The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

NOT: Tüm işlemler Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uygun olarak yürütülmüştür. Tavsiye malzeme ve ekipman listesi Tablo 1&#39;de bulunabilir. 1. Doku Hazırlanması <ol><li> Serpilme <ol><li> Sodyum pentobarbital (25 mg / kg, ip) bir fazla dozu ile kemirgen Euthanize ve 8 ml / dk&#39;lık bir akış hızında tam kandan arındırıldı (3-5 dakika kadar) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile transkardiyal serpmek. Derinlemesine perfüzyon talimatlar için Gage ve ark 2012 9 bkz. </li><li> Hemen / dak, 8 ml bir akış hızında 15-20 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile perfüze doku çözmek PBS gömme et. </li><li> 4 ° C &#39;de, (tris tamponlu salin içinde hazırlanan sırayla% 15,% 30,% 30) kademeli sakaroz çözeltileri, ardından 24 saat için% 4 paraformaldehid beyin ve yer çıkarın. Sonraki sakaroz çözüm o beyin aktarınnly beynin sonra her çözeltide batırdı. Not: Genellikle, her çözümün 5 gün doku batmaya için yeterli bir süredir. </li></ol></li><li> Doku Dondurma ve Cryosectioning <ol><li> Örneğin Ekim bileşiği olarak, gömme orta beyin yerleştirin ve -35 ° C arasında bir sıcaklıkta, izopentan içinde daldırın. Beyin, 10 dakika içinde en az dondurma, ve daha sonra -80 ° C&#39;de saklayın izin verin. Sıcaklık titizlik alınmadığı takdirde sorunlar ortaya çıkabilir; sorun giderme bilgileri için tartışma bakınız. </li><li> 20 um kadar bir kalınlıkta ve -20 ° C arasında bir sıcaklıkta bir seri koronal kesitler halinde kesilmiştir. Pozitif yüklü slaytlar üzerine doku toplayın. Beyin kesitleri, -80 ° C&#39;de, bir fermuar-top çantası ve depolanmış uzun vadede folyo ile sarılmış bir slayt kutuya yerleştirilmiş olabilir. Depolama Bu yöntem hava ve dona maruz kalmasını önlemek için bir çift sınır oluşturur. </li></ol></li></ol> 2. Doku İşleme NOT: Örnek ekipman ve materyaller rboyama için equired Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Alternatifleri mevcut, ancak bu görüntülerin immünohistokimyasal yeni başlayanlar ön alım için uygun öğeleri görselleştirmek için yardımcı olacaktır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Şekil 3: Örnek öğeler immünohistokimyasal için gerekli (A) gösterilen siyah kutu immünofloresan için ideal bir nem odası olan, slaytlar folyo kutuyu sarmak için gerek kalmadan ışıktan korunmalıdır gibidir.. Kesit sonrasında slaytlar, örneğin (B) &#39;de gösterildiği san bir kutu gibi bir kutu içinde depolanabilir. Folyo sıkıca kutuyu tamamlayan ve önceki dondurucu bir zip-top çantası yerleştirerek dondurucu yanık doku örnekleri korunmasına yardımcı olur. Slaytlar bir örneği D (çeşitli boyama (D) &#39;de gösterilen yemekler ile (C)&#39; de verilmektedir </strong&gt;). Lameller ancak 1.2 kalınlığında lamelleri en dik ve konfokal mikroskoplar güzel görüntüleme sonuçlarını sağlamak, büyüklük ve kalınlıkta (F) değişebilir. Örneğin (G) &#39;de gösterildiği gibi bir kalem slaytlar etiketlemek için kullanılabilir. Mürekkep çalıştırabilirsiniz gibi kalıcı belirteçler boyama ve örnek ne olduğunu belirlemek için yeteneği hem etkileyen, kaçınılmalıdır. (H) &#39;de gösterildiği gibi bir Mini PAP kalemi bir itici sınır slaytlar üzerine çekilmesini mümkün kılar. <ol><li> Slayt hazırlama <ol><li> Oda sıcaklığında dondurucu ve çözülme slaytları çıkarın. <ol><li> İsteğe bağlı: bölümler, daha önce slaytlar süzülüyor varsa, slaytlar rahatsız yüzen doku kesitleri önlemeye yardımcı olmak için en fazla 4 saat süre ile 60 ° C&#39;de bir fırın içinde çözülmüş slaytlar yerleştirin. </li></ol></li><li> Bir slayt raf ve ilgili tabak yerleştirin kayar. </li><li> Yıkama yıkamalar arasında çözelti, değişen her biri 5 dakika süreyle PBS içinde üç kez kayar. Ileriye Bu adımdan itibaren, secti önlemekons uzun bir süre için sıvı olmadan. Not: bölümler kurumasına, arka plan boyama artar ve anlamlı veriler güvenilir elde edilemez. </li></ol></li><li> Doku Boyama <ol><li> Bir ışık geçirmez boyama kutusunda, iyonu giderilmiş su ile ıslatılmış tüysüz bir doku ile bir &quot;nem odası&quot; oluşturur. </li><li> Uzak doku kesitlerinden, slayt çok kenarında bir sıvı itici sınır yapmak için mini bir pap kalem kullanın, tüysüz bir doku ile slayt kenarlarını kurutun. Bu sınır sıvı menisküs ve yüzey gerilimi boyama etkilemez, böylece doku kenarı arasında geniş bir alan temin etmelidir. Not: ilgi antikorlar mikrodalga antijen alımı gerektirmeyen, PAP kalem kovucu sınır önce 2.1.3 uygulanabilir. PAP kalem PBS içinde yıkama öncesi uygulanmış ise, sıvı itici sınır bütünlüğü bu aşamada kontrol edilmelidir. Sınırda herhangi boşlukları doldurmak için bir mini-pap kalem kullanın. </li><liSlaytlar yatay olarak yerleştirilmiş ile&gt;, blok nonspesifik antijen PBS (blok çözeltisi) içinde% 4 h / h serumu içinde inkübe edilerek bağlama. Pipet oda sıcaklığında 1 saat için slayt başına blok çözeltisi 300 ul. Emin blok çözüm slayt kenarında pap kalem uzanır ve tamamen dokuya yakın yüzey gerilimi nedeniyle düzensiz boyama önlemek için doku kapsar emin olun. <ol><li> İkincil antikor yapıldığı aynı türden serum kullanın. Not: Bu prosedürde, ikincil antikorlar eşek yapılır, ve bu nedenle eşek serumu kullanılmıştır. İki veya daha fazla farklı türlerden ikincil antikorlar kullanıldığında, her türden serum içerir. </li></ol></li><li> Slaytlarınıza Pipet primer antikor. Not: Bu boyama için antikor konsantrasyonları 1&#39;den optimize edilmiştir: 5,000 ve 1: sırasıyla Iba1 ve Pan-nöronal 500. Bu konsantrasyonlar, bir arka plan boyama yokluğu ile anlamlı bir lekeleme göstermek için tespit edilmiştir. <ol><li> Blok çözümü sulandırmak% 1 PBS içinde serum ve primer antikor ilave edin. Slayt başına% 1 serum içinde primer antikor çözeltisi 300 ul Pipet. Yine, sıvı pap kalem kenarına olduğundan emin olun. 4 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe edin. </li><li> Iba1 ne Pan-nöronal ne antikorları içeren bir Pan-nöronal antikor olmadan Iba1 ile bir ve Iba1 olmadan Pan-nöronal antikor: biri üç kontrol slaytlar ekleyin. Bununla birlikte, ikincil antikor, spesifik olmayan bağlanmanın test etmek için, birincil antikor ihmal aynı çözeltiler için de aynı vadede bu slaytlar Leke. </li></ol></li><li> Ertesi sabah, yıkama yıkamalar arasında solüsyonu değişen her biri 5 dakika süreyle PBS içinde üç kez kayar. </li><li> Floresan antikorlar ileri bu adımı, siyah veya karanlıkta inkübe ya olan yıkama kapları folyo ve melezleme kutularında sarılır sağlayarak ışık maruziyeti en aza indirmek, bu nedenle, ışığa duyarlı bulunmaktadır. Tüm slaytlarda uygun ikincil antikorlar pipet ve inkübe1 bir konsantrasyonda, oda sıcaklığında 60 dakika: blok çözeltisi içinde 250, bir ışık geçirmez &quot;nem odası&quot; (aşama 2.2.3) (adım 2.2.1). <ol><li> Farklı dalga boyları ikincil antikorlar kullanın. Burada, birincil antikor tavşan anti-Iba1 için uygun ikincil antikor olarak eşek anti tavşan 594 kullanın. Birincil antikor fare anti-pan-nöronal için, ilgili ikinci antikor olarak eşek anti-fare 488 kullanır. Alternatif olarak, anti-tavşan 488 ve anti-fare 594 kullanır. </li></ol></li><li> Yıkama her biri 5 dakika süreyle PBS içinde üç kez kayar. </li><li> İsteğe bağlı: Nükleer boyama gerçekleştirin. <ol><li> Tam olarak 60 saniye boyunca iki kez damıtılmış H 2 0 içinde 0.03 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, Hoechst (ya da diğer nükleer leke)&#39; de yer. </li><li> Yıkama her biri 5 dakika süreyle PBS içinde üç kez kayar. </li></ol></li><li> GKD 2 0 yıkayın. </li></ol></li><li> Coverslipping <ol><li> Böyle Fluor gibi sulu montaj orta ile lamel slaytlar,omount-G ya da ProlongGold. Bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak tüm kabarcıklarını çıkarmak için özen gösterin. Not: Diğer montaj ajanlar kullanılabilir, ancak yüksek sızdırma-yoluyla boyalar arasındaki coverslipping gün içinde bazıları tarafından not edilmiştir. </li><li> , Kenarları mühür açık oje kullanın buharlaşma nedeniyle kurumasını engelleyen bölümleri. Slaytlar düz ve oda sıcaklığında devam ederken tırnak cilası bir ışık geçirmez bir kap içinde kurumasını bekleyin ve daha sonra 4 ° C&#39;de folyo ile sarılmış bir ışık geçirmez bir kapta saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Lekeli Doku Görüntüleme <ol><li> Mikroskopla inceleme <ol><li> Oje karanlık bir odada yer alması gereken, mikroskopi başlamadan önce en az bir saat kurumasını bekleyin. </li><li> Floresan ışık kaynağı ve bir dijital kamera eki olan bir konfokal veya araştırma mikroskobu kullanılarak fotomikrografları edinin. Ekteki yazılımı kullanarak, her dalga boyu için pozu ayarlamak - 405, 488, ve 594 - ayrı. Not: derinlemesine görüntüleme talimatları mikroskop üreticisinden online olmalıdır. </li><li> Bölümleri hareketli ya da odak ayarlama yapmadan her kanalda fotomikrografları edinin. Renkli fotoğraf çekmek, ya da dönüşümlü olarak gri tonlu ve daha sonra renk dönüştürmek. Not: Renk veya her kanaldan gri tonlu görüntüleri sonrası işleme harmanlanmış edilebilir. </li><li> Kesitlerin fotoğraf beyazlatma oluşacak şekilde, doku kesitleri uzun süre için ortam ışığı veya mikroskopik ışığa maruz kalmayacağı emin olun. Bunu önlemek için, artan ışık / lazer yoğunluğu yerine pozlama süresini artırın. </li><li> Açıldıktan 30 dakika içinde floresan ışık kaynağı kapatmayın. Not: hızlı bir şekilde açık ve kapalı kaynak geçiş floresan ampul ömrünü azaltabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+antigens+and+antibodies.">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li><li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods.">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li><li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies:+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis.">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li><li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-labeled+antibodies:+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens.">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li><li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application.">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li><li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. , (1983).</li><li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Junqueira's basic histology : text and atlas. , (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).</li><li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy).">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li><li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+sections+of+70-100+mum:+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system.">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu iletişimin genel amacı okuyucuya immünhistokimya prosedürleri tanıtmak oldu. Bunun için, Iba1 ve Pan-nöronal antijenler ile çift etiketleme örneği mikroglia ve perfüze paraformaldehid nöronlar gözlemlemek, sükroz cryoprotected cryosectioned sıçan beyin kullanıldı. Bu teknik, sonsuz amaçlara hizmet etmek için adapte edilebilir. Beyin, akciğer, karaciğer, böbrek ve bağırsak sınırlayıcı gibi, ancak doku tiplerinin, çeşitli farklı antijenlerin dizisi protokolü...

<html> İmmünohistokimya ilgi antijenlere spesifik olarak bağlanan primer antikorlar kullanılarak, doku kesitlerinde antijenleri (örneğin, proteinler) tespit edilmesi için bir işlemdir. O antikorlar Büyük özgüllük 1 antijenleri lokalize olabilir tespit zaman İmmünohistokimya 1934 yılında JR Marrack öncülük ettiler. 1942 yılında başlayarak, immunohistokimyasal görselleştirmek için floresan antikorlar kullanılarak çalışmalar in vitro ilk bazı in vivo histokimyasal çalışmada ilk 4 basıldı sonra 2,3, yayınlandı. 1960 &#39;li yıllarda, üç yıl immünohistokimyasal yöntemleri süre sonra, bir enzim-konjüge edilmiş antikor, ikincil reaktifler olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bu yöntemler aynı anda ve birbirinden bağımsız Fransa ve ABD&#39;de 5,6 geliştirilmiştir. Bugün, antikorların geniş bir dizi immunohistokimya çalışmaları 7 için sonsuz olanaklar sağlar. &quot;&gt; Bu yazışmaların genel amacı immünohistokimyasal içine kısa bir tanıtım sağlamak, bu tekniğin kapsamlı ve ayrıntılı bir yorum olması anlamına gelmez özetlenen yöntemde, iki antijen için immünohistokimyasal teknikler mikroglia için (işaretçileri sunulmuş ve. perfüze paraformaldehit boyama nöronlar), sukroz cryoprotected cryosectioned sıçan beyni. immünohistokimyasal boyama, arka plan boyama azaltmak için spesifik olmayan antijen bloke ile başlar. Daha sonra, birincil antikor ile inkübasyon dokusunda özel bir antijene bağlanma sağlar. birincil antikor izlenerek, başka bir antikor, ikincil antikor olarak adlandırılan, bir konjüge görselleştirme sinyali 8 birincil antikor bağlantı uygulanır. ikincil antikor birincil antikora yükseltilmiş olan türlere özgü immünoglobulin G (IgG) alanı hedef alır. sekonder antikor sinyali güçlendirir Primer antikor t Fab bölgelerinde beriPrimer antikor IgG etki alanında birden fazla site için elinden ikincil antikor bağlama. Her iki durumda da, ikincil antikorun Fc bölgelerine konjüge enzimler ya da floresan moleküller görselleştirme sağlar. Örneğin, bir tavşan anti-Iba1 birincil antikor Iba1 için spesifik bir tavşan IgG molekülüdür. Eşek anti-tavşan IgG ikincil antikor olarak tatbik edildiği zaman, bu tanıma ve tavşan anti-Iba1 IgG birden fazla bölgeye (bakınız Şekil 1) bağlanacaktır. eşek antikor çeşitli yöntemlerle görülebilir. Bu yazışmalar floresan mikroskobu ile görselleştirme, primer antikor tanıyan sekonder antikor, konjuge bir floroforun tespiti üzerinde duruluyor. Floresan immünohistokimya, bu tür ajanlar Hoechst veya DAPI gibi bir nükleer boya bütün çekirdeklerinde görselleştirmek için kullanılabilmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Şekil 1: SchDoğrudan ve dolaylı antikor etiketleme tekniklerinin ematic temsili. Antikorlar, ilgi alanındaki antijene bağlanan ve birincil antikor türleri karşı artan sekonder antikor ile amplifiye edilebilir. Bu teknik, görselleştirme (A) için amplifikasyon ve DAB için avidin-biyotin kompleksi (ABC) kullanılarak gerçekleştirilmiştir, ya da doğrudan konjüge edilmiş floresan ikincil antikor (B). Alternatif olarak, birincil antikorlar doğrudan biyotin veya bir fluorofor (C) dahil olmak üzere birçok farklı etiketler, konjuge edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> (DAB; Şekiller 1 ve 2), immünohistokimyasal görselleştirilmesi için alternatif bir yöntem, 3,3&#39;-diaminobenzidin tetrahidroklorür kullanır. Bu, bir biyotinile kullanılarak fluoresans farklıdır veyaparlak alan mikroskopisi altında algılanabilen bir çökelti DAB dönüştürmek için bir enzim içerir bayırturpu peroksidaz (HRP) konjüge edilmiş ikincil bir antikor. Tek bir antijen ilgi ya da boyama uzun ömürlü olması için gerekli olan durumlarda, DAB floresan boyama daha uygun olabilir. Bununla birlikte, DAB boyama iki nükleer antijen ilgi, özellikle, birden fazla belirteçleri arasında farklılaşması için çok uygundur değildir. DAB malzemeleri ve protokol değişiklikler hakkında bilgi için, Tablo 1 bakınız. Alternatif olarak, nitro mavi tetrazolyum klorür / 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (NBT / BCIP) orta konjüge bir alkalin fosfataz (AP) görselleştirmek için kullanılabilmektedir antikordur. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. Nikel geliştirilmiş DAB tek etiketli sıçan beyin dokusu kesitlerinin Temsilcisi görüntüleri Sıçan beyin seTek başına mikroglia veya nöronların uzun süren analiz için Iba1 (A) ve Pan-nöronal (B) için nikel geliştirilmiş DAB ile etiketlenmiş olan seksiyonlar. Ölçek çubuğu 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bir doku içinde ilgi antijenin tahmini bolluğu analiz ediliyor düşünmek gerekir. Dolaylı yöntemler (yukarıda anlatıldığı gibi) düşük yoğunlukta olan hedefler için yararlıdır. Ilgi, antijen yüksek bolluk olduğunda, direkt yöntemler uygulanabilir. Doğrudan yöntemler doğrudan görselleştirme sinyaline konjuge edilmiş bir birincil antikor içerir ve dolayısıyla ikincil antikor gereklidir. Bu yöntem boyama işlemini kolaylaştırır, ancak dolaylı yöntemlerle elde amplifikasyon ortadan kaldırır. Bir doğrudan konjüge edilmiş birincil antikor kullanarak da sekonder antikorların çapraz reaktivite ortadan kaldırırne zaman çift etiketleme. Bu iletişim Iba1 ve Pan-nöronal (Tablo 1 ayrıntıları) ile çift etiketleme için protokol göstermektedir. Iba1 dallanmış, hiper-dallanmış, aktif, amoeboid ve çubuk dahil olmak üzere birçok aktivasyon devletler içinde mikroglia lekeler. Pan-nöronal lekeler nöronal akson, dendrit ve soma. Iba1 çoğu mikroglia ve Pan-nöronal olası hedefler nöron leke yana, lekeleri bu kombinasyon mikroglia-nöron etkileşimleri geniş bir anlayış kazanıyor yararlıdır. Özetle, immünohistokimyasal antikorların dikkatli seçimi dayanmaktadır. Araştırma sorusu daha spesifik hale geldikçe, diğer antijenlere karşı üretilen antikorlar arzu edilebilir. Belirli bir mikrogliyal aktivasyon durumunu hedeflemek için, bir yerine Iba1 daha CD45 veya CD68 antikorları kullanmayı tercih edebilir. Dahası, fareler ile çalışma, F4 / 80 gerekli sonuçlar verebilir. Benzer şekilde, nöronal elemanlar özellikle antikorlar ra ile hedeflenebilirçekirdeğin karşı kili, sinaps (öncesi veya sonrası), akson ve büyüme konisinin. Ayrıca, nöron (Çift cortin, Neun) yaşını ayırt diğer belirteçler ve nöronal rejenerasyon (GAP-43) vardır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1171">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oven</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028112</td>
			<td>Used for tissue drying (2.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mini Pap pen</td>
			<td style="width:132px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">00-8877</td>
			<td>Used in step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-149-429</td>
			<td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666-A</td>
			<td>Used for drying slides (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Black Staining Box</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">21050</td>
			<td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-413-253</td>
			<td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse &#945;-Pan-neuronal</td>
			<td style="width:132px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB2300</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit &#945;-Iba1</td>
			<td style="width:132px;">Wako Chemical</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-Rabbit 594</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-585-152</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-mouse 488</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-545-150</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Caterer&#39;s foil</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:132px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Coverslips</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12544E</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Clear Nail Polish&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axioskop A2</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CitriSolv&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB Peroxidase kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2001</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Wheaton slide racks and staining dishes</td>
			<td style="width:132px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">21043</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex perfusion pump and tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Thermometer (-50 to 50 C)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-059-228</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM3500S</td>
			<td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>353</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>354</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

İmmünohistokimya yerinde antijenlerin varlığı, konumu ve göreceli bolluk tespiti için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu giriş seviyesi protokol mikroglia ve bir örnek olarak nöronal elemanlar için işaretlerini kullanarak, reaktifler, ekipman, ve kemirgen beyin dokusunun immünohistokimyasal boyama tamamlamak için gerekli teknikler anlatılmaktadır. Özellikle, bu kağıt sırasıyla Iba1 ve Pan-nöronal için immünohistokimya yoluyla mikroglia ve nöronların floresan görselleştirme için bir adım-adım protokoldür. Floresans çift etiketleme doğru hücre tipleri, reseptörler, ligand arasındaki etkileşimi gözlemlemek için bir fırsat sağlamaktadır, aynı numune içinde birden fazla protein lokalizasyonu için özellikle yararlı olduğu ve / veya bir başka yanı sıra protein ko- göre hücre dışı matris Tek bir hücrenin içinde yerelleştirme. Diğer görselleştirme teknikleri aksine, floresan immünohistokimyası boyama yoğunluğu azalabilirUygun önlemler alınmazsa, lekelenmeye önümüzdeki aylarda hafta. Floresan kez daha etkilidir ve iki ya da daha fazlası arasında daha kesin bir ayrım yapmaya imkan tanımaktadır Bu sınırlama rağmen, pek çok uygulamada floresans çift etiketleme, örneğin 3,3&#39;-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) veya alkalin fosfataz (AP) gibi alternatifler tercih edilir belirteçler. Tartışma sorun giderme ipuçları ve başarıyı teşvik etmek için tavsiyeler içerir.

Bu boyama protokolü mikrogliya floresan 594 kanal (kırmızı) etiketli olan sıçan beyin dokusu kesitlerinde sonuçları ve 488 kanal etiketli nöronlar (yeşil, Şekil 4). Nükleer leke yapılmış ise, 405 kanalın (mavi) gösterilecektir. Çıkan farklı kanallar içine alınır ve üç kanalın doğrudan bir karşılaştırma için kaplanmış, ya da herhangi bir, iki kanal arasında olabilir. Birçok dijital kazanım yazılım suit, bu işlevselliği içerir. Burada gösterilen Iba1 ve Pan-nöro...

Watch this Scientific Journal Video about Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons at JoVE.com

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.6K Görüntüleme.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

Video: Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Nörobilim

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.