubu

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Hazırlama ve Değerlendirilmesi<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal Kimya Kullanarak Öncesi hedeflemek için üç dişli Şelatlar Tc-etiketli

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...