The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia M&#252;nch for technical support.

İnsan doku ya da kan örnekleri üzerinde tüm deneyler etik oylamaya verilen yönergelere göre bir etik komitesi tarafından onaylanmış ve yapılmalıdır. 1. Hücresel Zenginleştirme <ol><li> Sıvı tümörler / floresans ile aktive edilen hücre tasnif. <ol><li> Amonyum klorür kullanılarak eritrosit lizizi gerçekleştirerek veya Ficoll yoğunluk-gradyan santrifüjü ile, kemik iliği veya kan numunesinden mononükleer hücreleri izole edin. <ol><li> Eritrosit liziz için, amonyum klorür çözeltisi 4 ml ile numunenin 1 mL bir araya getirir. 10 dakika - 5 buz üzerinde çözelti inkübe edin. 400 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de fosfat tamponlu tuz (PBS) +% 2 fetal dana serumu (FCS) ve santrifüj 40 ml ilave edilir. </li><li> Ficoll gradyan santrifüj, katman 2 ayrı katmanları oluşturmak için Ficoll-Hypaque 15 ml üzerindeki numune 10 ml için (katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj - dikkatli bir şekilde (15 ila 25 ° C) ve mononükleer hasatinterfaz toplamak hücreler. </li><li> Hücreleri aşağı Spin ve PBS +% 2 FCS onları sürebilir. 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ve 1 ml PBS +% 2 FCS ile kaplar. Negatif kontrol olarak bir kısım ve son leke kullanılan her bir floresan boya için, bir kısım al. </li></ol></li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak seyreltme lösemik hücre popülasyonu izole etmek için yararlı bir floresan-etiketli antikorlar ile inkübe edin. Ayrıca her bir antikor ile tazminat için kullanılan alikotları leke. PBS +% 2 FCS ile iki kez yıkanır. Not: kullanılan antikorlar, CD117-PE (Klon 95C3), CD34-FITC (Klon 8G12) ve CD33-PE (Klon P67.6) karşı fare anti-insan edildi. </li><li> 35 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri, hücre süzgecinden ile ideal kullanarak tüpler kap entegre. </li><li> (Örneğin, 7-AAD) hücre canlılığı leke ekleyin. Bir hücre sıralayıcı 11 (Şekil 2) kullanarak sıralar hücreleri. Isc&#39;den hücreleri toplamak<html> % 10 FCS içeren Ove&#39;nin Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM). </li></ol></li><li> Katı tümörler / Lazer yakalama mikrodiseksiyon. <ol><li> Tarif edilen deneyler için, akciğer kanseri örnekten FFPE örnekleri kullanılmıştır. Bu amaçla, akciğer kanseri dokusu derhal cerrahi rezeksiyon ile yaklaşık 3 x 2 x 1 cm parçaları sonra% 4 tampon formalin içinde sabitlendi için daha fazla analiz için parafin içine gömülmüştür burada. </li><li> Bir mikrotom ile formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş (FFPE) numune 10 um kalınlığı 5 - kesitler halinde kesilmiştir. Film kaplı membran slaytlar ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de kuru üzerine monte bölümleri. Deparaffinize ve 1 dakika boyunca, ksilen içinde arka arkaya kuluçkalama, mutlak etanol,% 70 su ve her monte edilmiş bölümleri nemlendirir. </li><li> 20 saniye hematoksilen ile bölümleri Leke ve daha sonra musluk suyu ile durulayın. Bir lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemini kullanarak ilgi hücre popülasyonu toplayın (ayrıca 12 bakınız). </li></ol></li></ol>başlığı &quot;&gt; 2. Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Sıvı tümörler. <ol><li> 400 xg, 4 dakika 4 ° C&#39;de adım 1.1.5 hücre süspansiyonu Santrifüj ve süpernatant atın. 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca, 500 soğuk PBS ul ve santrifüj ile iki kez yıkanır ve 4 ° C&#39;de </li><li> 10 6 hücre başına 40 ul liziz tamponu ilave edin ve (en az hücre sayısı olmalıdır 10 5 hücre (yakl. 10 ug toplam protein)), buz üzerinde 15 dakika inkübe edilir. 14,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de lizat santrifüj ve yeni bir reaksiyon tüpüne süpernatant (temizlenmiş hücre lisatı) aktarın. Pelet atın. </li></ol></li><li> Katı tümörler. <ol><li> Microdissected dokuya, doku liziz tamponunda 60 ul eklenir ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edilir, kısa süreli santrfugasyon yoluyla sıvı toplamak ve yeni bir reaksiyon tüpüne süspansiyon aktarın. 3 dakika boyunca buz üzerinde lizat sonikasyon. </li><li> Nihai SDS co ulaşmak bir% 20 sodyum dodesil sülfat (SDS) 15 ul ekle% 4 ncentration. 1 saat için bir ısıtma bloğu içinde 99 ° C &#39;de microdissected doku inkübe ve 600 rpm&#39;de çalkalandı. 16.000 x g&#39;de, 10 dakika süre ile 18 ° C &#39;de lizat santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. </li></ol></li></ol> Bir SILAC Spike-in Ölçülmesi Standardı 3. kurulması (Süper-SILAC Standardı) NOT: ölçüm standardı 4 türetilen bir SILAC-etiketli protein karışımı oluşur - ilgi tümör tipini maç 6 hücre hatları. SILAC etiketli referans proteomu ve tümör türevli proteomu arasındaki maksimum çakışmasını sağlamak için, bir ana bileşen analizi hücre çizgileri ölçüm standardı 14 için seçilen önce yapılması gerekir. <ol><li> Temel bileşenler analizi (PCA). <ol><li> Hücre çizgilerinin protein ekspresyon modellerini belirlemek için, uygun hücre kültürü ortamı içinde yaklaşık olarak on farklı hücre hatları yetiştirmek. Hücreleri, tarif edildiği gibiAdım 2.1. Adım 6.1&#39;de tarif edildiği gibi, kütle spektrometrisi için hücre lizatları hazırlayın. </li><li> Yüksek çözünürlüklü her hücre soyunun, protein sentezleme modelini analiz, sıvı kromatografisi-bağlanmış kütle spektrometresi (nanoLC-MS / MS). </li><li> Ücretsiz eşya MaxQuant kullanarak ortaya çıkan ham veri analiz ve Perseus 16,17 gibi ilişkili yazılım kullanarak bir ana-bileşen analizleri. </li><li> Protein-ifade profilleri arasındaki en büyük çeşitlilik gösterir ve Süper-SILAC başak-standardı oluşturmak için bunları kullanmak 6 hücre hatları - 4 seçin. </li></ol></li><li> SILAC-etiketleme ve etiket kontrolü. <ol><li> Arginin ve lisin, karbon ve azot ile (SILAC ortamı) 4 kararlı izotoplar ile işaretlenmiş olan uygun SILAC hücre kültür ortamı içinde en az beş hücre döngüsü için, seçilmiş hücre soylannın geliştirin. </li><li> Parçalayıcı aşama 6.1&#39;de tarif edildiği gibi aşama 3.1&#39;de tarif edilen ve kütle spektrometresi için hücre lizatları hazırlamak hücreleri.NanoLC-MS / MS ile SILAC etiketleme kuruluş verimliliğini ölçmek. MaxQuant ile sonuçlanan ham MS verileri analiz ve SILAC-etiketleme etkinliğini belirlemek. Bu onların etiketli (ağır) olarak tanımlanan peptidler ve onların endojen formları (ışık) sayıları sayma, ve oranı (ağır) / (ağır + ışık) hesaplanması ile elde edilir. Etiketleme verimliliği% 98 aşmalıdır. </li></ol></li><li> SILAC proteomlarda ve doğrulama kombinasyonu. <ol><li> Yetiştirmek ve uygun SILAC ortamında, üretici talimatlarına göre seçilen hücre hatları genişletmek. Parçalayıcı katı tümörler için, aşama 3.2&#39;de tarif edilen ve her bir hücre lizatı protein konsantrasyonunu belirlemek sıvı tümörler için aşama 2.1&#39;de tanımlanan ya da hücreler. </li><li> Her bir hücre dizisinin eşit molar miktarlarda bir protein karıştırın ve kana karışımı içine ayırmaktadır. Ölçme kadar -80 ° C&#39;de alikotları ve mağaza Yapış-dondurma. Süper SILAC standart 50 ug - bir deney için, 20 gerekir. Stan hazırlamak için özenBir dizi deney sırasında içinde standart değişiyor gibi fazlalık olarak dart kaçınılmalıdır. </li></ol></li></ol> Protein Konsantrasyonu ve Spike-in 4. Ölçümü <ol><li> Sıvı tümörler. <ol><li> Protein kantitasyon deneyi kullanılarak ilgili hücresel lizatları ve Süper-SILAC standart protein konsantrasyonlarını belirlemek. </li><li> Temizlenmiş hücre lisatı ve süper SILAC standart eşit miktarlarda karıştırılır ve daha sonra lityum dodesil sülfat (LDS) tamponu (örnek hacminin% 25) ve indirgeyici bir madde (örnek hacminin% 10) ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;de bir ısıtma bloğu içinde elde edilen çözelti ısıtılır. İsteğe bağlı olarak, -80 ° C &#39;de elde edilen denatüre edilmiş proteinler saklayın. </li></ol></li><li> Katı tümörler. <ol><li> Bir plaka okuyucusu üzerinde protein konsantrasyonu ölçümü için, (BSA) seyreltme çözeltisi serisi, lizat ve ticari olarak temin edilebilen bir protein, a uygun süper SILAC standart standart sığır serum albümini karıştırın96 oyuklu bir plaka içerisinde ssay ve 1 dakika süre ile çalkalanır, belirtilen süre boyunca inkübe ve üretici tarafından belirtildiği gibi absorbansı ölçülür. Not: lizat yüksek SDS konsantrasyonu ve ditiotreitol (DTT) protein konsantrasyonunu belirlemek için en uygun deneyleri için bir sorundur. </li><li> Açıklık lizat ve 20 ° C&#39;de 30 dakika 14,000 x g&#39;de filtre ünitesi ve santrifüj üre 200 ul Süper SILAC standart eşit miktarda karıştırılır. 50&#39;den fazla açıklık lizatın ul ve Süper-SILAC standardını kullanmayın. Bu üre kristalleşmez, yani 15 ° C altında kaçının. </li></ol></li></ol> 5. Numune Ayırma ve Protein Digest <ol><li> Sıvı tümörler. <ol><li> % 12 gradyan SDS-PAGE jeli - Ayrı 30 - 4 üzerinde çizgi başına 100 ug toplam protein. Coomassie Mavi O / N ile Leke proteinleri. Su ile sonraki iki yıkar aşırı Coomassie leke çıkarın. </li><li> Jelden her sokağın kesin ve bölmekbakılmaksızın jel boyama desen 23 eşit büyüklükte dilimler halinde. 0.6 ml polipropilen şişe içinde, ayrı ayrı her bir jel dilimlerini işleyin. </li><li> Su ve metanol / su (50:50, h / h), 56 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edilerek, 10 mM DTT ile azaltılması ile jel dilimlerini yıkayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilerek iyodoasetamid 55 mM (IAA) ile jel dilimlerini alkilat. </li><li> Numune işleme adımları arasında, fazla çözücüyü yok ve reaktif çözeltisi alımını artırmak için bir SpeedVac içinde 15 dakika boyunca, asetonitril ve kuru ile dilimleri yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 16 saat süre ile (0.025 M sulu amonyum bikarbonat içinde 12.5 ng / ul), domuz tripsin çözeltisinin minimum miktarda kuru jel dilimlerini rehidrasyon proteaz bölünme yapın. </li><li> Jel dilimi 10 ul su ilave edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 80 ul asetonitril ilave edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 1 dakika boyunca, 15,800 x g&#39;de santrifüjleyin. Ayrı 0.6 ml süpernatant ve mağaza toplayıntüp. </li><li> % 5 formik asit çözeltisi, girdap 65 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 65 ul asetonitril ilave edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 1 dakika için 15,800 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant toplayın ve önceki adımdaki süpernatant ekleyin. Bir vakum yoğunlaştırıcısı kuruyana kadar birleştirilen supernatant buharlaştırın. </li></ol></li><li> Katı tümörler. <ol><li> Doku lizattan SDS&#39;nin uzaklaştırılması için de referans 15 olarak açıklanan aşağıdaki FASP protokolünü kullanır. </li><li> Aşama 5.2.3 tarif edilen birinci santrifüjden sonra 20 ° C&#39;de 20 dakika 14,000 x g&#39;de bir filtre üzerinde, 8 M üre ayrıca 200 ul, ve daha fazla santrifüj ekleyin. Flow-through süzüntü atın. </li><li> 100 ul IAA ilave edilir ve 1 dakika süre ile, 600 rpm&#39;de bir Thermomixer karıştırın. Karanlıkta 20 ° C sıcaklıkta 20 dakika boyunca filtreyi inkübe edin. 20 ° C&#39;de 10 dakika 14,000 x g&#39;de filtre santrifüjleyin. </li><li> Filtre ve cen üre 100 ul ekleyin20 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de trifuge. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> 20 ° C&#39;de 10 dakika 14,000 x g&#39;de filtre ve santrifüj NH4 HCO3 100 ul ekle. Iki kez bu adımı tekrarlayın. </li><li> 40 ul NH4 HCO3 + 1 ul (= 0.4 ug) tripsin ilave edin ve 600 rpm&#39;de 1 dakika için 20 ° C &#39;de Thermomixer karıştırın. 37 ° C&#39;de nemli bir bölmede filtre O / N inkübe edin. Yeni toplama tüpleri filtreyi aktarın. </li><li> 20 ° C&#39;de 10 dakika 14,000 x g&#39;de filtre santrifüjleyin. 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 14,000 g&#39;de NH4 HCO3 ve santrifüj 50 ul filtre ekleyin. Kütle spektroskopisi ölçümü kadar -20 ° C&#39;de elde edilen peptidler saklayın. </li><li> Peptid konsantrasyonu ölçümü için, bir 96-çukurlu plaka içinde elde edilen akış yoluyla ve düzgün triptofan uygun seyreltilerde bir dizi 50 ul dağıtmak. Triptofan floresan ölçün. Elde edilen konsantrasyon dönüştürmetriptofan, 0.1 ug peptid konsantrasyonuna triptofan, 9 ug proteine ​​karşılık gelir. </li></ol></li></ol> 6. Sıvı Kromatografi ve kütle spektrometrik analiziyle <ol><li> Bir sonikasyon banyosu içinde 5 dakika için 30 ul yükleme tamponu peptidler içinde yeniden çözülür. 1 dakika boyunca 15,800 xg&#39;de santrifüj aşağı Spin ve MS otomatik numune şişenin içine net bir çözüm pipetle. </li><li> NanoLC-MS / MS sistemi otomatik numune alıcı ile analiz başına örnek 5 ul enjekte edilir. C18 ön kolonu (5 um gözenek boyutu C18 malzeme ile 0.15 mm iç çap x 20 mm), bir havalandırılmış kolon kurulum veya Kolon öncesi anahtarlama kurulum ya da monte edilen bir ters faz online konsantre edin ve desalt peptidler. </li><li> Bir ters faz C18 Mikrokolonlu ayrı peptidler (0.075 mm İD x 200 mm kendinden dolu 5&gt;% 35 asetonitril, 90 dakikalık bir gradyan vs kullanılarak, örneğin PicoFrit olarak kendi kendine paket nano-sprey sütun 3 um veya daha küçük bir gözenek boyutu C18 malzeme ile 300 nl de.% 0.1 sulu formik asit /Min. Bir nano-sprey iyon kaynağı ile hibrid bir dört kat / Orbitrap kütle spektrometreye Aktarım yıkama sıvısı. </li><li> Bir top15 veriler bağımlı toplama yöntemi (MS m / z aralığı 350 ile peptidler analiz -. 