Bu yöntem insan sütü oligosakkaritüretimi ile ilgili birkaç anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. İlk olarak, ürünün ne kadarı var? Ve ikincisi, spesifik karbonhidrat bağlantısı nedir?
Burada amaç basitleştirmek ve bu insan sütü oligosakkaritler ölçme ve karakterize sürecini hızlandırmaktır. Bu yöntemin, geçerli son duruma göre iki avantajı vardır. İlk olarak, yüksek iş itimat taraması için uygun.
Yani, binlerce farklı durumu ya da belki de bir sentez enzimleri kütüphanesini bir günde bu tekniği kullanarak test ettiğinizi hayal edebilirsiniz. Ayrıca, doğanın enzimlerde evrimleştiği eşsiz substrat özgüllüğünü kullanır ve bize bu oligosakkaritlerin karbonhidrat bağlantısı hakkında bilgi verir. Bu yöntemin insan sütü oligosakkaritüretimini artırabileceğine inanıyoruz, bu da insan anne sütünü daha yakından taklit eden ve anne sütüyle beslenen ve formülle beslenen bebekler arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olan daha kaliteli bebek formülüne yol açabilir.
Maliyet, iş maliyeti ve ekipman kullanılabilirliğine bağlı olarak laktoz giderme için hangi yöntemin kullanılacağına karar verirken kullanıcı takdiri önerilir. En iyi laktoz giderilmesini sağlamaya özen dilmelidir. Deneyden bir gün önce, steril teknikler kullanarak taze bir bakteri kolonisinden kanamisin ve karbenicillin ile desteklenen 5 mililitre LB orta tohumu.
Tüm kültürleri bir gecede 37 derecede ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kanamisin ve karbenicillin ile taze LB M9 medya beş mililitre içine bir gecede kültür 50 mikrolitre aktarın. Kültür sıfır noktası beş ve sıfır noktası yedi arasında bir OD600 ulaştı kadar sürekli sallayarak 37 santigrat derece kuluçka.
İlk olarak, bir dakika için 12, 500 kez g bir nokta beş mililitre tüpler ve santrifüj içine gece kültürleri aktarın. Tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için 1x PBS'nin 500 mikrolitresinde eksnatantı atın ve peleti yeniden askıya alın. Tek hücreli süspansiyonu faks tüplerine aktarın.
GFP'yi heyecanlandırmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi FITC floresan düzeylerini toplamak için bir akış sitometresi kullanın. Bir kalibrasyon eğrisi yapmak için, litre başına sıfır ve 2500 miligram arasında aralıkta standart 2'FL sekiz ila 10 seyreltme yapmak. Kültür 2'FL biyo-algılama hücreleri ve metin protokolünde belirtildiği gibi standart seyreltme ile onları ikna.
LB medya beş mililitre bir 2'FL üreten bir kültür başlayın ve 37 santigrat derece bir gecede büyümek. Ertesi gün, hazırlanan minimal medya 250 mililitre% 1 alt kültür ve litre başına 10 gram son konsantrasyona gliserol ekleyin. Kültür ulaşana kadar 37 derecede kuluçkaya yat, oda600 ise sıfır noktası 5 ile sıfır noktası yedi arasında.
Sonra litre başına iki gram son konsantrasyoniçin sıfır noktası beş milimolar ve laktoz son konsantrasyona IPTG ekleyin. 24 saat boyunca sürekli sallayarak 37 santigrat derecede kuluçka. Ertesi gün, steril 50 mililitre tüpler ve santrifüj için 15 dakika boyunca 900 kez g gecede kültür aktarın.
Supernatant atın ve deiyonize suda pelet yeniden askıya. Herhangi bir artık laktoz kaldırmak için bu yıkama üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, deiyonize su beş mililitre pelet yeniden askıya.
Hücreleri buza yerleştirin ve hücre süspansiyonuna zar lamak için 30 saniyelik darbelerde %30 güçte bir sonicator kullanın. 25 dakika boyunca 2000 kez g lysed hücreleri santrifüj. Supernatant çıkarın ve steril bir filtre ile geçirin.
Filtrelenmiş supernatant'ı analiz etmeye hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. Sonra, 2'FL biyo-algılama hücrelerinin bir kültür aşılamak. Orta log aşamasında, kalibrasyon eğrisi yapmak için kullanılan bu 2'FL eşdeğer konsantrasyonlarda hücre lysate ile hücreleri indükler.
Metin protokolünde belirtildiği gibi kalibrasyon gerçekleştirin. Bundan sonra, bir akış sitometre üzerinde örnekleri çalıştırın. Floresan çıktısını oligosakkarit konsantrasyonuna karşı çizerek bir doz yanıt eğrisi oluşturun ve standartların hücre lysate'sine verdiği yanıtı karşılaştırın.
İlk olarak, fl alfalyzed beta galaktozidaz 1, 000 adet mililitre başına bir milimolar magnezyum klorür. Gerekli enzim optimum konsantrasyonu belirlemek için, 2'FL biyo-algılama hücrelerinin bir inoculum büyümek ve orta günlük aşamasında, laktoz ve 2'FL ile indüklemek. 100 mikrolitre lik kültürlere, 12 üniteye kadar değişken miktarda beta galaktosidaz ekleyin.
Kültürler sürekli sallayarak 37 santigrat derece bir gecede büyümeye izin verin. Metin protokolünde açıklandığı gibi floresan ölçün ve sinyalin istenilen zayıflamasını elde etmek için minimum enzim konsantrasyonunu belirleyerek gerekli enzimin optimum birimlerini hesaplayın. 2'FL üreten hücreler için 24 saat boyunca beta galaktosidaz optimum birimleri ekleyin ve 37 santigrat derece gecede inkübat, daha önce açıklandığı gibi 2'FL titre belirlemek.
İlk olarak, 2'FL üreten bir suş 25 mililitrelik bir kültür başlar. Suşun orta günlük evresinde indüklenmesinden sonra, kültürü 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın. Ardından, LB medyada bir E.coli BL21 kültürünü aşılatın.
37 santigrat derece orta günlük aşamasına büyümek sonra 24 saat 2'FL kültüre bu kültürün 15 mililitre ekleyin. 3saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi 2'FL titre belirleyin.
Başlamak için, 2'FL üreten bir suş 25 mililitrelik bir kültür başlar. Suşun orta günlük evresinde indüklenmesinden sonra, kültürü 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın. Kültüre %100 etanol iki cilt ekleyin ve iyice sallayın.
4 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra süspansiyonu 900 kez g'de 15 dakika santrifüj edin. Laktozu çökeltmek için supernatant ve inkübat gece boyunca dört santigrat derece toplamak.
Çökelmiş laktozu çıkarmak için çözeltiyi filtre kağıdından geçirin. Hücre lisatını içeren filtratı toplayın ve daha önce açıklandığı gibi 2'FL titresini belirleyin. Bu çalışmada fukozilen insan sütü oligosakkaritlerinin bağlantıya özgü tespiti için yüksek iş elde li bir strateji kullanılmıştır.
Bu genetik mühendislik E.Coli tarafından tüm hücre biyo-sensörleri inşa ederek gerçekleştirilir, belirli glikanlar ile indüksiyon üzerine, bir floresan sinyali ile yanıt. Bir akış sitometre üzerinde analiz olarak indüksiyon farklı koşullar altında floresan sinyal, vektör sadece kontrol veya 3'FL için biyo-sensör ile karşılaştırıldığında 2'FL biyo-sensör ile floresan 100 kat artış gösterir. Bu biyo-sensör yüksek bağlantı özgüllüğünü gösterir.
Talın hassasiyeti değişen karbonhidrat düzeyleri ile bir doz yanıt eğrisi oluşturarak belirlenebilir. 2'FL algılama dinamik doğrusal aralığı, litre başına 40 ve 400 miligram arasında olduğu görülmektedir ve algılama sınırı litre başına dört miligram. Bu titre, muhabir ifade dinamiklerinin anlık çekim ölçümlerinde görüldüğü gibi bir iş günü boyunca yapılabilir.
Biyo-algılama hücreleri tespit etmek ve sinyal okumak böylece sinyal doğrudan 2'FL konsantrasyonu karşılık gelecek şekilde eksojen laktoz sinyal azaltmak için stratejiler bir dizi kullanarak mühendislik 2'FL üretici suşu 2'FL ölçmek için kullanılabilir. Bir strateji enzimatik modifiye laktoz üzerinde hareket etmez bir beta galaktoziaz kullanarak laktoz düşürmek tir. Başka bir strateji de laktozu seçici olarak çökeltmekle kalmamış, aynı zamanda hücre lisisi akışaşağı doğru gerekli bir adım olduğu için üretici hücrelerini de etkileyen etanol kullanılmıştır.
Son olarak, en etkili ama zaman alıcı yöntem pelet ve hücre içi 2'FL serbest bırakmak için hücre lisis önce hücreleri yıkamaktır. Bu yöntemi oluşturduktan sonra, farklı enzimler kullanarak oligosakkarit hedeflerinin repertuarını genişletmeyi başardık. Şu anda, dokuz farklı oligosakkarit tespit edebilirsiniz ve daha fazla üzerinde çalışıyoruz.
Bu analizi optimize ederken, enzimlerimizin sağlamlığının, yaklaşık beş dakika içinde belirli bir bağlantı okuması sağlayan bir teknik üretmesini sağladığını fark ettik. Burada kullanılan reaktiflerin hiçbiri özellikle tehlikeli olmamasına rağmen, bu yöntemi kullananlar uygun PPE takmak da dahil olmak üzere standart biyolojik tehlike ve biyolojik koruma prosedürlerini izlemelidir.
