Name: detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

Yazarlar, Kanser Genomik ve Karmaşık Hastalıkların Biyo-Bilgisayar Laboratuvarı üyelerine, keskin gözlemsel girdileri ve bu projenin farklı aşamalarında birden fazla tartışmaya katılımları için teşekkür eder. Finansman desteği, İsrail Kanser Derneği 'ni (M.F-M 2017-2019 için ICA hibesi) ve İsrail İnovasyon Otoritesi'nin Kamin hibesini (M.F-M. için) içerir.

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bir hastanın kanının bir tüpte toplanması, sevkıyat ve depolanmasının sıvı biyopsisinde ilk adımlar çok önemli olduğunu. Yanlış kullanım plazmanın kalitesini bozabilir ve bu nedenle sıvı biyopsi sonuçlarına müdahale edebilir47. Bir EDTA kan tüpünde kan örneği toplanırsa, WBC'lerin lizizini önlemek ve genomik DNA'sının plazma48'esalınmasını önlemek için plazmanın kan toplandıktan sonraki iki saat içinde ayrılması gerekir. WBC'ler daha uzun süre tutulursa bir EDTA tüpünde de apoptoz geçirilebilir ve elde edilen cfDNA parçaları plazmadaki orijinal cfDNA'yı kirletebilir48. Plazma ayırmadan önce kan örneğinin yüksek sıcaklığa (>37 °C) maruz kalması veya tüpün aşırı sallanması hemolize neden olur. Sonuç olarak plazmada bir kirletici olarak kalan hemoglobin, kütüphane hazırlığı sırasında olduğu gibi cfDNA'nın aşağı akış süreçlerini etkiler49. Yüksek sıcaklık (>37 °C) bir EDTA kan tüpündeki plazma verimini de etkiler. Bu nedenle, plazmanın bir EDTA tüpünde toplanmasından sonra hızlı bir şekilde ayrılması50, yöntemin kalite kontrolünde önemli bir adımdır. Kan ticari cfDNA veya cfRNA Koruma Tüpünde toplanırsa, koruyucu kimyasal kan toplandıktan hemen sonra kanla karıştırılmalıdır40. Koruyucu kimyasalın düzgün bir şekilde karıştırılmaması plazmada mikroklot oluşumuna yol açar. Bunlar, cfDNA ekstraksiyon işlemi sırasında silika zarlarını bir sütuna tıkar ve cfDNA verimini düşürür. Tüpte kanın orta derecede sallanması hemolize neden olmaz; aşırı titreme bu tüplerde bile hemolize neden olabilir rağmen40. Bu nedenle, bu tüplerin sevkiyatı veya elleçlemesi sırasında aşırı titremeden kaçınılmalıdır. Kan tüplerinin dik konumlarında gönderilmesi önerilir.
Birim plazma başına cfDNA konsantrasyonunun doğru ölçülmesi ve değerlendirilmesi sıvı biyopsisinde önemli bir adımdır, çünkü plazma cfDNA konsantrasyonu fizyolojik ve patolojik süreçlerle doğrudan ilişkilidir51. CfDNA konsantrasyonu kanserli hastalarda sağlıklı deneklere göre daha yüksektir52. İnsan kanında artan cfDNA konsantrasyonu kansere özgü değildir; hamile kadınlar ve transplantasyon alan hastalar da kanlarında yüksek cfDNA konsantrasyonlarına sahip olma eğilimindedir21. İnflamasyon, doku travması, diyabet, miyokard enfarktüsü ve sepsis için artan cfDNA konsantrasyonu seviyesi ile ilişkiler de gösterilmiştir53. Erken evre kanser hastalarında plazma cfDNA konsantrasyonu ileri veya metastatik tümörlü hastalara göre daha düşük olma eğilimindedir. Bu, cfDNA'nın tümör yükü ile doğrudan ilişkisini destekler54. Kandaki cfDNA konsantrasyonu kanser hastalarında 0,5 ile >1000 ng/mL arasında, sağlıklı deneklerde ise 0 ile 100 ng/mL arasında değişmektedir18. Kütüphane hazırlığı için en az 0,5 ng cfDNA gereklidir. Sıralama için minimum talep miktarını elde etmek için, bir kan örneğinin en az 2 mL'si veya 1 mL plazma örneği ile başlayabilirsiniz. Ayrıca, plazma cfDNA ekstraksiyonu sırasındaki teknik hatalar da cfDNA verimini ve ortaya çıkan konsantrasyonu azaltır, böylece gerçek plazma cfDNA konsantrasyonundan sapmaktadır. cfDNA bozulması, EDTA tüplerindeki antikoagülanlar nedeniyle veya plazma örneklerinin çoklu çözülme ve dondurulması işlemi nedeniyle oluşabilir. Lizis işlemi sırasında proteinaz K'nin zayıf bir aktivitesi de düşük cfDNA verimine neden olur. Proteinaz K aktivitesi, yüksek sıcaklıklara uzun süre maruz kalması nedeniyle azalır. CfDNA ekstraksiyon yıkama adımı sırasında% 96-100 yerine düşük konsantrasyonlu etanol kullanımı da düşük cfDNA verimine neden olur. Bu nedenle sıvı biyopsi tekniğinde teknik hatalardan kaçınmak doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmek için önemlidir.