1600, çözünürlük hedef 70.000 FWHM, AGC hedef 1 x 10 6, maksimum dolum süresi 60 milisaniye MS / MS kütle 100 başlatmak, çözünürlük hedef 17.500 FWHM, AGC ., MS / MS eşiği 3 x 10 4 2 x 10 5, maksimum dolum süresi 60 msn hedef ücret devletlere 2 dahil - 5, Normalize Çarpışma Enerji NCE% 25, dinamik dışlama 15 sn). </li></ol> 7. Veri analizi <ol><li> Veri analizi için serbestçe kullanılabilir MaxQuant 16 yazılımını kullanın. Biyoinformatik veri analizi için ayrıntılı bir protokol 16,17 tarif edilmektedir. Analizi için, tek bir deneyde 17 içine bir SDS-PAGE şeritli tüm dilim ham veri dosyaları birleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Walther, T. C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+in+cell+biology.">Mass spectrometry-based proteomics in cell biology.</a> J Cell Biol. 190 (4), 491-500 (2010).</li><li>Lenz, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+methodology+to+improve+proteome+coverage+depth.">Separation methodology to improve proteome coverage depth.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (4), 409-414 (2014).</li><li>Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+large-scale+analysis+of+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Jimenez, C. R., Verheul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics:+from+cancer+biology+to+protein+biomarkers,+drug+targets,+and+clinical+applications.">Mass spectrometry-based proteomics: from cancer biology to protein biomarkers, drug targets, and clinical applications.</a> Am Soc Clin Oncol Educ Book. , e504-e510 (2014).</li><li>Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer+stem+cell+heterogeneity+and+plasticity.">Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity.</a> Cell Res. 22 (3), 457-472 (2012).</li><li>Evans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+iTRAQ:+where+do+we+stand+now.">An insight into iTRAQ: where do we stand now.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (4), 1011-1027 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).</li><li>Malmstr&#246;m, J., Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+targeted+mass+spectrometry+for+protein+biomarker+verification.">Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification.</a> Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 518-525 (2009).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. 41, (2010).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. 8, 309 (2007).</li><li>Liu, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+pipeline+for+biomarker+discovery+of+laser+capture+microdissected+breast+cancer+tissue.">Proteomics pipeline for biomarker discovery of laser capture microdissected breast cancer tissue.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 155-164 (2012).</li><li>Geiger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+as+a+spike-in+standard+in+quantitative+proteomics.">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture as a spike-in standard in quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 6 (2), 147-157 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+sample+preparation+from+formalin+fixed+and+paraffin+embedded+tissue.">Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Sarvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cancer+stem-like+cells+in+small+cell+lung+cancer+are+highly+tumorigenic+and+chemoresistant+but+sensitive+to+a+novel+neuropeptide+antagonist.">CD133+ cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and chemoresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist.</a> Cancer Res. 74 (5), 1554-1565 (2014).</li><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pre-leukaemic+haematopoietic+stem+cells+in+acute+leukaemia.">Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia.</a> Nature. 506 (7488), 328-333 (2014).</li><li>Schaab, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phosphoproteome+analysis+of+human+bone+marrow+reveals+predictive+phosphorylation+markers+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia+with+quizartinib.">Global phosphoproteome analysis of human bone marrow reveals predictive phosphorylation markers for the treatment of acute myeloid leukemia with quizartinib.</a> Leukemia. 28 (3), 716-719 (2014).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 142ra94 (2012).</li><li>Burgess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Boja, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Validation+Considerations+of+Multiplex+Mass+Spectrometry-based+Proteomic+Platforms+for+Measuring+Protein+Biomarkers.">Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers.</a> J Proteome Res. , (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa ilgi ya da diğer konularda hiçbir çatışma var.

Hasta kaynaklı kanser hücre proteomların Kitle spektrometrik profil yeni tanı / öngörü biyomarkerların keşfi için gerekli yanı sıra kanser hücre biyolojisi daha iyi bir anlayış vermek için hangi olabilir yeni potansiyel ilaç hedeflerinin belirlenmesine yol açacaktır. Çeşitli ön-analitik konular bir sağlam ve biyolojik ilgili sonuçlar elde etmek ise, çözülmesi gereken Ancak, bu tür kitlesel spektrometrik analizler, özellikle zorlu vardır. Burada tarif edilen deney akışı, sıvı ve katı tümörlerin, hem hücresel alt popülasyonlannda elde proteomların kantitatif proteomik karakterizasyonu için izin verir. ya da FACS-bazlı hücre sortingor mikro-kesim ile tümör hücrelerinin ilk zenginleştirme tümör mikro-hücreleri ile kirlenmesini önlemek için gereklidir. Ayrıca, bu teknikler bir ilgi hücresel subpopülasyonunun izole sağlar. Son hücre biyolojik çalışmalar iblis varBazı hücresel subpopülasyonunun tümör başlatan özelliklere sahip ve dolayısıyla kanser patogenezinde 19,20 için son derece alakalı olduğunu strated. Kütle spektrometresi son yıllarda daha duyarlı hale geldikçe, kantitatif proteomik analizler, birkaç bin hücrelerden elde edilebilir protein küçük miktarlarda mümkün olan mümkün işlevsel ilgili hücre popülasyonlarının odaklanmak için yapım. Burada sunulan set-up FFPE örneklerinde yeni tanı Biyobelirteçleri tanımlamak ve doğrulamak için kullanılabilir. Dolayısıyla, hala birçok kanser türleri için yeterli sayıda ve kalitede moleküler biyolojik belirteçler eksikliği olduğu tarihe kadar, klinik teşhis iyileştirilmesi için yararlı bir araç bea vaat ediyor. Biyomarkırlar eksik olan zor ayırıcı tanı, önemli örnekleri, akciğer metastazları, intrapankreatik kolanjiosellüler karsinom ve pankreas adenokarsinomaya primer akciğer kanseri arasındaki ayrımcılık vardır, yanı sıra farklıoldukça malign periferik sinir kılıfı tümörleri-benign nörofibromlar ayırt edilmesi. Ayrıca, ve diğerleri proteomik imza sayısal aydınlatılması, genel olarak kanser hücresi biyolojisi okuyan ve kanser hastalarında 21 terapötik tepkinin işaretidir biyolojik işaretleri ortaya çıkarılması için yararlı olabileceğini göstermiştir. Burada yer alan yöntem iki akım dezavantajları zengin manuel Örnek işleme gerekliliği ve nanoLC-MS / MS, alma zamanına ilişkin bir talep vardır. Eski örneğin, 96-kuyu formatları örnek hazırlama hareketli ve robotik işleme kullanılarak ele alınabilir iken, ikincisi kitle spektrometrik satın alma stratejisinde bir değişiklik gerektirecektir. Hedef proteinlerin alt-gruplar, örneğin, tümör sınıflandırması ile ilişkili olabilir ki belirlendikten sonra, bir önemli ölçüde azaltılmış ayrılma çaba ile, bu alt-gruplar için nicel okumalarını sağlayabilir hedef kütle spektrometresi yöntemleri tasarım öngörmektedir, veDolayısıyla buna bağlı olarak azalır, alma zamanına sahip. 24&#39;ten azaltılabilir gereken gerekli alma süresi ise - 36 saat (sıvı tümörler) veya 3 saat (katı tümörler) gibi üzere, 1 saat daha sonra kütle spektrometrisi ve peptidlerin bir basit tek-boyutlu bir ayırma, iç verimle sonuçlanır kazanç hedef kullanılarak ölçüm sonuçlarının önemli iyileştirmeler karşılık gelen, incelenmiş ve biyolojik teknik replika anlamlı sayısını arttırmak için kullanılabilir. Hedeflenen kitle spektrometrik yaklaşımları zaten kanser-ilişkili protein biyolojik belirteç-adayların 22 doğrulanması için uygun bir araç olduğu gösterilmiştir ve onlar doğrulama için ya da rutin klinik kullanımda 23 için potansiyel bir araç olarak umut vaat bir noktaya geliştirilmiştir , 24.

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik ortaya çıkmıştır ve hücre biyolojisi ve translasyonel biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir disiplin şimdi. Binlerce proteinin tek bir kütle spektrometrik deney 1,2 tespit edilebilir bu alandaki teknik ilerlemeler, hücre hatları ve hayvan modellerinde kompleks hücresel süreçlerin çalışma mümkün kılmıştır. Bu, genellikle bir değişiklik 2,3 her türü için zenginleştirme ve veri analizi için sipariş akışlarını gerektirir, ancak benzer bir ilerleme, fosforilasyon ya da ubikitinasyon gibi birçok dönüşüm sonrası modifikasyonların analizi için yapılmıştır. Ayrıca, SILAC dahil olmak üzere kimyasal ve metabolik etiketleme stratejileri, katılımı, insan kanserinde 4 temel hücresel süreçler, tanı biyolojik belirteçler ve potansiyel ilaç hedefleri keşfi için bu yöntem özellikle çekici hale proteinlerin ve PTMS doğru nispi ölçümü sağlar. Bununla birlikte,birçok karşı primer insan kanserlerinin 5 proteomik analizi ile ilgili aşılması gerekmektedir. Her şeyden önce, insan kanser örnekleri, genellikle bağışıklık sistemi hücreleri, fibroblastlar, tümör mikro-e ait çeşitli hücre tiplerinin varlığı nedeniyle hücresel heterojenlik yüksek derecesini göstermektedir. İkincisi, klonal evrim farklı fonksiyonel özelliklere sahip çeşitli hücresel alt popülasyonlar varlığına sonuçlanan, kendi tümörler içinde genetik çeşitliliğe yol açar. Kanser gelişimi ve ilerlemesi gibi (işlevsel son derece alakalı), hücresel alt popülasyonlar proteomik analizi ardındaki itici güçleri olan birkaç kanser kök hücrelerinin mevcut kavramına göre klinik uygulama için ilgili onkojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması için büyük önem olması bekleniyor 6. Üçüncü olarak, yüksek numune miktarlarının setleri kantitatif protein ekspresyon profilleri, genellikle, güçlü bir klinik BIOMAR tanımlanması için gerekli olankers; dayanarak bu gibi hücre çoğalması 4, -, - aynı şekilde uygulanamaz metabolik etiketleme stratejileri ise, bu, örneğin iTRAQ 7 gibi kimyasal etiketleme başarılamaz. Dördüncü olarak, en uygun bir katı tümör örnekleri formalinle sabitlenmiş, bağlı bir protein çapraz bağlarının 8 oluşumu için kütle spektrometrik analizi proteom zorlaştırmaktadır bulunmaktadır. Son olarak, en mevcut proteomik iş akışları zor klinik araştırmalar için ilgili örnek sayı analizi render örnek işleme ve veri toplama önemli miktarda gerektirir, ve yeni iş akışı çağrısında 9,10 paradigmalar. Bu engelleri gidermek için biz kapsamlı kitle spektrometresi analizi için küresel bir iç standart tanıtmak için bir süper-SILAC 14 strateji ile hücresel zenginleştirme için 11 veya lazer yakalama mikrodiseksiyon 12,13 sıralama ya akım-sitometrik hücre birleştiren bir deney düzeneği geliştirdi. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, sıvı ya da katı kanserler ya da elde edilen tek bir insan tümör örneklerinde 8000 proteine ​​kadar ölçmek mümkündür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">660 nm Kit</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:151px;">22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture medium depleted of arginine and lysine</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">88421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution</td>
			<td style="width:181px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialyzed fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:181px;">PAA</td>
			<td style="width:151px;">A15-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diffuser caps for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS-sorter</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">FACSAria III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ionic Detergent Compatibility Reagent</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td>22663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-capture microdissector</td>
			<td style="width:181px;">MMI&#160;</td>
			<td style="width:151px;">cell cut plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LDS buffer&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane slides for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcon YM-30</td>
			<td style="width:181px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">MRCF0R030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0335PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Picofrit Self-Pack Columns</td>
			<td style="width:181px;">New Objective</td>
			<td style="width:151px;">PF360-75-15-N-5</td>
			<td>Mass Spectrometry Column/Emitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reducing agent</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 3 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled arginine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">CLM-2265-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled lysine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">DLM-2640-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, NB Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">3728301</td>
			<td>for in-gel digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">V5111</td>
			<td>for in-solution digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer and solutions</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF,&#160; 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.05 M NH4HCO3</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;5% aqueous formic acid.</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative mass spectrometric profiling of cancer-cell proteomes derived from liquid and solid tumors

Derinlemesine kanser hücresi proteomların analizleri onkojenik patomekanizmaların aydınlatmak için, yanı sıra potansiyel ilaç hedefleri ve teşhis Biyobelirteçleri tanımlamak için gereklidir. Ancak, hasta kaynaklı tümörlerin ve özellikle hücresel alt popülasyonlar kantitatif proteomik karakterizasyonu için yöntemler büyük ölçüde eksiktir. Burada, sıvı ya da katı tümörler ya da elde edilen kanser hücresi alt-popülasyonlarının proteomların analiz edilmesine olanak sağlamıştır deneysel kurulum tarif eder. Bu biyoinformatik veri analizi ve ardından kantitatif Süper SILAC bazlı kütle spektrometresi ile hücresel zenginleştirme stratejileri birleştirerek elde edilir. FACS-sıralayarak ardından sitometri spesifik hücresel alt kümelerini zenginleştirmek için, sıvı tümörler ilk akış tarafından immunophenotyped edilir; katı tümörler için, lazer yakalama mikrodiseksiyon spesifik hücresel alt-popülasyonunu saflaştırmak için kullanılır. İkinci bir aşamada, bir protein, arıtılmış hücrelerinden ekstre edilir ve daha sonra bir tümör-spesifik birlikte,Protein miktarının sağlayan başak-standardı SILAC-etiketli. Elde edilen protein karışımının, jel elektroforezi ya da triptik sindirme ile ve ardından filtre Destekli Numune Hazırlama (FASP) &#39;ye tabi tutulmuştur. Son olarak, triptik peptidler bir melez quadrupole-Orbitrap kütle spektrometresi ile analiz edilir ve elde edilen veriler MaxQuant dahil biyoinformatik yazılım suit ile işlenir. 8000 proteine ​​kadar burada sunulan akışı aracılığı ile tespit edilebilir ve bir hastada elde edilen numunelerde ölçülmüştür ve elde edilen protein ekspresyon profilleri teşhis proteomik imza ya da potansiyel ilaç hedeflerini tanımlamak için hastalar arasında karşılaştırılabilir.

Hastaların sıvı ve katı tümörlerin proteomik profilleme yeni tanı ve öngörü biyomarkerların keşfi için umut verici bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, numune hazırlama işlemi ve kütle spektrometrik analiz numunelerinin karmaşıklığı ve örneklerin büyük setleri doğru protein miktarının ihtiyacı nedeniyle zordur. Yukarıda tarif edilen deney prosedürü, floresans ile aktive edilen hücre sıralama ya da lazer yakalama mikro-kesim ile ya da, ilgi konusu hücrelerin izolasyonu ile başlar. Bu amaçla, bir hastada elde edilen kemik iliği aspiratları veya kan örneklerinden Hücreler, FACS-bazlı sıralama ve hücre lizizi önce ilgili tanımlanan yüzey belirteçleri karşı floresan-etiketli antikorlar ile lekelendi. Doku kesitlerinden hücre alt kümelerine zenginleştirmek için bu birinci lazer yakalama mikro-kesim sağlamak için uygun kaydıraklar üzerinde monte edilmesi gerekir. Bu amaçla, t monteçok uygun bir membran slaytlar üzerinde doku bölümleri ve üreticinin talimatlarına lazer yakalama microdissector göre kullanımı. Alanları ve ilgi hücreleri seçme sağlıklı ve neoplastik doku histomorphology hakkında uygun bilgi gerektirir. Alınan hücreler daha sonra uygun bir toplama tüpüne aktarılır. İlk deneyler, ilgi her yeni doku için yeterli protein miktarlarının (en az 10 ug toplam protein) çıkarılması için gerekli olan doku miktarını tanımlamak üzere yapılmalıdır. Her microdissected numunesi doku liziz tamponu 60 ul ile muamele edilmektedir. Etkin parçalanması için, doku örneklerinden elde edilen hücreler, formalinin neden olduğu protein çapraz bağlar kaldırmak için 1 saat süreyle 99 ° C de bir termomikser içerisinde inkübe edilir ve 3 dakika için ve SDS numune 15 ul ilave edilmesinden sonra sonikasyona tabi gerekir. Santrifüj sonunda temizledi hücresel lizatın toplanmasını kolaylaştırmak olacaktır. I her hastalık içinnterest (sıvı ve katı tümörler) uygun bir Süper-SILAC ölçümü standardı olan 14 tesis edilecek. Uygun bir standart ilgi örneklerde ifade edilen proteinlerin% 90&#39;ından fazlasını temsil etmelidir. Bir miktar standart hazırlanması için, ilgi konusu kanser tipine bağlı hücre hatları ilk önce, protein ekspresyon profillerini belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edilir ve daha sonra, ana bileşen analizi yapılmalıdır. 4 - diferansiyel protein ekspresyonu ile 6 farklı hücre hatları seçilen ve &quot;ağır&quot; arginin ve lizin ile SILAC etiketli olmalıdır. Etiketleme verimliliği nanoLC-MS / MS ile kontrol edilmelidir ve% 98 daha büyük olması gerekmektedir. Daha sonra, hücre çizgileri daha sonra, her bir numune ve SILAC başak standart eşit mol protein miktarlarının karıştırılmalıdır ilgili bir hastada elde edilen örnek ile aynı şekilde lize edilmelidir. O Klinik örneklerin doğru bir protein ölçümü için kritik bir adımf faiz hasta kaynaklı numunelerin ve SILAC başak-in miktar standart ekimolar protein miktarlarının doğru karışımıdır. Kriteri hücrelerinden türetilen lisatların protein konsantrasyonunu belirlemek için, çeşitli protein ölçüm tahlilleri kullanılabilir. Doku türevli hücrelerin hücre lizatları, bir deney lizatı içinde SDS ve DTT konsantrasyonu yüksek olan başa ihtiyaç duyulmaktadır. Hasta türevi örnekleri ve SILAC başak standart protein konsantrasyonları da benzer örneklerin yüzlerce yapımında çok önemli olan doğru karışımı sağlamak amacıyla, ilgili klinik örnekler ile bir araya getirilmeden önce, her zaman ölçülmelidir. Ayrılmış 1D-PAGE 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;de bir Thermomixer ısıtıldı LDS ile karıştırılır sıvı tümörler elde edilen ve daha sonra maruz standart ve lizat örnekleri başak ve jel sindirim eşit miktarlarda karışımı sonra tripsin ile protein. Örnekler eldeDoku Wisniewski ve arkadaşları tarafından belirlenmiş olan FASP yaklaşımı kullanarak SDS kurtarılmış ve tripsin ile sindirilir. 15 Elde edilen triptik peptidler filtre salınan Peptid miktarı, ilk filtre üzerine yerleştirilmiştir, protein miktarlarına göre% 15 ve% 75 arasında değişmektedir doku örnekleri için özel ilgi çeken bir triptofan floresan ölçülmesi ile hesaplanabilir. Bu amaçla triptofan floresan ölçer. Triptofan 1.1 ug, yaklaşık 100 ug peptidin tekabül gibi uygun bir triptofan seyreltme serisi ile karşılaştırma, peptitler ölçülmesini sağlar. Gerekirse, FASP işlem özellikle edilen örnekler nanoLC / MS / MS sistemine 18 üzerine yüklenmeden önce, ters faz C18 (RP-C18) malzeme ile dolu, ticari veya ev yapımı aşama uçları ya da önceden saflaştırılabilir. Kitle-spektometrik analiz, yüksek gerçekleştirilir-resolution, yüksek hassasiyet kütle spektrometresi sistemi. Kısacası, peptid numuneleri, tuzdan arındırılmıştır ve bir RP-C18 Kolon öncesi ile yoğunlaştırılmış ve kütle spektrometresi ile doğrudan bağlanmış bir RP-C18 analitik kolonu üzerinde ayrılır. FASP tarafından işlenen katı tümörlerin (3 saat, RP-C18 geçişlerini - analizi, yeterli derinliği elde etmek için, uzun bir 2, 40 dakika RP-C18 (sıvı tümörler) ve gradyanlar veya tek enjeksiyonları ile SDS-PAGE protein prefractionation bir kombinasyonu ya istihdam ). MS spektrumları kromatografik pik profilleri entegrasyonu ile SILAC çiftleri doğru ölçümü sağlamak için, 70,000 FWHM ya da daha iyi bir çözünürlükte elde edilir. Protein belirlenmesi için, bir top15, veri-bağımlı alma yöntemi peptid ve protein belirlenmesi için peptid MS / MS spektrumları, büyük bir sayı üretmek için kullanılır. Elde edilen ham verilerden, protein kimlik ve miktar bir UniProt Knowledgebas karşı MaxQuant yazılım ile arama veritabanı elde edilirE İnsan Tam Proteome veri tabanının 17. MaxQuant yazılım (güncel sürümü 1.5.0.25), peptidler protein dizi veritabanından silico türetilen spektrumları karşı peptid fragmanı eşleştirme tarafından satın MS / MS spektrumları ile tanımlanmıştır. Aynı zamanda, izotopik profilleri iyon ön-madde kromatografik tutma süreleri yaklaşık ekstre edilir ve entegre pik alanları ışık nispi ölçümü için kullanılır: SILAC etiketlenmesi sureti ile oluşturulan yoğun peptit çiftleri. Peptit kimlikler ve nispi yoğunlukları daha sonra gelen protein özellikleri atanır. Kahraman yazılımı (güncel sürümü 1.5.0.15) daha sonra örnek-örnek karşılaştırmalar, PCA ve hiyerarşik kümeleme dahil MaxQuant işleme sonuçlarının daha aşağısında istatistiksel değerlendirme, gerçekleştirmek için kullanılır. Deney düzeneği biz belirledik açıklanan ve az toplam proteinin mikrogram 30 olarak 8,000 proteinlere kadar sayısal kullanmaSıvı tümörlerinden türetilen. Katı tümör örneklerinden kadar 2500 proteinleri tanımlanmış ve nispeten kısa bir süre içinde, klinik örneklerde yüzlerce analize izin verir ancak 2 saat arasında bir LC gradyanı ile bir av tüfeği proteomik yaklaşımla belirlenebilir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Deneysel iş akışı. Hücresel alt kümesi zenginleştirme, protein izolasyonu temel adımlar, başak-in sıvı ve katı tümörler için gösterilen ölçüm standardı ve kitle-spektrometrik analiz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Hücresel zenginleştirme strategies. FACS sıralama ve LCM. (A) Örnek yolluk stratejisi hücre sıralayıcı tarafından elde edilen bir CD117-lekeli lösemik hücre popülasyonu üzerinde yolluk resmeden. Solid tümör dokusu (B) Lazer yakalama mikrodiseksiyon. 5 Doku kesitleri - 10 um kalınlıkta boyama önce film kaplı membran lam üzerine yerleştirilmiştir. Çıkarları Bölge lazer yakalama mikrodiseksiyon elle seçildi. Ilgi bölge ile mikrodiseksiyon sarı ve mikrodiseksiyon sonra işaretli önce bölümler gösterilmiştir. 50 um bir ölçek çubuğu rakam dahil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> Insan kanser hücre proteomların Şekil 3. Küme analizi. Pr Öğreticisiz küme analiziSıvı ve katı tümörlerin otein sentezleme profilleri hesaplama platformu Kahraman kullanılarak gerçekleştirilmiştir. AC - Adenokarsinom, SCC - Skuamöz hücreli karsinom, SCC-Met - teknik çoğaltmak - baş ve boyun kanseri, R Skuamöz hücreli karsinom metastazı.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors at JoVE.com

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

quantitative-mass-spectrometric-profiling-cancer-cell-proteomes

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K Görüntüleme.  University Medical Center, Göttingen. In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Video: Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Tıp

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Tanımlanması<em&gt; Sleeping Beauty</emLinker-aracılı PCR kullanarak Solid Tümörlerde&gt; Transposon Eklemeler

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

Floresan SapC-DOPS Nanovesicles kullanma Beyin Tümörleri ve Artrit Vivo Optik Görüntüleme

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Katı Örneklerinin From İlköğretim Yumurtalık Kanseri Hücreleri alma için yöntem

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.