Protokol, anahtar morfolojik büyümeyi görselleştirmek için gelişimin farklı aşamalarında serebellar granül nöronları inceler. Tekniğin avantajları, hücreye özgü hedefleme, transfekte yapıların hızlı ekspresyonu ve hücre özerk etkilerinin incelenmesine izin veren hücrelerin seyrek etiketlenmesini içerir. Bir yükleme pipeti ucundan 11,2 milimetrelik bir segmenti keserek başlayın ve enjeksiyon derinliğini 1,5 milimetre ile sınırlamak için kesilen parçayı Hamilton şırıngasının ucuna ara parça olarak yerleştirin.
Ara parçayı şırınga ucuna yapıştırıcı veya parafilm ile sabitleyin. Deneysel yavrunun sagital beyin bölümlerinden tek elektroporated CGN'lerin morfolojisini incelemek için, konfokal mikroskopta yığın başına 0.5 mikrometrede Z-yığını görüntüleri alın. Kolay görüntü analizi ve 3D yeniden yapılandırma sağlamak için görüntü penceresi başına bir hücre görüntüleyin.
Basit nörit izleyici kullanarak nörit uzunluğunu ve dendritik pençe oluşumunu kör bir şekilde analiz edin. Elektroporated CGN'lerin tek kanallı Z-stack görüntülerini Fiji'ye yükleyin ve açılır menüden Eklentiler"Segmentasyon" ve Basit Nörit Tracer"Yeni 3D Görüntüleyici Oluştur'u seçin" e tıklayın. Soma hücresine bağlanan bir dendritin tabanına kaydırın ve kavşağa tıklayarak bir yol başlatın.
Hücre doldurma sinyalinin en parlak olduğu bölümleri tıklatıp izi korumak için Y tuşuna basarak yolu manuel olarak izleyin. Dendritin sonuna kadar izleyin ve F.Alternatif olarak, pençenin tabanına kadar izleyin. Daha sonra, pençeyi yapının tabanından en uzun nöritin sonuna kadar izleyin.
Pencerelerde Control tuşunu veya macOS'te ALT tuşunu basılı tutup yolu tıklayarak ikincil ve üçüncül dalları izleyin. F.İzlemelerin ölçümlerinin ayrı bir pencerede görünür olduğunu gözlemleyin tuşuna basarak yolu onaylayın. Her pençe için toplam uzunluğu elde etmek için pençe dallarının tüm boyutlarını toplayın.
Temsili analizde, enjeksiyondan 3 ila 14 gün sonra elektroporated CGN'lerin projeksiyon görüntüleri, dendrit sayısında ilerleyici bir düşüş göstermiştir. CGN'ler bir dendritik büyüme aşamasına tabi tutuldu, ardından 3 DPI'dan 7 DPI'ya rafine edildi ve bu da fazla dendritlerin% 50'sinden fazlasının budamasıyla sonuçlandı. Bu olay, her bir dendritin sonunda pençe benzeri yapıların oluşumunda kalan arborsların kademeli olarak uzaması ile çakışmaktadır ve bu gelişimsel süreçlerin eşzamanlı olarak gerçekleştiğini göstermektedir.
7 DPI ile, dendritlerin kabaca% 75'inde pençeler bulundu. Etiketli CGN'lerin her biri, toplam somato-dendritik yüzey alanını ve hacmini ölçmek için NMRS'de yeniden yapılandırıldı. CGN boyutunda gelişim boyunca anlamlı bir fark gözlenmedi.
7 DPI'da olmasına rağmen, CGN'ler 3, 5 ve 10 DPI'ya kıyasla hacimde% 20'lik önemli bir düşüş sergiledi. Prosedürdeki en önemli şey, enjeksiyondan önce beyinciği doğru bir şekilde bulmaktır. Yöntem, shRNA'ların, siRNA'ların veya Cre Rekombinaz'ın transfeksiyonu yoluyla granül nöron gelişimindeki rollerini incelemek için genleri in vivo olarak genetik olarak manipüle etmek için uyarlanabilir.