CfDNA'nın nitel analizi, çıkarılan cfDNA örneğinde bulunan DNA parçalarının gerçek dağılımının tahmin edildiği merkezi bir adımdır. CfDNA'nın nicel sonuçları ancak nitel analiz ile saflığını teyit ettikten sonra güvenilirdir. Bu nedenle, DNA parça analizörü testinde oluşturulan ideal bir cfDNA grafiği, 166 bp yakınındaki cfDNA parçalarının ana zirvesinin zenginleştirilmesini ve 332 bp uzunluğa yakın daha küçük bir tepeyi göstermektedir. Bu, çıkarılan cfDNA örneğinin WBC'lerden genomik DNA ile kontamine olmadığını gösterir. Bir parça 7.000 bp'den referans merdivenine (10.380bp) ve ötesine zenginleştirilmişse, bu bir cfDNA örneğinin WBC genomik DNA ile kirlenmesini gösterir. Dna parça boyutu tahmin tahlilinden sonra bir cfDNA örneğinde genomik DNA kontaminasyonu görülürse, örnek 100 bp merdivenli% 2 agarose jel üzerinde çalıştırılabilir ve jel ~150-200 bp aralığında ekslenebilir, ardından jel ekstraksiyon testi. Agarose jel boyutu seçim işlemi sırasında bir miktar cfDNA kaybedilir. Bununla birlikte, NGS kütüphane hazırlama adımı, kütüphaneleri sıralamaya hazırlamak için en az 0,5 ng ve en fazla 1.000 ng giriş DNA materyali gerektirir. Bu nedenle, cfDNA'nın toplam miktarı 0,5 ng'ye eşit veya daha fazlaysa, kütüphane hazırlama adımı için yeterli miktardadır. Ayrıca, bu tür örnekler kütüphane hazırlama işlemini başarıyla geçirir ve ortaya çıkan kütüphane, 125 bp indeks ve adaptör eklenmesi nedeniyle 291 bp'ye yakın büyük bir zirve ve 457 bp'de daha küçük bir tepe gösterir.
NGS veri analizi, NGS tabanlı sıvı biyopsi tekniğinin son adımıdır ve bu adımda mutasyonların ve gen-gen füzyonlarının3,55,56,57 listeleri oluşturulur. Tanımlanan mutasyonlar ve gen-gen füzyonları, kanser mutasyonu manzaraları58 , 59,daha önce karakterize gen mutasyonları60veya gen-gen füzyonları61 ,62,63üzerinde yapılan önceki çalışmalara göre değerlendirilebilir. Bunlar kanser hastalarında prognostik64 ve tanısal7 biyobelirteç görevi görebiliriz. Örneğin, izosirat dehidrogenaz 1 ( IDH1 ) geninde bulunanR132Hmutasyonu ikincil glioblastoma kanserinin belirleyici bir işaret levhasıdır ve ayrıca bu mutasyonun normalde bulunmadığı primer glioblastomdan ayırır65. Ayrıca, kronik miyelojen lösemi (CML), kromozom 9 ve 2261arasında dengeli bir translokasyondan kaynaklanan bcr/ABL1 gen füzyonu ile karakterizedir. BCR/ABL1 geni ve mRNA ve füzyon proteini CML progenitörlerine özgüdür ve bu nedenle tedavi için iyi bir hedef oluşturur66.
İleri tanı, tümörün doğru evrelenmesi ve tedavi takibi kanserin verimli yönetimi için güncel bir stratejidir. Yakın zamana kadar doku biyopsisi tümör dokularının histolojik değerlendirilmesi için altın standart olmuştur. Bununla birlikte, bu alandaki geniş araştırmaların ve teknolojinin ortaya çıkışının ardından, tek bir biyopsinin bir tümörün tüm mutasyonel manzarasını sağlayamadığını ve seri biyopsilerin, özellikle biyopsilerin oldukça invaziv olduğu glioblastoma ve lenfomada, invazivlikleri nedeniyle genellikle pratik olmadığını kanıtlamıştır. Ek olarak, iğne biyopsilerinin yaklaşık% 16'sı prosedürel komplikasyonlarla ilişkilidir67. Ayrıca, yüksek kaliteli genomik profilleme yeterli miktarda doku gerektirir, genellikle iğne biyopsisi ile yerine getirilmeyen bir talep68.
Tümör kaynaklı DNA analiz ederek rutin bir kan örneğinden elde edilen sıvı biyopsilerin, rutin iğne dokusu biyopsi prosedürlerini değiştirdiği veya eklediği tespit edilir12. Plazma yoluyla plazma yoluyla tümör türevi DNA/cfDNA'nın sıvı biyopsisi ile analizi, tümörlerin moleküler profillemesinde minimal invaziv ve etkili bir prosedürdür. Esasen invaziv doğası nedeniyle genellikle geleneksel tümör doku biyopsisi ile ilişkili potansiyel riskler ve komplikasyonlar olmadan zaman içinde seri örnekleme ile tedavi izlenmesine izin verebilir69. Ayrıca, iğne biyopsisini tek bir tümör lezyonunun sıvı biyopsisi ile cfDNA analizi ile karşılaştıran çalışmalar, cfDNA profillemenin bir tümörün birden fazla farklı klonal popülasyon tarafından barındırılabileceğine dair tam bir moleküler heterojenlik sunabileceğini buldu70.
Bununla birlikte, plazma cfDNA tabanlı tanının tümör doku biyopsisi üzerinde birçok avantajı olmasına rağmen, genel klinik uygulamada uygulanabilirliğini engelleyen bazı önemli sınırlamalar vardır. CFDNA bazlı sıvı biyopsi tanısının sınırlamaları, genel prosedürün daha yüksek maliyetini, yüksek kaliteli DNA ihtiyacını ve geniş bir veri analizinin gerekliliği için özel bir biyoinformatikçiyi içerir71. CFDNA analizi ile ilişkili veri yönetimi sorunu nedeniyle, NGS klinikteki hemen uygulamasında da sorun oluşturmaktadır. NGS'nin ortaya çıkardığı veri yönetiminin zorlukları, öncelikle derin sıralamanın içsel arka plan gürültüsü ile tümör72ile ilişkili sapmaları ayırt etmedeki zorluktan kaynaklanmaktadır. Son olarak, sıvı biyopsi testlerinin çoğunluğu için klinik geçerlilik ve faydalı verilerin kullanılabilirliği nedeniyle, şu anda sadece klinik çalışmalar ve temel araştırmalarla sınırlıdırlar13.
Sıvı biyopsi tekniğindeki gelecekteki gelişmeler, biyoloji, fizyoloji, moleküler biyoloji, tahlil teknikleri, veri yönetimi için istatistiksel analiz ve makine öğrenme teknolojisi73,74alanındaki temel araştırmaların birlikte çabaları ile beklenmektedir. Ek olarak, cfDNA biyobelirteç değerlendirmesine dayalı çok sayıda klinik çalışma devam etmektedir ve sonuçları tekniğin geçerliliğini belirlemeye yardımcı olacaktır. Bu birleşik çabalar umarım önümüzdeki beş yıl içinde onkoloji klinik ortamında güçlü bir prognostik, tanı ve tedavi izleme aracı olarak cfDNA analizi yoluyla sıvı biyopsi platformunu kuracaktır70,75.
Sonuç olarak, cfDNA bazlı sıvı biyopsisi, kanser hastalığı yönetiminde yararlı olan genomik biyobelirteçleri tanımlamak için güvenli ve invaziv olmayan bir yaklaşım sunmaktadır. Bununla birlikte, güvenilir ve doğru sonuçlar elde etmek için, kan toplama, plazma / WBC ayırma, cfDNA ekstraksiyonu ve cfDNA nicel ve nitel analiz için standartlaştırılmış protokoller özellikle74,75gereklidir.

Teknolojik gelişmeler yüzlerce kanser genomunun ve transkriptomlarının dizilimine yol açmıştır1. Bu, farklı kanser türleri 2'deki moleküler değişikliklerin manzaralarının anlaşılmasına katkıdabulunmuştur. Bu manzaralar üzerinde yapılan diğer çalışmalar, apoptoz yollarını seri olarak bozarak kanser veya tümör ilerlemesinde rol oynayan sıralı somatik değişiklikler ve gen-gen füzyonları3'ün karakterize olmasına yardımcı oldu4. Bu nedenle, somatik mutasyonlar ve gen-gen füzyonları, belirli bir tümör tip5için tek tek hastalarda biyobelirteç görevi görerek tümörler hakkında bilgi sağlayabilir , mevcut primer tümörlerin prognozunu6olarak tanımlayabilir, ikincil tümörleri moleküler değişikliklere göre kategorizeedebilir 7ve ilaçlanabilir tümör hedeflerini tanımlayabilir8. Bu tür bilgiler kanser hastaları için kişiselleştirilmiş tedavinin seçilmesinde ve olumlu ve olumsuz tedavi yanıtlarının belirlenmesinde kolaylaştırabilir9. Bununla birlikte, tümör dokusunun genomik profillenmesini tanımlamak için tümör materyali elde etmek invaziv bir prosedürdür10. Ayrıca, bir tümör biyopsisi heterojen tümörün sadece küçük bir kısmını içerir; ve bu nedenle, tüm tümörün moleküler profili için temsili olmayabilir11. Seri izleme ve tümör genotipleme, tümör biyopsi prosedürünün invazivliği ve bu prosedürlerden kaynaklanan güvenlik sorunları nedeniyle genellikle mümkün olmayan tümör dokularının tekrar tekrar toplanmasını gerektirir12.
Sıvı biyopsi tekniği ise son on yılda hassas onkolojide büyük ilgi gördü13,14. Esas olarak bu tekniğin invaziv olmamasından ve birden fazla zaman noktasında tekrarlanma olasılığından kaynaklanır, böylece hastalık kursları için kullanımı kolay ve güvenli bir izleme tekniği sağlar15,16. Sıvı biyopsisi, tümör hücrelerinin hızla çoğaldığı ve aynı anda birçoğunun apoptoz ve nekroz geçirdiği bir fenomene dayanmaktadır. Bu, apoptotik hücre kalıntılarının hastaların kanına salınmasına yol açar, apoptoz sırasında kesin boyutlarda kesilen DNA parçaları ile birlikte17. Kanserli olmayan hücrelerin apoptozları da hücresel kalıntılarının kana salınmasına yol açar, ancak bu hücrelerdeki apoptoz oranı tümör hücrelerinden nispeten daha düşüktür18. Sıvı biyopsi tekniğinin mantığı, kanda sürekli dolaşan DNA, RNA, proteinler ve tümör hücreleri14,19 gibi tümörle ilişkili molekülleri yakalamaktır. Bu moleküllerin analizi için Yeni Nesil Dizileme (NGS), dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR), gerçek zamanlı PCR ve enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) dahil olmak üzere çeşitli teknikler20 kullanılabilir. Sıvı biyopsi tekniği, tümör hücrelerinin özellikleri olan biyobelirteçlerin tanımlanmasını sağlar. Bu biyobelirteç molekülleri sadece bir tümörün belirli bölgelerinden değil, tümörün tüm bölümlerinden salınır21. Bu nedenle, sıvı biyopsisinde tanımlanan belirteçler, vücuttaki diğer tümörlere ek olarak, tüm heterojen tümörün moleküler profillemini temsil eder, böylece doku biyopsisi tabanlı tekniğe göre avantajlara sahiptir22.
CfDNA'nın dolaşımdaki kanda birkaç dakika ile 1-2 saat arasında değişen kısa bir yarı ömür süresivardır 23. Ancak cfDNA'nın kısa yarı ömrü, tedavi yanıtı ve dinamik tümör değerlendirmelerini değerlendirerek gerçek zamanlı analizleri kolaylaştırır. Tümörden türetilmiş cfDNA düzeyleri, cfDNA düzeyleri ile sağkalım sonuçları arasında bir ilişki olduğunu gösteren çeşitli çalışmalarla kanıtlanan tümör evresinin / boyutunun prognostikasyonunu göstermektedir24. Ayrıca, çalışmalar cfDNA'nın mevcut tümör belirteçlerinden daha iyi bir tahmin kapasitesine sahip olduğunu kanıtlamıştır25. CfDNA'nın prognostikasyonu kanser tedavisinden sonra daha da belirgindir, tedaviden sonra daha yüksek cfDNA seviyeleri, daha düşük bir sağkalım oranı ve tedaviye direnç ile iyi ilişkilidir. Tedaviyi takiben cfDNA'nın daha düşük seviyeleri genellikle pozitif tedavi yanıtına karşılık gelir. Ek olarak, cfDNA geleneksel algılama yöntemlerine göre tedavi yanıtının erken tespitini kolaylaştırır.
CfDNA, kanserle ilişkili mutasyonların erken teşhis olasılığını arttırır: erken evre hastalık15, semptomların başlangıcı26 ve kanser tanısından önce 2 yıla kadar27. CfDNA birden fazla tümör bölgesinden veya odaklardan salındığı için, analizi temsil ettiği tümör genomunun kapsamlı bir görünümünü sağlar28. Bu nedenle, cfDNA doku örneklerinde kaçırılmış olabilecek somatik mutasyonları tespit etmeyi sağlar29. Tümör içi heterojenlik ve subklonal mutasyonlar binlerce baza yayılan genomik bölgelerin derin dizilimi ile tespit edilebildiğinden, cfDNA'nın analizi farklı genomik imzalara sahip spesifik moleküler alt tiplerin ortaya çıkarılmasına olanak sağlar13. Doku örneği ile benzer düzeyde bilgi elde etmek için birçok katı biyopsiye ihtiyaç duyulacaktı.
Ayrıca, cerrahi tedavi ve/veya kemoterapi sonrası kolon, yumurtalık ve akciğer kanseri gibi lokalize bir hastalığı olan hastalarda cfDNA düzeylerinin kanser nüks ve tedavi sonuçları için güçlü bir prognostik belirteç olduğu gösterilmiştir20. Ayrıca, kolon, meme ve akciğer kanseri olan hastalarda, kandan cfDNA analizleri tümöre özgü değişiklikleri başarıyla tespit edebilir, bu da birkaç ay önceden nüksün kesin tahminine yol açtı13. Ayrıca, anti-EGFR tedavisi alan CRC'li hastalarda KRAS mutasyonları gibi tedavi direnci belirteçleri30; Çeşitli tedaviler ile tedavi sonrası meme kanseri olan hastalarda PIK3CA, MED1 veya EGFR gibi genler için VAF'lar31; ve EGFR hedefli TKIs32 ile tedavi edilen akciğer kanseri hastalarında EGFR T790M direnç mutasyonu cfDNA analizi ile de tanımlanabilir.
Özetle, cfDNA analizi onkoloji alanında hassas biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir13,33. Bu protokolde 3 glioma hastasının kan örnekleri ve 3 sağlıklı kontrolle WBC'lerden genomik DNA ve plazmadan CFDNA elde edildi. Glioma kanserinde, IDH, TERT, ATRX, EGFR ve TP53'teki mutasyonlar, glioma tümörlerinin erken tanısında yardımcı olabilecek, farklı glioma tümörlerini sınıflandırabilecek, bireysel hasta için doğru tedaviye rehberlik eden ve tedavi yanıtını anlayan prognostik belirteçler olarak hizmet vermektedir34,35. Bu genlerin mutasyon durumu kan türevi cfDNA kullanılarak tanımlanabilir. Bu yazıda, glioma kanserindeki mutasyonel değişiklikleri incelemek için kullanılan plazma türevi cfDNA'nın ayrıntılı bir protokolünü sunuyoruz12. Bu makalede açıklanan cfDNA tabanlı sıvı biyopsi protokolü, diğer birçok kanser türünde mutasyonel değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, yeni bir çalışma cfDNA bazlı sıvı biyopsinin 50 farklı kanser türünü tespit36.
Kan örneği toplama, depolama ve sevkiyat bu protokolde çok önemli adımlardır, çünkü bu adımlar sırasında kontrolsüz sıcaklık WBC'lerin lizizine neden olur, WBC'den plazmaya genomik DNA salınması ve prosedürün geri kalanını etkileyen cfDNA örneğinin kirlenmesine neden olur37. Kontrolsüz sıcaklığa bağlı hemoliz, PCR adımları38gibi cfDNA'nın aşağı akış numune hazırlama süreçlerini bozabilir. Serum plazma yerine yüksek oranda germline cfDNA içerir, ancak tümörle ilişkili cfDNA39için büyük bir arka plan gürültüsü sunar. Bu nedenle, tümörle ilişkili cfDNA'yı izole etmek için plazma uygun bir örnektir39. Kan alma tüpü içeren bir pıhtılaştırıcıya çekilen kan, plazmayı ayırmak ve CFDNA kontaminasyonünü önlemek için derhal veya iki saate kadar santrifüjlenmelidir. Bu protokolde, kan alma tüpleri içeren antikoagülanlara alternatif olan özel ticari cfDNA koruma kan alma tüpleri kullanılmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu). Bu özel kan alma tüpleri cfDNA ve cfRNA'yı korur ve WBC'lerin lizizini ortam sıcaklığında 30 güne kadar ve 37 °C'de 8 güne kadar önler. