These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Etik deyimi: De tanımlanan insan doku ve plazma numuneleri Kurumsal Değerlendirme Kurulu altında Hendrick Tıp Merkezi&#39;nden elde edildi protokolü onayladı. Biyotinile Antikor 1. İlave NOT: Bu adımda izlenmesi isteğe bağlıdır. Izleme takdirde alternatif protokolü bakınız. <ol><li> Piyasada mevcut avidin türevi kaplı plakaları (Materyalleri ve Ekipmanları Tabloya bakınız) edinin. </li><li> Oyuklara 50 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) pH 7.2 ekleyin. NOT: 28 ° C Kuluçkalama Öncesi, PBS ısıya bağlı rezonans değişimleri en aza indirmek için. </li><li> Açık biyodeney tarayıcı yazılımı ve boşlukları, standartların seçimi ve örnekleri plaka düzeni, sıcaklık ayarını (28 ° C), min başına taramalarının sayısını içeren deneysel prosedür tanımlamak için Kur Sihirbazı izleyin (1), ve deney uzunluğu ( 150 dakika hazırlayıcı adımlar için karşılamak için). </li&gt; <li> Etiket serbest biyodeney tarayıcı içine hazırlanan tahlil plaka takın ve ilk taramayı başlatın. İlk tarama tamamlandığında, &quot;başlatmak için kendini referansı&quot; seçeneğini seçin. temel deneyin başlangıcında toplanan tarama başlangıç ​​kümesidir. Bu özel plaka üzerinde yapılan ilk okuma ise, tarayıcı sıcaklığını dengelenmesi ve bazal içinde sürüklenme ortadan kaldırmak için çalışmasına izin. Örnek ilave tarafından izlenen bir başlangıç ​​bir ekran görüntüsü için Şekil 2 bakınız. </li><li> Temel stabilize, ya da en azından 5 tarama sonra, okuma duraklatmak ve plaka çıkarma. </li><li> Lavabo boşaltma ile PBS çıkarın ve plaka üzerinde kontrol kuyuları, ancak tüm [PBS pH 7.2 içinde 10 ug / ml], 50 ul RL21A biyotinile antikor ekleyin. Kontrol oyuklarına 50 ul PBS ilave edin. </li><li> Geri biyodeney tarayıcıya plaka takın ve doygunluk, yaklaşık 1.5 saat ulaşılana kadar okumaya devam. </li><li> Okuma Pause ve plaka çıkarma. </li><li> Yıkama<html> plaka 200 ul 200 ul / göz PBS pH 7.2 ile 3 kez durulanır, ardından / oyuk fosfat tamponlu tuz +% 0.05 Tween 20 (PBST) ile 3 kere yıkanır. PBS ile tekrarlayın. Bir sonraki adıma hareket önce kağıt havlu üzerinde plaka aşırı PBS dokunun. Not: Bu adım, otomatik plaka yıkayıcı üzerinde gerçekleştirilen veya lavabonun içine sıvı damping ve bir pipet ile PBST değiştirerek plaka 200 ul PBST ile 3 kez yıkayın olabilir. </li><li> Tüm aktif oyuklara 50 ul PBS pH 7.2 ekleyin. </li><li> Geri biyodeney tarayıcıya plaka takın ve yıkama sonrası rezonans izlemek için okumaya devam edin. </li><li> Okuma durdurun ve plaka çıkarma. </li></ol> Aşama 1 için alternatif protokolü: <ol start="13"><li> Tüm oyuklara [10 ug / ml PBS] 50 ul RL21A biyotinile antikor ekleyin. </li><li> 1.5 saat ya da gece boyunca 4 ° C, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 200 ul plaka 3 kez yıkayın / PBST adım 1.9 200 ul / göz PBS ile 3 kez durulanır. </li></ol>Analitin jove_title &quot;&gt; 2. Eklenen <ol><li> PBS çıkarın ve uygun deney tamponu oyuk başına 50 ul ekle. Bu tahlil için, ticari olarak temin edilebilen normal insan serumu, PBS içinde seyreltilmiş 1:20 kullanılmıştır. </li><li> Açık biyodeney tarayıcı yazılımı deneysel prosedür tanımlamak için Kur Sihirbazı izleyin. </li><li> Biyodeney tarayıcıya plaka takın ve temel okuma başlar. Bu özel plaka üzerinde yapılan ilk okuma ise, sıcaklığı dengelenmesi ve bazal içinde sürüklenme ortadan kaldırmak için tarayıcı çalıştırın. </li><li> Temel stabilize, ya da en azından 5 tarama sonra, okuma duraklatmak ve plaka çıkarma. </li><li> Kuyulardan deney tamponu çıkarın. </li><li> Ile başak kontrol HLA A * 02: [0,625-10 mg / ml] &#39;den deney tamponu arasında değişen ilgili (FLSL) ya da konsantrasyonlarda ilgisiz (SLLV, YLEV veya KVL) peptidleri taşıyan 01 bir monomer. Levhanın kontrol oyuklarına standartların 50 ul ekle </li><li> Örnek deney tamponu içinde bir analit &#39;in 50 ul ekleplaka kuyuları. Bu tahlil için, ticari olarak temin edilebilen insan serum kullanılmıştır çivili. </li><li> Yaklaşık 30-60 dk geri biyodeney tarayıcıya plaka takın ve doygunluk ulaşılana kadar okumaya devam. </li><li> Okuma Pause ve plaka çıkarma. </li><li> 200 ul plaka 3 kez yıkayın / PBST adım 1.9 200 ul / göz PBS ile 3 kez durulanır. </li><li> Tüm aktif oyuklara 50 ul deney tamponu ekleyin. </li><li> Geri biyodeney tarayıcıya plaka takın ve yıkama sonrası rezonans izlemek için okumaya devam edin. </li><li> Okuma durdurun ve plaka çıkarma. Not: Deney tamponu: PBS, doku kültür ortamı veya deneyinin amacına bağlı olarak, PBS içinde 1:20 seyreltilmiş insan serum olabilir. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Biyodeney tarayıcı yazılımı veya ihracat tercih istatistiksel analiz yazılımı ham veri dosyaları kullanarak analiz edin. biyodeney tarayıcı yazılımı otomatik dayalı bağlanma eğrisi oluştururDeneysel kurulum sırasında verilen plaka düzeni. NOT: Analiz için biyodeney tarayıcı yazılımını kullanarak değilse, adımları 3.2-3.4 izleyin. </li><li> Sonraki her veri noktasından bazal ve negatif kontrol çıkartın. </li><li> Her zaman noktasında tekrarlanan kuyular için ortalama ve standart sapma hesaplayın. </li><li> Çubuk grafikler için bağlayıcı eğri seçin veya uç nokta veri grafiğini oluşturun. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Yazarlar, Debra Wawro Weidanz ve Robert Magnusson, bu makalede kullanılan biyodeney plaka okuyucu ve tahlil plakaları üreten Rezonans Sensörler Incorporated, sırasıyla İcra Kurulu Başkanı ve Baş Teknoloji Sorumlusu vardır.

Burada tarif edilen yöntem, yüksek bir verim içinde hasta serum, plazma, idrar, tükürük örnekleri çözünür peptid / HLA komplekslerinin hızlı algılama sağlar 96- ya da 384-kuyucuklu format olur kanser teşhis için bir biyolojik işaretleyici tarama sistemi sunar. Monoklonal antikorlar ve etiket içermeyen algılama sistemi taklit T hücre reseptörü kullanan bu tahlil sistemi, geleneksel ELISA ile 3.5 saat kıyasla daha az 1 saat analiz süresini keser. Bu yüksek verimlilik yaklaşımı terapötik kanser aşıları veya biyofarmasötikler için klinik çalışmalarda hastaların hızlı tabakalaşma sağlar. Bu hastalık hedeflerin saptanması için güncel yöntemler tek tek hasta numuneleri, bir zahmet verici ve zaman alıcı bir afinite saflaştırmasını ve HPLC-MS / MS gerektirir. Bu yöntem, geleneksel ELISA teknikleri için uygun olmasına rağmen, endişe anti-β2 mikroglobulin antikor gibi ikincil algılama reaktifler doğmakta olan HL yapısını değiştirebilir ki oradaBir molekül ve TCRm sınırlayıcı algılama bağlanmayı inhibe eder. Etiket-ücretsiz algılama bu endişeleri azaltır. Bu yöntem, bir yüzey plazmon rezonans sistemi gibi diğer etiketi içermeyen sistemlerde kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Bununla birlikte, bu büyük ölçüde bu çalışmada kullanılan biyo-deney sistemi ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir çıktı kapasitesini azaltacaktır. Bu protokol etkin bir şekilde birkaç kritik adımlar bağlılık ile hasta serumu ve plazma olmayan HLA biyomarkerların tespiti için modifiye edilebilir. Bir &lt;200 um kayması olası daha sonraki belirleme adımında düşük sinyal neden olacağı için, başlangıç ​​antikoru kaplama sürecinin gözlemlenmesi, yüzey optimizasyonu için tavsiye edilir. serum proteinleri zenginliği düşük konsantrasyon analitin bağlayıcı maske edilebilir baz ve yıkama sonrası okur bitiş noktası analizi için de yararlıdır. Son olarak, örneklerin sıcaklık değişimi iyi de varyasyona neden olabilir. Tüm numuneler, bir ön-inkübe edilmesi önerilmektedird etiketi serbest biosassay birim sıcaklık kontrol oda sıcaklığının üzerinde 2-3 ° C &#39;de ayarlanabilir. Soğutmalı örnekler çalışma sıcaklığına ulaşması için yeterli zaman tanınmalıdır. Bu protokolün gelecek değişiklikler plaka yüzeyinde TCRm katlandınîmasını içerecektir. biyo-deney sistemi, en az 8-kompleks bir yoğunlukta kuyu tespit etmek uyarlanabilir. Test numunesi hacimleri başına, her kuyuya 4-8 TCRm tanıtarak azalır ve hasta başına giderek karmaşık verilerin toplanmasını sağlamak vardır. Bu özellik ayrıca tedavi seçenekleri ile ilgili hastaları bilgilendirmek.

sınıf I insan lökosit antijeni (HLA) örnekleri hücre içi protein repertuarının proteozomal bozulması türetilen uzunluğu 8-11 amino asit arasında peptidler ve her çekirdekli hücre 1,2 yüzeyi üzerinde bu peptidleri sunulur. HLA kompleksi dolaşan sitotoksik T lenfositler (CTL), (Şekil 1), her bir hücrenin sağlık gösteren &quot;doğanın biyomarker&quot; dir. CTL ile kusurlu hücre ortadan kaldırılmasında hastalıkla ilişkili peptidler sonuçların tanınması. Bu nedenle, adaptif bağışıklık tepkisi, viral enfeksiyon ve tümör ortadan kaldırılması oldukça etkilidir. Ancak, bağışıklık sistemi genellikle etkili bir CTL yanıtı kaçma yeteneğine virüs veya tümör için seçimi teşvik basınç uygular. Taklit T-hücresi reseptörü (TCRm) monoklonal antikorlar, spesifik peptit / HLA-A * 02 tanır (mAb &#39;ler), meme kanseri ilişkili proteinler, makrofaj göçü inhibe edici faktör türetilenler gibi 01 kompleksleri (MIF19-27) 3 ve NY-ESO-1 157-165 CTL 4,5 tepki etkili bir anti-tümör yokluğunda algılama ve meme kanseri hücrelerinin ortadan kaldırılması için. Bu temsili çalışma nüfusunun% 30&#39;a varan ile ifade edilir HLA-A * 0201 molekülü, odaklanmıştır. Ancak, TCRm