Name: 3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

Biz yararlı tartışmalar için tüm Koshy laboratuar teşekkür ederim. Biz Patty Jansma ve tavsiye için Arizona Sinirbilim Anabilim Dalı Üniversitesi teşekkür ve görüntüleme yardım. Biz de onların Vibratome kullanımı için Porreca laboratuar teşekkür ederiz. Bu araştırma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH NS065116, AAK) tarafından desteklenmiştir.

Not: Fareler, Arizona Üniversitesi, yiyecek ve su ad libitum ile ışık / karanlık döngüsü ters yetiştirilen 12 saat olan bir sıcaklık ve nem kontrollü bir odada muhafaza edildi. Deneyler kurallar ve Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında gerçekleştirilmiştir. Tüm çabalar acı en aza indirmek için yapılmıştır. Kre-raportör fareler, C57BL / 6 arka 11 ve ticari olarak temin edilebilir. 1. Fare Enfeksiyon Not: - 12, aşağıda tarif edilen Toxoplasma gondii fare enfeksiyon gibi bir yöntem, daha önce 10 yayınlanan çalışmalarda kullanılmıştır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Fibroblastlar (dikey paketleme) insan alın derisi Toxoplasma suşları büyümek Dulbecco Yüksek Glikoz kültürlenmiş Kartal Ortamı (DMEM),% 10 FBS ile takviye edilmiş, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml strept% 5 CO2 inkübatör içinde, bir T-25 balonuna omycin, ve 2 mM L-glutamin (cDMEM) parazitler, büyük parasitophorus vacuoles gelişimine dek. </li><li> Daha sonra, bir 27 gog iğne bağlanan bir 5 mi şırınga halinde bütün olarak solüsyon bir şişe içinde 2 kez şişenin tabanından hücreler kazıma ve 3 mi bir şırıngaya bağlanmış bir 25 gauge iğne yoluyla elde edilen solüsyon geçirilerek şırınga tahliye parazitler bu ters 15 ml konik bir tüp içinde yerleştirilmiştir. Şırıngaya pistonu bağlayın ve konik tüp içine parazit çözümü geçmektedir. </li><li> Santrifüj 300 x g, 10 dakika boyunca tüpü. Yüzer madde daha sonra 4-6 ml steril USP 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS), pH 7.4 (stok çözelti) pelet tekrar süspansiyon aspire. </li><li> Parazitler orta büyük karenin dört köşe ve orta kareler parazitlerin sayısını daha sonra yerleşmek saymak için stok solüsyonu 10 ul Hemasitometre yükleyin, 5-10 dakika bekleyin. </li><li> Paragraf seyreltin100K / 200 ul, uygun inokulum boyutuna the PBS daha sonra 200 ul toplam hacim periton içine (ip) enjekte fareler 1x. NOT: Bu prosedür için, fareler 100 K Tip III (CEP) PBS 1x 200 ul 13 takizoit aşılanmıştır. Toksoplazma diğer suşları ile fareler enfekte olduğunda, inokulum konsantrasyonunun hastalık oluşturma etkisi hesaba ayarlanması gerekebilir. </li></ol> 2. Perfüzyon ve Beyin Hasat Not: Bu kistlerin tepe numaraları fare beyninde bulunan olduğu zaman noktasını temsil eder Bu protokol, 21 gün sonra enfeksiyonu (dpi) yapıldı, ancak diğer zaman noktaları kullanılabilir. 17 - kist boyutu, sayısı, yeri ve varlığı ya da yokluğu fare zorlanma, parazit gerilme türü yanı sıra aşı miktarı 7,14 dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Müfettişler tek tek fare ve Toxoplas için uygun inokülumu belirlemek gerekirma suşu o / o kullanır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Kur tüm cerrahi hasat aletleri (Şekil 1). </li><li> Her bir fare için, hazırlama ve buz üzerinde tutulur:% 0.9 sodyum klorid (NaCl) ile doldurulmuş 20 ml şırınga + 10 U / ml Heparin 1x steril USP PBS (Heparin / tuzlu su) içinde; 20 ml&#39;lik bir enjektör% 4 paraformaldehit (PFA) ile doldurulmuştur; 15 mi% 4 PFA ile sintilasyon şişesi. Birden fareleri için, daha sonra her bir perfüzyon için solüsyonu ile dolu yeni bir şırınga hazırlamak her fare için gerekli olan her bir çözeltinin toplam miktarı ile dolu bir beher hazırlar. </li><li> 200 ul / Ketamin / Ksilazin kokteyli vücut ağırlığı 25 g (24 mg / ml ve 4.8 mg / ml) ilgi günde fare ip anestezisi. Ayak tutam refleksi kontrol ederek anestezi düzeyi için fare izleyin. Fare bir firma ayak tutam hiçbir yanıt gösterir sadece bir kez protokol ile devam edin. Not: anestezi uygun seviyede ulaşılırsa Anestezi başka yöntemler sürece kullanılabilecektirprotokol ile devam. </li><li> Kapalı köpük platformda yatar pozisyonda fare yerleştirin. Sonra% 70 Etanol (EtOH) (Şekil 2A) ile göğüs ve karın sprey ayaklarına dört uzuvları dışarı Pin. Fare altında birkaç steril kağıt havlu eklenmesi perfüzyon sıvı taşma edilmesine yardımcı olmak için kullanılabilir. </li><li> Sadece forseps ile sternum altında kaldırın ardından cilde bir kesi yapmak için makas kullanın. Göğüs (Şekil 2B) ortaya çıkarmak için geri cilt çekin. </li><li> Süreci kılıç şeklinde kaldırın ve açık açık uzakta diyaframdan disseke edilir karaciğer açığa hemen diyaframın altında bir karın kesi yapmak. İki insizyon, solda diğeri diyafram aracılığıyla sağ ve kaburga altındaki birini yapın. Yaklaşık 1 / 2-2 / 3 yollu kadar sonra göğüs boşluğuna (Şekil 2C) açmak için geri yansır göğüs kafesi, sol ve sağ kesiler uzatın. NOT: Take bakım herhangi bir organ kesmek için değil ya da büyük kan damarları duperfüzyon kalitesini tehlikeye sokacaktır Bunu yaparken bu işlemi halka. </li><li> 10-20 ml% 4 PFA ve ardından 10-20 ml Heparin / tuzlu su ile transkardiyal serpmek. NOT: perfüzyon düzgün yapılırsa, karaciğer (Şekil 2D) tan kırmızı dönüşecektir. Eğer düzgün yapılmazsa, kan damarları görünür (Şekil 2E) olacaktır. </li><li> Onun karın üzerine fareyi çevirin, yeniden-pin ayakları daha sonra% 70 EtOH ile baş ve boyun sprey. Boyun tabanından cilt kaldırın ve bir kesi yapmak. Kafatası (Şekil 2F) açığa cilt çıkarın. Omuz seviyesinde baş başını kesmek. Yavaşça beyin kaldırmak, kafatası çıkarın ve% 4 PFA (Şekil 2G-lH) ile dolu bir sintilasyon şişesine içine yerleştirin. NOT: iyi perfüze Eğer, beyin görünür kan damarları (Şekil 2I) beyaz görünecektir. Beyin iyi perfüze değilse, kan damarları görünür (Şekil 2J) olacaktır. </li><li> Kıvılcımını yerleştirin4 ° C &#39;de% 4 PFA beyin yon şişe gece boyunca ışıktan sahiptir. Soğutulmuş 1X PBS ile donatılmış bir sintilasyon şişesine olmayan USP 1 x PBS&#39;de beyin ve transfer yıkayın. Işıktan kapalı 4 ° C &#39;de 1 x PBS&#39;de beyin, saklayın. NOT: Başarılı takas ve görüntüleme kadar bir ay süreyle 1x PBS içinde saklanan bölümler ile gerçekleştirilebilir, ancak PFA fiksasyon ters olacak ve PBS uzun süreli depolama gibi birkaç gün içinde beyin optimal görüntülerin daha az yol açabilecek bu bölümünde en iyi olduğunu olmuştur . Otofloresans ve artan bulanıklık bir ay veya daha uzun süre 1x PBS depolamadan sonra görüntülenmiş bazı bölümlerde not edilmiştir. </li></ol> 3. Beyin Kesit <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1x PBS beyni çıkarın ve daha hassas sağlamak için bir beyin matrisi (Şekil 3A) içine yerleştirin ve hatta beynin içinden keser. Varsa, beyincik ve koku ampuller keserek, ve daha sonra 2 veya 3 bölüme koronal beyin kesti. <br /&gt; Not: Kırpma ve beyin kesme bir beyin matris yardımı olmadan yapılabilir. Vibratome kesme mesafesi bağlıdır koronal kesme bölümlerinin sayısı kullanılır. sagital ve koronal bölümleri en sık nöroanatomik tanımlama için kullanılır ama beyin, herhangi bir yönde kesitli olabilir. </li><li> Siyanoakrilat ile bir örnek montaj blok üzerine her beyin bölümü yapıştırın. Destek için beyin bölümünde (Şekil 3B) arkasında% 5 agaroz jel küçük bir blok yapıştırmayın. NOT: Diğer destek mekanizmaları kullanılabilir, ancak destek olmadan, Vibratome düzensiz kesitlerinin neden beyne itebilir. </li><li> Vibratome kalın bölümler 4 hızı ve 9 genliği ayarlanmış 160 mikron (görüntüleme için kullanılan objektif çalışma mesafesi) içine doku kesin. Not: hız ve genliği ayarlar özellikle makineye bağlı olarak ayarlanabilir, daha yumuşak bölümleri elde etmek için kullanılır. Ayarları iseDoğru değil, sonuç düzensiz bölümleri, doku ya da sohbet işaretleri yırtılma olabilir. </li><li> Onlar bir hafta içinde temizlenmiş olacak eğer 1x PBS soğutulmuş taze dolu bir parıldama şişesine, içine doku bölümleri toplayın. Bölümler bir hafta içinde temizlenmiş olacak değilseniz, -20 ° C&#39;de karyo-koruyucu solüsyon ve mağaza ile dolu 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yer bölümleri. </li></ol> Beyin Doku Bölüm 4. Optik Takas NOT: Bu protokol daha önce yayımlanmış bir yönteme 8 modifiye edilmiştir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1x PBS +% 2 Tween-20 (Gl / PBST),% 25,% 50,% 75 ve% 90 hacim / hacim Gliserol hazırlayın. </li><li> Karyo-koruyucu olarak ise, 1 x PBS içerisinde çalkala ve% 25 Gl / PBST 10 ml su ihtiva eden bir parıltı şişesine transfer 1x PBS bölümleri çıkarmak ya da. 12 saat süre ile, maruz ışığa kapalı 4 ° C sıcaklıkta bir çalkalayıcı üzerinde yer tüpe konulmuştur. </li><li> Tüm bölümler bo battı olduğunu onaylayınŞişenin ttom. Kesitler daha sonra 12 saat süre ile, ışığa maruz kalma ile ilgili kapalı, 4 ° C&#39;de bir çalkalayıcı üzerinde 10 ml% 50 Gl / PBST ile şişe ve yerini doldurmak karşılamak için yeterli bırakarak,% 25 Gl / PBST aspire. % 75 Gl / PBST sonra% 90 Gl / PBST için bu işlemi tekrarlayın. Maksimal takas ulaşmak için 24 saat boyunca% 90 Gl / PBST bölümleri bırakın. Takas işleminin boyunca, kademeli optik takas (Şekil 4) gözlemlemek. NOT: çözüm bölümleri şişenin dibine battı hemen sonra değişti, bu süreç hızlandırılmış olabilir. % 75 ve% 90 çözümlerinde, bölümler şişenin dibine tüm yol lavabo olmaz ama ortada yüzer. </li></ol> 5. Montaj Beyin Doku Bölümler <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bir ara parçası oluşturmak için 5 parçaya bir numaralı 1.5 lamel kesin. Şekil 5A gösterilen kesikli çizgiler boyunca lamel puan ve kırmak için bir cetvel ve elmas uçlu kalem kullanın. Sil to bir pencere oluşturmak için düz cam slayt 4 dış parçaları düzenlemek, parça merkezi, ve sonra doğru konfigürasyonda (Şekil 5B) slayt için aralama parçaları yapıştırmak için dikişleri üzerine şeffaf tırnak cilası fırça. NOT: boşluk slayt ve temizlenmiş bölümleri montajı için lamel arasında gerekli alan oluşturmak için kullanılır. lamel gerekli herhangi bir boyut penceresi oluşturmak için farklı şekillerde kesilebilir. Önceden kesilmiş köpük ara parçaları da ticari olarak temin edilebilir. Oje tamamen kuruması için, en az bir gün önce montaj bölümlere ayırıcılar ile slaytlar yapmak en iyisidir. </li><li> Ucu ile plastik bir transfer pipeti kullanarak bir slayt aktarın bölümleri kesti. % 90 Gl / PBST ile çevredeki doldurmak için emin olun. Dikkatle emin herhangi bir kabarcıkları tanıtmak için değil yapım bölümler üzerinde bir lamel düşük. Aşırı Gl / PBST bir tüy bırakmayan silin uzakta wicked olabilir. </li><li> Görüntü GFP + RFP içeren nöronlar + <em&gt; Konfokal mikroskop hemen (Şekil 7A-B) Daha sonra mağaza slaytlar düz ve 4 ° C&#39;de ışıktan kaplı ile Toxoplasma gondii kistler. NOT: Alternatif, mühür tamamen çevresindeki tüm kenarları saklamak ve daha sonra görüntülü slaytlar. Slayt mühür net oje kullanımı isteğe bağlıdır ve bir daha fazla işlem için daha sonraki bir tarihte slayt bölümleri kaldırmak olsaydı daha zor lamel kaldırmak için yapabilir. </li></ol> 6. Görüntüleme NOT: Herhangi bir mikroskop yüksek çözünürlüklü z yığınları elde yeteneğine sahip olduğu kullanılabilir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Başlangıçta 10X de odak düzlemi bulduktan sonra, bir 20X objektif değiştirmek ve bir GFP + hücre içinde bulunan bir kist tespit etmek bölümü üzerinden tarama. Görüş alanında ilgi (ROI) bölgesi Merkezlenmesi. </li><li> 40X objektif değiştirin. Emin olmak için tüm ROI ile yukarı ve aşağı odaklanın tüm hücre ve cySt görebilir. NOT: Görüntüler 40X / 1.30 Yağ DIC M27 amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. </li><li> Yüklü görüntüleme yazılımı kullanarak, kist ile tüm hücreyi içeren bir z-yığını edinin. Görüntüler elde etmek için kullanılan ortalama ayar, Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. NOT: Ayarlar her araştırmacılar doku kesitlerinde ve mikroskop özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. </li><li> 64 projeksiyonlar sayısını ayarlayarak tam dönme görünüm elde 1. projeksiyonlar sayısını ayarlayarak z-yığını maksimum projeksiyon görüntü elde. NOT: Diğer yazılım paketleri mevcuttur ve maksimum projeksiyon elde etmek için kullanılabilir, dönme gibi z-yığın görüntüleri diğer görünümler. </li><li> Görüntü analiz yazılımı ile görüntüyü analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats.">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice.">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li><li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii:+a+histological,+immunocytochemical+and+ultrastructural+study.">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li><li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain:+A+Confocal+Study.">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li><li>Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices.">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions.">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li><li>Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites.">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li><li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host.">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li><li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice.">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Enfekte konak hücrelerde hücresel değişiklikler gibi HIV, kuduz, ve Chlamydia 18,19 gibi diğer hücre içi organizmalar ile enfeksiyonlarda hastalık sonuçları ile bağlantılı olduğunu göz önüne alındığında, bize MSS arasında meydana samimi etkileşimleri çalışmak için izin verecek bir teknik geliştirdi hücre ve Toxoplasma ev sahipliği. Burada anlatılan yöntem kronik olarak enfekte nöronların verimli görüntüleme sağlayarak bu hedefe gerçekleştirir. Bu yöntemin geli...