Biz davranış testinin optimizasyonu yardım için Sean Pelkowski teşekkür ederim. Bu çalışma Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Ulusal Enstitüsü, R01 HD060647 ve Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü, F32 ES021342 ve R03 ES017755 tarafından desteklenmiştir.

1. Zebra balığı Embriyolar toplanması ve Larva Raising <ol><li> &quot;Sahte&quot; çim (yeşil iplikten yapılmış) (Şekil 1) ile cam Pyrex yemekleri Zebra balığı embriyolarının toplamak için şafakta tankları içine yerleştirilir ve iki saat bırakılmalıdır. Embriyoları içeren cam yemekleri bir el süzgeç üzerine dökülür ve deiyonize su ile durulanmalıdır. Embriyolar daha sonra yumurta suda yetiştirilmelidir. Yumurta su iyonu giderilmiş su ve 0.25 mg / küf önleyici olarak kullanılır metilen mavisi, L Anında Okyanus, 60 mg / l içerir. </li><li> Da, bireysel deneye olduğu hipotezini bağlı olarak, embriyolar hemen veya toksik maddelerin ya da eczacılık ile geliştirme belirli aşamalarında tedavi edilebilir. Toksik ve eczacılık genelde DMSO&#39;da çözündürülür (bir 1000 X konsantrasyonda) ve daha fazla yumurta su ortamı içinde doğrudan seyreltilmelidir. </li><li> Ilaç veya zehirli madde ile embriyonik ve larva tedavisi sırasındas, larva ve embriyolar 7 dpf (yumurta su çözeltisi iki günde en az bir bakteri / mantar üremesini önlemek için değiştirilmesi gerekir da davranışsal analiz sonu 50, ml başına yaklaşık 50-60 larva yoğunluğunda derin bir petri levhalar içinde muhafaza edilebilir ölü embriyolardan). </li></ol> 2. Davranış Analizleri için kalıplar hazırlanıyor <ol><li> Özel x 7,6 cm x 5 mm içi-özel inşa edilmiş 11.7 cm boyutlarında plastik kalıpları geliştirdi. Kalıplar Thermo Scientific gelen tek iyi plastik tabak içine dökülür agaroz kullanarak şerit oluşturmak için gereklidir. Tek iyi plakaları ölçü 12,4 cm x 8,1 cm x 1,2 cm. </li><li> Kalıp kenarlarına 60 ° açılı olduğu beş şerit içerir. Kalıplara şerit alt genişlik 14 mm iken, en geniş olan en az 18 mm&#39;lik bir baz ile yüksek bir 3.5 mm &#39;dir. Kalıp şerit (Şekil 2) arasında 4 mm boşluk vardır. </li><li> Şerit erimiş agaroz 50 ml (Deiyonize yılında% 0.8 agaroz dökün hazırlamak içinTek plaka 60 mg / L Anında Okyanusu) ile d su. Kalıp daha sonra herhangi bir kabarcık oluşumunu ortadan kaldırmak için sıvı agaroz üzerinde çok yavaş bir şekilde yerleştirilmesi gerekir ve (yaklaşık 45 dakika sürer) agaroz soğuduğunda kaldırılabilir. </li><li> Davranışsal deney (kurumasını agaroz önlemek için) şerit yaklaşık 36 saat için yemekleri kapaklı oda sıcaklığında saklanabilir çalıştırmak için önce agaroz şeritleri en erken bir daha gün yapılmalıdır. Agaroz şerit sadece bir deney için kullanılmalıdır ve atılmalıdır. </li></ol> 3. Görüntü Yakalama <ol><li> En fazla 20 larva plakaların her şerit yerleştirilebilir. Hat başına tipik olarak 5 larva yüzmek hızı en doğru izleme kolaylaştırmak ve deney başına gereken larvaların sayısını azaltmak için kullanılır. Şeritli yumurta su ile veya deneme bağlı olarak ilaç veya toksik maddeler olmadan doldurulabilir. Bununla birlikte, şerit f olmamalıdıronlar görüntüleme dolaplar yerleştirilir kadar tüm yol kadar illed, bu taşma engeller. Onlar agaroz kalıpları yerleştirilir ve dizüstü bilgisayar ekranın üst kısmında konumlandırılmış sonra tutarlılık için, larva on dakika bir iklimlendirme dönemi olmalıdır. Verimli Petri kabı agaroz şeride larva hareket larva stresi azaltmaya yardımcı olacaktır. Larvaları sığ tanklarda veya Petri kapları yerleştirilmiştir, bu en kolay yoldur. </li><li> Görüntüleme dolapları zaman atlamalı fotoğraf ve bir dizüstü bilgisayar için kullanılan bir Canon dijital kamera yer alıyor. Kamera kabinin üst kısmında yer ve 15.6 inç ekranlı dizüstü bilgisayar ekranı (Şekil 3) yukarı bakacak şekilde yerleştirilmelidir kabinin altına doğru hedeflenmelidir. Dört plakaları doğrudan dizüstü bilgisayar ekranın üst kısmında elle yerleştirilmelidir. Bu (l kenarlarında gölgeler ortadan kaldırmak için sokağın üst seviyede olacak şekilde şu anda şerit yumurta su veya kimyasal tedavi ile kapalı tepesinde olabilirgörüntüler anestezi). </li><li> Bir PowerPoint sunumu larvaları için caydırıcı bir uyarıcı olarak kullanılır. Geçmiş hareketli kırmızı top 6 ya da 12 çok iyi plakaları 15,17,18 larva balığı gösterilmiştir. Mevcut PowerPoint plakanın üst yarısının (Şekil 4) üzerinde hareket eden kırmızı renkli çubuk 15 dakika, ardından 15 dakika boyunca boş bir beyaz arka plan ile başlar. Larva aşırı ısınma ortadan kaldırmak için, bu 28 üzerinde gitmez bir ekran ° C ile bir dizüstü bilgisayar satın almak en iyisidir Agaroz şerit içinde sıvının buharlaşmasıyla önlemek için, maksimal görüntüleme zamanı bir saat altında tutulmalıdır. </li><li> Dijital fotoğraf makinesi Deneme başına 300 görüntü olmak üzere toplam resim her 6 saniye alarak, zaman atlamalı fotoğraf için programlanmalıdır. Ancak, frekans ve uzunluk ve davranışsal deney miktar bağlı olarak ayarlanabilir. Geçmişte uzun görüntüleme zamanlarda her resim arasında uzun aralıklarla kullanarak istihdam edilmiştir. CamerBir video hızı (saniyede 30 kare) de görüntüleme için daha düşük bir çözünürlükte ayarlanabilir. Düşük çözünürlüklü tek bir multiwell plaka için kayıtları sınırlar ise, video kayıtları görüntüleme hızlı yüzme olaylar 15 için uygundur. </li></ol> 4. Görüntü Analizi <ol><li> Görüntüler ImageJ ile açıldı ve özellikle de içi yazılmış bir makro ile birlikte kullanılmalıdır. Makro otomatik olarak, kırmızı renk çıkarılabilir, böylece renk kanalları böler arka çıkarma, bir eşik uygular ve partikül analizi ile larvaları tanımlar. Beş şeritli larva analiz için en güncel makro Zebrafish_macro25k olduğunu. Görüntü sayısı, çıkarılabilir renk, görüntü eşiği, vb ayarlamak için makroda ister kullanın </li><li> Tüm görüntüleri ImageJ makro ile çalıştırmak sonra, bir sonuç dosyası görüntülenir ve x içerecek, y görüntü numarası ve şerit numarası ile birlikte her resim için tek tek larvaların koordine eder. </li&gt; <li> Sonuçlar dosya bir Excel biçiminde kaydedilir ve daha sonra boş bir arka plan vs hareketli bar arka plan ve kuyu sayısı dayalı tasnif edilmelidir. Excel şablonu otomatik olarak kuyularda larvaların yerleşimini belirler inşa denklemler, larva arasındaki mesafe, hareket hızı ve dinlenme miktarda olduğu kullanılmalıdır. En güncel Excel şablonu 25ib istek üzerine kullanılabilir olduğu, Créton laboratuvar oluşturulur. Farklı tedavi grubu gösteren grafikler tedavi grubu ve kontrol grubu arasında karşılaştırma için t-testi ile birlikte Excel sayfası içine inşa edilmelidir. Ayrıca istatistiksel analiz SPSS kullanılarak yapılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drinks+like+a+fish:+zebra+fish+(Danio+rerio)+as+a+behavior+genetic+model+to+study+alcohol+effects.">Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).</li><li>Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+activity+in+zebrafish+embryos:+A+new+method+to+assess+developmental+neurotoxicity.">Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).</li><li>Norton, W., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+organism+for+behavioural+genetics.">Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics.</a> BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).</li><li>Levin, E. D., Cerutti, D., Buccafusco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+15.">Ch. 15.</a> Methods of behavioral analysis in neuroscience. , (2009).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. , 203-253 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kokel, D., Bryan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+behavior-based+identification+of+neuroactive+small+molecules+in+the+zebrafish.">Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).</li><li>Rihel, J., Prober, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Behavioral+Profiling+Links+Drugs+to+Biological+Targets+and+Rest/Wake+Regulation.">Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation.</a> Science. 327, 348-351 (2010).</li><li>Cachat, J., Stewart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+behavioral+and+endocrine+responses+to+novelty+stress+in+adult+zebrafish.">Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish.</a> Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).</li><li>Cachat, J., Stewart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Neurophenotyping+of+Adult+Zebrafish+Behavior.">Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior.</a> PLoS ONE. 6, e17597 (2011).</li><li>Sledge, D., Yen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+duration+of+exposure+for+developmental+chlorpyrifos-induced+neurobehavioral+toxicity.">Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).</li><li>Stewart, A., Wu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+anxiety-like+phenotypes+in+adult+zebrafish+behavioral+models.">Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).</li><li>Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+provide+a+sensitive+model+of+persisting+neurobehavioral+effects+of+developmental+chlorpyrifos+exposure:+comparison+with+nicotine+and+pilocarpine+effects+and+relationship+to+dopamine+deficits.">Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+assay+to+measure+responsiveness+of+zebrafish+to+changes+in+light+intensities.">A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities.</a> J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).</li><li>Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+imaging+system+for+automated+analyses+of+avoidance+behavior+in+zebrafish+larvae.">A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).</li><li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+developmental+toxicity+by+automated+analyses+of+behavior+in+zebrafish+larvae.">Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae.</a> Unpublished observations. , (2012).</li><li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+edge:+pharmacological+evidence+for+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).</li><li>Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+sub-chronic+exposure+to+chlorpyrifos+reduces+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Neurotoxicol. Teratol. , (2012).</li><li>Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz sürekli yeni davranış tahlil iyileştirilmesi olsa da, her zaman kaçınma ve Zebra balığı larvaları 15 thigmotaxis davranış tespiti için yararlı olmuştur. Pek çok çalışma, örneğin kullanılan uyarıcı renk olarak, tahlilin sonuçları optimize etmek için yapılmıştır, şerit başına larva ve davranış tahlilinde uzunluğunu doğru sayısı. Daha önce, çok iyi plakaları (6 ya da 12 kuyucuklu) 15,17,18 kullanılır. Ancak, son zamanlarda bize tek bir deneyi 16 (Şekil 5) davranışsal önlemler daha çok sayıda toplamak için izin larvaları için daha büyük bir yüzme alanı oluşturmak için yeni şerit kalıp oluşturduk. Diğer değişiklikler PowerPoint işletmeler varyasyonları (testinin değişmiş hareket ya da uzunluk) ve (biz de daha dar yolları için kalıplar var) kullanılan şerit büyüklüğü içerir. Şu anda, bu yüksek verimli otomatik sistem ZEBR davranışları geniş bir ürün yelpazesi ölçmek için yeteneği benzersizdirBu hız, kaçınma, diğer larva yakınlık ve çok şeritli plakalar thigmotaxis aynı zamanda Afish larva. Sonuçlar hızlı bir şekilde elde edilebilir ve larva, çok sayıda görüntüleme zamanda analiz edilebilir. Sistem kurmak için oluşturmak için ucuz ve hızlı ve kolay hem de. Bu sistemin bir sınırlama 3-D hareketleri Zebra balığı larvaları değerlendirilemez olmasıdır. Yetişkin Zebra balığı izlemek otomatik sistemler 3-Ge kapasitesi var ve bu hareket yukarı veya aşağı su sütunu 10,19 içinde gibi davranışların daha geniş belirleyebilir. Başka bir sınırlama bizim görüntüleme sistemi şu anda görüntü hızda yüksek verimlilik analizleri için optimize olmasıdır. Daha düşük bir çözünürlük 15 için kamera ayarlarken video hızlı görüntüleme mümkündür, ama bu tek plaka için analiz kısıtlar. Yeni oluşturulan &quot;şerit&quot; yöntemi kullanılarak, tahlil çeşitli yerlerinde hassas bir şekilde yürütülür gerekiyordu. T larvaları yerleştirirkeno şerit, bu plakalar laptop ekranın üst kısmında konumlandırılmış kadar sıvı seviyesinin çok sığ olduğundan emin olmak için önemlidir. Şerit sıvı çok dolu ise, larva plakanın çevresine kaçacak. Buna ek olarak, agaroz kalıbın, bakım zaman çok yavaş kalıp düşürmek için gerekli önlemler alınmalıdır. Kalıp çok hızlı takılırsa, kabarcıkları agaroz oluşturacak ve ek larva olarak Resim J makro tarafından tespit edilecektir. Bu agaroz şerit hatta birkaç kabarcıkları varsa, bu yenilerini yapmak için en iyi tavsiye edilir. Gelecekte, bu tür Zebra balığı larvaları öğrenme gibi diğer karmaşık davranışları analiz ve öğrenme erken gelişiminde toksik ve ilaç maruz etkilenebilir nasıl incelemek için bizim davranış tahlil optimize etmek istiyorum. Şu anda davranışsal sonuçları beyin bölgeleri olduğu tespit kolaylaştırabilir hangi öğrenme davranışlarını analiz için yararlı olabilir testleri üzerinde çalışıyoruzgelişim sırasında bazı toksik maddeler veya ilaç etkilenir. Otomatik deneyleri Zebra balığı larvaları 20 ve bu deneylerde davranışları öğrenme çok şeritli plakalar sağlam kaçınma tepkisi kullanarak yüksek verimli tarama için iyileştirilebilir olabilir ölçmek için geliştirilmiştir. Bu davranış tahlilinde, ilaç ve toksik maddeler, çok sayıda gelişimsel etkilerini test etmek için daha sonraki çalışmalarda kullanılabilir öneriyoruz. Bu tür çalışmalar belirli risk faktörleri üzerine bilgi hazinesi sağlamak ve hamile kadınlar ve çocuklar için daha iyi sağlık ve güvenlik kurallarına ayar katkıda bulunacaktır.

Zebra balığı genetik, gelişimsel ve davranış bilimleri 1-4 için popüler bir modeli haline gelmektedir. Bunlar, 2-3 gün sonra döllenme (DPF) kendi chorions gelen yumurtadan 4-5 dpf&#39;e tarafından tam olarak işleyen bir organ geliştirmek ve 7 dpf 5,6 ile davranışların çok sayıda sergiler. Balığı larvaları ideal nedeniyle küçük boyutu 7,8 yüksek verimlilik analizler için uygundur. Yazılım larva ve yetişkin zebrabalıkları 9-14 davranış otomatik analiz için ticari olarak temin edilebilir. Ancak bu yazılım pahalı ve çok iyi plakaları Zebra balığı larvalarının karmaşık davranışları ölçmek için sınırlı seçeneği vardır. Biz kurmak ve 7 dpf Zebra balığı larvaları 15,16 farklı davranışlar bir dizi sayısal olarak ucuz yeni bir yüksek verimli görüntüleme sistemi oluşturdu. Sistem, bir dizi embriyonik maruz kaldıktan sonra bize hızlı ve verimli bir şekilde ince bir davranış bozukluğu test etmeye imkan vermektedirilaç ve çevresel toksik atıkları 16-18. Sistem, kabin üstündeki evin bir dijital fotoğraf makinesi ahşap dolaplar, kullanılarak inşa edilmiştir. Kamera bir dizüstü bilgisayar 15 yukarı bakacak şekilde ekran yerleştirilir kabinin altına aşağı karşı karşıya. Zaman atlamalı görüntüleme şerit larvaların yerleştirme yakalamak için kullanılır. Larva laptop ekranın üst kısmında konumlandırılmış dört çok iyi veya çok şeritli plakalara kadar muhafaza edilebilir. Biz larva kenar (thigmotaxis) 15,17 doğru uzaklaşıyor (kaçınma) ve yüzme cevap için caydırıcı bir uyarıcı olarak bir PowerPoint sunumu kullanın. Görüntüler otomatik makro, renk kanalları bölünmüş arka plan çıkarma ve bireysel larva tanımlamak için bir eşik uygulamak için kullanıldığı ImageJ alınır. Koordinatlar her resim her larva için listelenen ve kaçınma ve thigmota ölçmek için kullanabileceğiniz bir Excel dosyasına eklenebilirxis davranış, balık mesafe balık, hız ve dinlenme 16 miktarı yüzmek.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

Biz çok şeritli plakalar 7 günlük eski Zebra balığı larvaları davranış analizi için yeni bir yüksek verimli görüntüleme sistemi oluşturduk. Bu sistem bir PowerPoint sunumu ile larva gösterilir spontan davranış ve caydırıcı bir uyarana tepki, ölçer. Kaydedilen görüntüler, otomatik olarak renk kanalları böler bir ImageJ makro ile analiz edilir arka plan çıkarır ve şerit bireysel larva yerleştirme tanımlamak için bir eşik geçerlidir. Daha sonra yüzme hızı, sokağın kenarına ya da yan için tercih, dinlenme davranış, thigmotaxis, larva arasındaki mesafe ve kaçınma davranışı ölçmek için bir Excel sayfası içine koordinatları alabilirsiniz. Davranış ince değişiklikler kolayca çevresel toksik maddeler veya ilaçlara maruz kaldıktan sonra davranış analizleri için yararlıdır, bizim sistemi kullanılarak tespit edilir.

Daha önceki analizlerde, vahşi tip larva iyi (kaçınma davranışı) &#39;de yüzerek ve iyi (thigmotaxis davranış) 15 kenarlara doğru hareket topu cevap, top zıplatma caydırıcı uyarıcı tedavi olduğunu kullanarak. Daha sonra bu tahlilde thigmotaxis davranış zebrabalıkları larvaları 17. Anksiyete ile ilgili bir davranış önlem olduğunu doğruladı. Boş bir beyaz arka karşılaştırıldığında larvaları hareketi önemli farklılıklar uzağa top ve kenar tercihi vardı. Bu davranışlar da hareketli kırmızı çubuk kullanarak yeni tahlil doğrulanmıştır ve daha güçlü 16 olan var. Ayrıca, şimdi yüzme hızı, dinlenme, iyi sonunda ya da yan için tercih, ve balık arasındaki mesafe (Şekil 5) de dahil olmak üzere tek bir deneyde davranışları daha çok sayıda örnek olabilir. Yumurta su yetiştirilen Kontrol larva artan bir tercih çanak ve sokağın kenarında bir aşağı olmak göstermekFrangoulis onlar caydırıcı bir uyaran (kırmızı çubuğu hareket) mevcuttur. Larva 1 ug / ml DMSO, yaygın olarak 1.000 x stok çözeltiler gibi çeşitli ilaç ve toksik maddeler çözmek için kullanılan bir çözücüyü içeren yumurta su yetiştirilen benzer sonuçlar elde edilmiştir. Örnek sonuçlar yumurta su ve DMSO (kontrol olarak) ve genellikle organik olmayan besinlerde bulunan bir organofosfat pestisit değişen konsantrasyonları ile muamele edilmiş larvalarda Şekil 5 &#39;de gösterilmiştir. Gösterilen sonuçlar, bir deneyde bir örnekleme. Ancak, tekrar, sonuçlar yüzme hızı ve thigmotaxis davranış insan gıdası tüketimi 18 düzeyleri taklit organofosfat pestisitlerin düşük konsantrasyonlarda, tarafından değiştirilmiş olduğunu gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> Şekil 1. Koleksiyon Tepsiler. Cam Pyrex yemekleri e toplamak için kullanılıryetişkin balık tankları mbryos. Pyrex yemekleri kapakları kesilmiş ve plastik ızgaraları ve yeşil iplik plastik ızgaraları üzerine dikilir ile yerleştirildi. Bu doğal çevre taklit ederek yetişkin zebrafish için bir üreme ortamı oluşturur. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> Şekil 2. Plastik kalıp ve agaroz şerit. A) kalıp solda gösterilir. % 0.8 agaroz tek plaka içine dökülür; kalıp yavaş yavaş eklenir ve agaroz soğuduğunda sonra kaldırılır B) sağ plakası plastik kalıp agaroz oluşturulan şerit gösterir.. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> Şekil 3,. Görüntüleme Dolaplar. Görüntüleme dolapları speciall edildiy Laboratuvarımızda inşa edilmiş ve yüksek verimli davranış analizleri için kullanılır. Bir 15 megapiksel dijital kamera, bir dizüstü ekranın üstüne yerleştirilir multilane plakalar larvaların zaman atlamalı görüntüleri toplamak için aşağı bakacak şekilde kabinin üst bağlıydı. Plakaları ve ekran arasında toplanan görüntüler hareli desenleri önlemek için kullanılan bir plastik difüzör var. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> Şekil 4. Boş arka plan ve PowerPoint caydırıcı uyarıcı. Bu Zebra balığı larvaları davranış değişiklikleri uyandırmak için kullanılan geçerli PowerPoint. Bu A) boş bir arka plan ve B) hareketli kırmızı çubuk arasındaki sağlam davranış farklılıkları sağlar. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> Şekil 5,. Yüksek verimli test Sayısallaştırılmış Davranışlar. Biz x, larva y koordinatları için kullandığınız Excel sayfası içinde bizim davranış testte sayısal vardır davranışların örneği. Beyaz bar boş bir arka plan maruz kalan ve kırmızı çubuklar PowerPoint kırmızı hareketli bar maruz larva verileri göstermek larva verileri göstermektedir. Grafikler) B, sokağın ucunda larva yüzdesi, C) sokağın kenarında larva yüzdesi, D) Mesafe arasındaki şeritte larvaların A) Yüzde aşağı davranış analizi elde edilebilir ölçümler göstermektedir balık (mm), E) larvaları (mm / dak), F) larvaların yüzdesi dinlenme hızı yüzün. Gösterilen grafiklerin, veri Tedavi danDMSO kontrolü ve 0.001 0.1 mcM (genellikle insan diyet bulundu düzeyleri) arasında değişen bir pestisit çeşitli konsantrasyonlarda larvaların ent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Laboratuvarımız 7 günlük eski Zebra balığı larvaları birkaç farklı davranışların tespiti için yararlı bir yeni yüksek verimli otomatik görüntüleme sistemi geliştirdi. Sistem, larva çevresel toksik ya da eczacılık maruz kalmış sonra davranış ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

automated-high-throughput-behavioral-analyses-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Görüntüleme.  Brown University. Laboratuvarımız 7 günlük eski Zebra balığı larvaları birkaç farklı davranışların tespiti için yararlı bir yeni yüksek verimli otomatik görüntüleme sistemi geliştirdi. Sistem, larva çevresel toksik ya da eczacılık maruz kalmış sonra davranış ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

Video: Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Nörobilim

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM Görüntüleme ve FIMtrack: Yüksek verim ve Maliyet Etkili Hareket Analizi izin İki Yeni Araçlar

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Zebra balığı epilepsi modelinde davranışsal ve fizyolojik analiz

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

Hemorajik Inme patolojik sonuçlarını Incelemek için zebrafish larva kullanma

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This alternate immersion protocol is a noninvasive, step-wise method of inducing hyperglycemia for up to eight weeks. Adult zebrafish are alternately exposed to sugar (glucose) and water for 24 hours each. The zebrafish begin treatment in a 1% glucose solution for 2 weeks, then a 2% solution for 2 weeks, and finally a 3% solution for the remaining 4 weeks. Compared to water-treated (stress) and mannitol-treated (osmotic) controls, glucose-treated zebrafish have significantly higher blood sugar levels. The glucose-treated zebrafish show blood sugar levels of 3-times that of controls, suggesting that after both four and eight weeks hyperglycemia can be achieved. Sustained hyperglycemia was associated with increased Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and increased nuclear factor Kappa B (NF-kB)&#160;levels in retina and decreased physiological responses, as well as cognitive deficits suggesting this protocol can be used to model disease complications.

This protocol noninvasively induces hyperglycemia in zebrafish for up to 8 weeks. Using this protocol, an in-depth study of the adverse effects of hyperglycemia can be made.

Zebra Balıklarında Uzun Süreli Hiperglisemi Üretmek için Glikozda Alternatif Daldırma

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43'ün Optogenetik Faz Geçişi

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

In vivo (İn canlı) Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

Yazar Spotlight: Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının İn Vivo Tüm Beyin Görüntülemesi  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...