üretimi takiben diğer ilgili HLA / peptit kompleksleri tanımlanması, çok daha geniş bir nüfusa bu işin programı genişleterek, hedeflenen imünoterapiler ve arkadaşı hastalığı teşhis gelişimini sağlar. Hücre yüzeyi bağlı peptit / HLA komplekslerinin bir kısmı plazma salınır. Nedeniyle HLA ilişkili biyomarkerların için immunopeptidome madencilik için peptid / HLA havuzları, mevcut yöntemlerin son derece karmaşık doğası zaman alıcıdır. Bu işlem plazma çözünür HLA afinite saflaştırılmasını gerektirir, ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile, HLA ilişkili peptitler ayrılmasıTandem kütle spektrometrisi (MS / MS), 6,7 ile (RP-HPLC) ve peptit sıralaması. Bu süreç yeni terapötik hedeflerin keşfi için uygun bir seçenek olmasına rağmen, zaten terapötik aşı veya biofarmasötik boru hattı 8-10 HLA ilgili hedefler için bir arkadaşı tanı aracı olarak hantal bir süreçtir. Bu hedefler, ilgili klinik çalışmalarda içine hastaları stratifying ve daha bilinçli tedavi seçenekleri sunmak amacıyla hızlı arkadaşı teşhis gelişimi için araçlar temin karşı TCRm yönetti. Bu çalışmada, kanser teşhis için bir atılım biyobelirteci tarama sistemi TCRm ve minimal işlem adımları ile biyolojik etkileşimleri izleyen bir etiket ücretsiz biyoanaliz sistemini kullanan hangi sunulmuştur. etiketsiz biyo-analizi sistemi dielektrik dalga kılavuzu ızgarası 11-14 oluşur güdümlü modda rezonans (GMR) etkisini kullanan yöntem dayanmaktadır. Ne zaman genişbant ışığı temas difraktifBu sistem için gerekli olan levhalarda ızgara, iki özel dalga boyu yansıtılır. hareketsizleştirilmiş reseptör ve ligand arasındaki bağlanma etkileşimi bir spektrum analiz cihazı 12, rezonans dalgaboyu kaymasını izleme gerçek zamanlı olarak izlenir. Ayrı rezonans tepeleri olay TE (geliş düzlemine dik elektrik vektörü) ve TM (insidans düzlemine normal manyetik vektör) potansiyel tespit doğruluğunu 11,14 artırabilir çoklu veri noktalarını sağlayan polarizasyon durumları için oluşur. Bu etiket özgür deney sisteminde antikor önceden duyarlı plakaları kullanarak, veri analizi ile tahlil çalışma süresi yaklaşık 45 dakikadır. Buna ek olarak, çok sayıda hasta numuneleri HPLC-MS / MS tabanlı format üzerinden, 96 veya 384 oyuklu formatta açık bir avantaj sorgulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Amerikan Kanser Derneği&#39;ne göre, 200.000&#39;den fazla kadın invaziv meme kanseri, her yıl teşhis edilecek ve yaklaşık 40.000 hastalıktan ölecektir. İnsan lökosit antijeni (HLA) klas I örnekleri hücresel proteinlerin proteozomal bozulması türeyen peptidleri ve sirkülasyon sitotoksik T lenfositleri (CTL) tarafından yapılan sorgulama için, hücre yüzeyi üzerinde, bu fragmanları sunulur. T-hücre reseptör Mimic nesil (TCRm) monoklonal antikorlar, meme kanseri kabul (mAb &#39;ler), spesifik peptit / HLA-A * 02: makrofaj göçü inhibe edici faktör (MIF 19-27) ve NY-esofago türetilenler gibi 01 kompleksler 1 157-165 etkili bir anti-tümör CTL yanıtının yokluğunda algılama ve meme kanseri hücrelerinin ortadan kaldırılması için. Bozulmamış sınıf I HLA / peptit kompleksleri meme kanseri hücreleri tarafından döken ve potansiyel olarak ilgili kanser biyobelirteçleri temsil edilir. Bu çalışmada, tanı kanser için bir atılım biyobelirteci eleme sistemindeT-hücresi reseptörünü güdümlü modu rezonans (GMR) sensör teknolojisini kullanan yeni, etiket-ücretsiz biyosensör ile kombine taklit monoklonal antikorlar içeren s sunulmuştur. Atkı aralığı MIF / HLA-A * 02 Algılama: MDA-MB-231 hücre süpernatantlan içinde 01 kompleksleri, insan serumu katıldı ve hastanın plazma gösterilmiştir. Bu çalışmanın etkisi hedeflenen imünoterapiler için arkadaşı hastalığı teşhis geliştirilmesi yoluyla kişiselleştirilmiş tıp devrim olabilir.

01 molekülü, 3: deney temsili bir grubu, HLA-A * 02 kapsamında iyi karakterize edilmiş TCRm, RL21A, özellikle bir peptidi tanıyan bir mürin IgG2a monoklonal antikorunu (MIF 19-27 veya FLSL) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. aynı kökenli peptid / HLA monomer olarak ilişkisiz HLA monomeri 15, açıklanan prosedür göstermek için kullanılmıştır. 3 deney formatını gösteren Şekil. RL21A diğer peptid / HLA 3 kompleksleri çok az çapraz reaktiviteye sahip FLSL / HLA monomer için özeldir. Bu özgüllük etiket ücretsiz biyoanaliz sistemi (Şekil 4) kullanılarak değinmeyecek. hareketsizleştirilmiş FLSL / HLA monomer (Şekil 5) üzerindeki RL21A antikor titrasyonu ile belirlendiği gibi, bu deney için etiket serbest biyo-analizi sistemi &#39;nin duyarlılığı düşük nanomolar aralığındadır. Arka sinyal, serum örneklerinde artmasına rağmen, sçivili insan serumunda FLSL / HLA monomer içindeki spesifik tespiti Şekil 6&#39;da elde edilir ve bir konsantrasyon gradyanı kolayca anlaşılacaktır, bu örneklerde yer almaktadır. Son olarak, MDA-MB-231 hücre hattı elde edilen süpernatanlar önce FLSL / HLA-A * 02 sunmak için gösterilmiştir: 01 molekülü, bu etiketin serbest deney platformu (Şekil 7) ile çözülebilir FLSL monomer ihtiva ettikleri gösterildi. FLSL / HLA monomerin sonraki ekleme RL21A üzerindeki sinyali (Şekil 7) artırır. Nedeniyle sistemin hassasiyeti, iyi Şekiller 4 ve 5 standart sapma bir fonksiyonu olarak görülen sıcaklık dalgalanmaları sonucunda oluşabilir negatif rezonans vardiya olmak üzere kuyu varyasyona. Bu varyasyonlar, oda sıcaklığının biraz fazla (örneğin, 28 ° C) bir sıcaklıkta, bütün numuneler ve biyolojik tayin, plaka okuyucusu ön kuluçkaya yatırılması ile önemli ölçüde azaltılabilir. Kısaca Şekil 8&#39;de, 96,eh polistiren plakalar ile kaplanmıştır [10 ug / ml] RL21A ve PBST ile yıkandı,% 0.5 düşük yağlı süt, ile bloke edildi ve seri seyreltileri ile oda sıcaklığında 2 saat süre ile inkübe edildi, PBST ile yıkandı, oda sıcaklığında 2 saat, için normal insan serumunda FLSL HLA monomerin bir standart eğri hazırlamak için PBS içinde 1:10 seyreltilmiş veya Hasta, plazma PBS içinde 1:10 seyreltilmiştir. sağlam HLA tespit etmek ve PBST içinde yıkandı: levha PBST ile yıkanmış, tavşan anti-insan β2 mikroglobulin [5000 1] ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya yatırılmıştır. Plakalar daha sonra, keçi anti-tavşan IgG [1: 10,000] ile 30 dakika inkübe edildi ve PBST ile yıkanmıştır. Kolorimetrik tespit ABTS (2,2&#39;-azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit] -diammonium tuzu), 15 dakikalık bir inkübasyon süresi boyunca yapılan alt-tabakanın ve bir mikro-plaka okuyucusu üzerinde 405 nm&#39;de gözlenmiştir kullanılarak gerçekleştirilmiştir. FLSL / HLA üç hasta numunelerinde saptanmıştır. Şekil 8B&#39;de, hastanın plazma RL.064 PBS içinde 1:20 oranında seyreltildi ve daha sonra ilave edildiplaka ed ve 60 dakika boyunca etiket içermeyen dedektör izlenir. Hasta serumunda FLSL / HLA kompleksinin spesifik tespiti gerçekleştirildi. Student t testi grafik ve istatistik yazılımı (p &lt;0.05) kullanılarak gerçekleştirildi. Şekil 8C, doku kesitleri fare, bir pozitif kontrol olarak, anti-HLA-A2 (BB7.2) RL21A, IgG2b ve IgG2a sırasıyla negatif kontroller ile 1 ug / ml&#39;de boyandı. Boyama, üreticinin talimatlanna göre nükleer boyama için bir anti-fare saptama kiti, DAB (diaminobenzadine) ve hematoksilin QS kullanılarak tespit edildi. RL21A de tümör lekelenmesi FLSL / HLA komplekslerinin tanıtımı teyit etmektedir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Sınıf I insan lökosit antijeni ile Tümör antijen Kanserli dönüşüm bir hücre içi bir hastalıktır. HLA örnek intracellular proteinler ve hücre yüzeyinde kansere bağlı değişiklikler ortaya. CTL ve TCRm hücrelerle farklı HLA peptid kompleksleri ile kanserli hücreleri tanımak mümkündür. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. İlk taban çizgisini gösteren veri toplama biyoanaliz tarayıcı yazılımı veri toplama Ekran Örnek FLSL / HLA kompleksinin 10 ug / ml ile kaplanmış bir plakaya RL21A antikor ilave edildi tarama. Antikorun konsantrasyonu olarak gösterilir. Her çizgi bir tek zaman içinde takip eder. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Şekil 3:. Tahlil plakası yakalama rel difraktif ızgara yüzeyinde hareketsiz antikorların Deneyi biçimi İllüstrasyontarafından, geçerli peptid / çözelti HLA komplekslerinin. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Şekil 4:. Ilişkisiz HLA monomer (YLEV, SLLV ve KVL) &#39;na göre, ilgili (FLSL) HLA monomer için biyotinile RL21A TCRm özgüllüğünün FLSL / HLA kompleksi gösterilmesi için RL21A spesifikliği. Biyotinile RL21A TCRm [10 ug / ml], avidin kaplı bir deney plakası yüzeyi üzerinde hareketsiz bırakılmıştır ve bulma PBS içinde etiketlenmemiş alakalı veya alakasız HLA monomer [10 ug / ml] kullanılarak gerçekleştirilmiştir. RL21A FLSL / HLA Kompleksi için özel oldu. İki yönlü ANOVA grafik ve istatistik yazılımı (p &lt;0.001) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Şekil 5:. Duyurma onun aynı kökten peptid / HLA kompleksine RL21A hassasiyetini Cilt İllüstrasyonlimit ve FLSL / HLA kompleksi RL21A hassasiyetini bağlayıcı. Biyotinile edilmiş, HLA Monomer FLSL [10 ug / ml] bir deney plakası yüzeyi üzerinde hareketsiz bırakılmıştır ve belirtildiği gibi etiketlenmemiş RL21A PBS içinde seri seyreltmeler plakaya ilave edildi. Bu sistem için algılama düşük nanomolar aralıkta idi. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Şekil 6:. İnsan serumunda HLA tespiti Çivili İnsan Serum Gösteri HLA Komplekslerinin tespiti. Biyotinile RL21A TCRm [10 ug / ml], avidin kaplı bir deney plakası yüzeyi üzerinde hareketsiz bırakılmıştır. Ilgili (FLSL) ya da ilgisiz (SLLV) HLA monomer ile tutturuldu Bir araya toplanan normal insan serumu, PBS içinde 1:20 seyreltilmiş ve daha sonra plakasına ilave edildi ve 60 dakika süre ile etiket içermeyen detektör üzerinde izlenmiştir. İnsan serumundaki FLSL / HLA kompleksinin spesifik tespiti gerçekleştirildi. Genel olarak, arka plan sinyali (ilgisiz SLLV monomer) yüksektirer, seyreltilmiş serum örnekleri PBS içinde saflandırıldı analitler (bakınız Şekil 4) ile karşılaştırıldığında. İki yönlü ANOVA grafik ve istatistik yazılımı (p &lt;0.0001) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Şekil 7:. Çözünür HLA komplekslerinin göğüs kanseri hücre kültürü süpernatanlarında saptanan göğüs kanseri hücre süpernatantlan içinde HLA tespit kabiliyeti gösterilmektedir. Biyotinile RL21A TCRm, RL9A TCRm (negatif kontrol) ve bir izotip kontrol deney plakası yüzeyi üzerinde immobilize edildi. Spiked [5 ug / ml] ve Bölünmemiş MDA-231 hücre kültürü süpernatantları ilave edilmiştir ve etiket içermeyen detektör üzerine 60 dakika süre ile bağlanma. FLSL ve SLLV HLA monomer örnekleri RL9A ve RL21A bağlanması için pozitif kontrol temsil çivili. Tek yönlü ANOVA grafik ve istatistik yazılımı (p &lt;0.0001) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Şekil 8:. Hasta numunelerinde FLSL / HLA komplekslerinin spesifik saptanması, (A) Immunosorbent Assay (ELISA), geleneksel bir enzim hasta plazmasında bir FLSL / HLA spesifik kompleksleri tespit etmek için kullanılmıştır. (B), Biyotinile RL21A TCRm veya IgG2a [10 ug / ml], avidin deney plakası üzerinde hareketsiz bırakılmıştır. Hasta RL.064 (C) Göğüs tümör dokusu önceden FLSL / HLA komplekslerinin tümör sunumunu doğrulamak için 3 anlatıldığı gibi lekeli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Bozulmamış sınıf I HLA / peptit kompleksleri potansiyel ilgili kanser biyobelirteç temsil, kanser hücreleri tarafından dökülür. Monoklonal antikorlar, atkı aralığı MIF / HLA-A saptanmasını taklit etiketi içermeyen sensör teknolojisi ve T-hücresi reseptörü kullanmak * 02: MDA-MB-231 hücre süpernatantlan içinde 01 kompleksleri, insan serumu katıldı ve hastanın plazma gelişmesine olanak gösterilmektedir Bir roman kanseri teşhis platformu.

Etiket-ücretsiz Biyosensör Teknolojisi kullanılması Meme Kanserinde İnsan Lökosit Antijen BİYOMARKÖRLERİN Algılama

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

detection-human-leukocyte-antigen-biomarkers-breast-cancer-utilizing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Görüntüleme.  Texas Tech University Health Sciences Center.  Bozulmamış sınıf I HLA / peptit kompleksleri potansiyel ilgili kanser biyobelirteç temsil, kanser hücreleri tarafından dökülür. Monoklonal antikorlar, atkı aralığı MIF / HLA-A saptanmasını taklit etiketi içermeyen sensör teknolojisi ve T-hücresi reseptörü kullanmak * 02: MDA-MB-231 hücre süpernatantlan içinde 01 kompleksleri, insan serumu katıldı ve hastanın plazma gelişmesine olanak gösterilmektedir Bir roman kanseri teşhis platformu. 

Video: Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Yanal-flow teknolojisi kullanılarak Hematolojik Malignite Hastalarda invaziv pulmoner aspergillozis Algılama

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Vericiyi biyolojik moleküler sürecinden kullanarak tespiti kapasitif Biyoalgılayıcı dayalı

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Bir Protein Mikroarray tahlil antijen spesifik antikor yanıt aşağıdaki Clostridium difficile enfeksiyon serolojik belirlenmesi için

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

Kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...