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Bu yöntemin genel amacı yüksek çözünürlük, zorunlu hücre içi parazit Toxoplasma gondii ile enfekte olan bireysel nöronlar üç boyutlu görüntüler elde etmektir. Toksoplazma sık sık insanları ve kemirgenler içeren geniş ara konak aralığı, en başarılı parazitlerin biri olarak kabul edilir. Insanlarda ve kemirgenler hem de, kontamine yiyecek veya su tüketilmesi yoluyla akut enfeksiyondan sonra, Toxoplasma formunu yavaş-kopyalayan onun hızlı kopyalayan formu (tachyzoite) dönüştürme ve encysting ile MSS kalıcı enfeksiyona neden yapabiliyor (bradyzoite ). Bağışıklığa sahip bireylerde bu gizli merkezi sinir sistemi enfeksiyonu nispeten asemptomatik olduğu düşünülmektedir, ancak, AİDS hastalarında ya da transplant alıcıları gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde, parazitin açılma ölümcül Toksoplazma ensefalit 1,2 yol açabilir. Buna ek olarak, son çalışmalar hamekanizma bilinmemektedir olsa Toksoplazma latent infeksiyon, kemirgenler 3,4 davranışsal değişikliklere yol açabilir göstermiştir ettik. Şaşırtıcı, CNS- Toxoplasma etkileşimin önemini vurgulayarak, bu verilere rağmen, nispeten daha az, özellikle hücresel ve moleküler düzeyde, bu ilişki hakkında bilinmektedir. Beyin-parazit etkileşimi bile basit yönlerini incelemek için yeteneği teknolojik sınırlamalar kısmen engel olmuştur. Örneğin, işin çoğunluğu nöronlar kistler elektron mikroskobu (EM) 5,6 ile yapılmıştır devam ettiği hücrelerin olduğunu gösteren. EM yüksek çözünürlük verir rağmen, zaman alıcı, emek yoğun ve pahalı. İmmünofloresan (IF) tahlilleri son zamanlarda EM 7 tarafından yapılan işi onaylamak için konfokal mikroskobu ile birlikte kullanılmıştır. Deneyleri gerçekleştirmek için teknik olarak kolay ve nispeten ucuz, ama under bu teknikleri kullanarak IFtand kist ve enfekte nöron arasındaki mekansal ilişki süresi, teknik olarak zor alıcı ve değerli bilgiler kaybına yol açabilir seri rekonstrüksiyon gerektirir. Böylece, biz MSS toksoplazma fare modeli ile kullanılan ve EM veya immünohistokimyasal (İHK) olmadan görüntü enfekte nöronların tamamını bize izin verir edilebilir bir yöntem geliştirdik. Böyle bir teknik geliştirerek, biz nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde enfekte hücre ve kist arasındaki ilişkiyi keşfetmeye hücresel başlayabilirsiniz. Geliştirdiğimiz yöntem parazit proteinleri 9,10 ile enjekte edilmiş in vivo hücrelerinde işaretleri bir sistem ile konfokal mikroskopi 8 ile optik takas ve görüntüleme kalın beyin bölümleri için yeni teknikler birleştirir. Bu sistemde, Toksoplazma rekombinasyonu 11 Kre-aracılı sonra yeşil floresan protein (GFP) ifade Cre raportör fareleri enfekte </em&gt; Kırmızı floresan proteini (RFP) ifade konak hücrelere 9 içine Cre recombinase enjekte suşları. Bu kombinasyon MSS enfeksiyonu kurulduktan sonra, enfekte fare beyin hasat kalın beyin bölümleri kesip, hızla RFP + kistleri bularak görüntüye uygun alanları belirlemek için bize izin verir. Bu GFP konakçı hücre GFP + hücrelerinin sayısı parazitleri 10 içermez, enfeksiyon parazitlerin Cre enjeksiyon yalnızca bağlıdır olup olarak dikkat etmek önemlidir. Bu protokolün amacı görüntü tüm enfekte nöronlar edebilmek için olduğu gibi, odak sadece GFP + ayrıca bir RFP + kist ihtiva nöronlar üzerinde, ancak protokol de görüntü GFP + / RFP kullanılabilir - nöronlar. Enfekte beyin hasat ve bölümlere sonra, bölümler gliserol takas yoluyla şeffaf hale getirilir. Bölümlerin uygun bölgeler daha sonra konfokal mikroskopi, arkadaşları ile görüntülüenfekte olmuş bir ev sahibi hücreleri ve bunların bir bütün olarak, keseli parazitlerin belirtilenlerin benzeri görüntüleme. Burada bir tanımlama için tam protokol, optik takas ve görüntüleme enfekte nöronlar sağlamak.

<table><tbody><tr><td>Vibratome Series 1000 Sectioning System</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>Other vibratomes are compatible</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;reg; Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&amp;reg; Injection Xylazine 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>7906</td><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Surgical equipment</td><td></td><td></td><td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td><td></td><td></td><td>These are primary cells from human foreskins.&amp;nbsp; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Canted neck flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Disposable Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>This product is purchased from an in-house stockroom.&amp;nbsp; Other companies are compatible.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td></td><td></td><td>Other brands are compatible</td></tr><tr><td>10 ml Syringe with Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Other syringes are compatible</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>25 G x 12&quot; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>Other brands are compatible</td></tr></tbody></table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii, insanlarda ve kemirgenler dahil olmak üzere, geniş bir konak yelpazesi ile bir obligat hücre içi parazit. Hem insanlarda hem de kemirgenler ise, Toxoplasma beyinde bir ömür boyu kalıcı enfeksiyon oluşturur. Bu beyin enfeksiyonu gelişmekte olan fetus ya da beyinde kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AİDS) hasta için bu tercihte ve sebat gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde, çoğu immün sistemi kişilerde asemptomatik iken yıkıcı nörolojik hastalığa yol açabilir. Böylece,-beyin-Toxoplasma etkileşim Toksoplazma tarafından üretilen semptomatik hastalığı kritik, henüz biz merkezi sinir sistemi (MSS) ve parazit hücreleri arasındaki hücresel veya moleküler etkileşim az bir anlayışa sahip olduğu açıktır. CNS fare modelinde bu nöronlar parazit devam ettiği hücreler 30 yıldır bilinmektedir toksoplazmozis, ama çok az bilgi hangi kullanılabilirnöronun parçası genellikle (soma, dendrit, akson) bulaşmış ve bu hücresel ilişki suşları arasında değişir eğer. Bölümünde, bu eksikliği görüntüleme zorluk sekonder ve bir hayvandan bütün enfekte nöronlar görselleştirme olduğunu. Bu tür görüntüler tipik seri kesitlerinin ve elektron mikroskobu veya immün sonra konfokal mikroskobu ile görüntülü doku dikiş gerektirir. Çeşitli teknikler birleştirerek, burada açıklanan yöntem immün gerek kalmadan üç boyutlu görselleştirme ve bireysel, kronik olarak enfekte nöronların analizini sağlayan, tespit ve kistler içeren görüntü tüm hücreleri kalın bölümlerin kullanımını (160 mikron) sağlayan, elektron mikroskobu veya seri kesit ve dikiş. Bu tekniği kullanarak, parazit ve enfekte nöron arasındaki hücresel ilişkiyi anlamak başlayabilirsiniz.

Şekil 7, A ve B, bu yeni olduğu kist içeren iki farklı 160 mikron kalınlığında kesitler aynı zamanda Şekil 7B&#39;de kist-hücre vücut mesafenin bir temsili ölçüm. Şekil gelen GFP + nöronlar göstermektedir Şekil 7, iki temsili görüntüleri içerir Protokol, bir bütün olarak enfekte nöron olarak gösterebilir. Şekil 7C, bu görüntüleme tekniği ile birlikte, kist ve hücre gövdesi (I...

Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Bu protokolü kullanarak, biz görselleştirme ve encysting parazitin enfekte nöron arasındaki mekansal ilişkinin analizini sağlayan parazit Toxoplasma gondii ile enfekte farelerde görüntü 160 mikron kalınlığında beyin bölümlerine başardık.

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte<em&gt; İn Vivo</em&gt; Ile<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K Görüntüleme.  University of Arizona.  Bu protokolü kullanarak, biz görselleştirme ve encysting parazitin enfekte nöron arasındaki mekansal ilişkinin analizini sağlayan parazit Toxoplasma gondii ile enfekte farelerde görüntü 160 mikron kalınlığında beyin bölümlerine başardık. 

Video: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Nörobilim

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

Bir Nöro-İnvazif encephalitic Virüs Vivo Görüntüleme Sistemleri (IVIS) Algılama

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

Protozoa Parazit Enfeksiyonunda Primer Astrosit ve Mikroglianın Eşlik Etmesinin İzole Edilmesi

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is an obligate intracellular parasite with a diverse biology that infects several mammalian species, including humans, causing cardiac and digestive pathologies. Reliable detection of T. cruzi in vivo infections has long been needed to understand Chagas disease&#39;s complex biology and accurately evaluate the outcome of treatment regimens. The current protocol demonstrates an integrated pipeline for automated quantification of T. cruzi-infected cells in 3D-reconstructed, cleared organs. Light-sheet fluorescent microscopy allows for accurately visualizing and quantifying of actively proliferating and dormant T. cruzi parasites and immune effector cells in whole organs or tissues. Also, the CUBIC-HistoVision pipeline to obtain uniform labeling of cleared organs with antibodies and nuclear stains was successfully adopted. Tissue clearing coupled with 3D immunostaining provides an unbiased approach to comprehensively evaluate drug treatment protocols, improve the understanding of the cellular organization of T. cruzi-infected tissues, and is expected to advance discoveries related to anti-T. cruzi immune responses, tissue damage, and repair in Chagas disease.

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

The present protocol describes light-sheet fluorescent microscopy and automated software-assisted methods to visualize and precisely quantify proliferating and dormant Trypanosoma cruzi parasites and T cells in intact, cleared organs and tissues. These techniques provide a reliable way to evaluate treatment outcomes and offer new insights into parasite-host interactions.

Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Floresan Reporter miktar tayini ile tüm organ patojen takibi

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Yazar Spotlight: Dokularda Antibiyotiklere ve Bağışıklık Sistemine Bakteriyel Tepkilerin Çözülmesi

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo Görüntüleme

Bir Nöro-İnvazif encephalitic Virüs Vivo Görüntüleme Sistemleri (IVIS) Algılama

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Protozoa Parazit Enfeksiyonunda Primer Astrosit ve Mikroglianın Eşlik Etmesinin İzole Edilmesi

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi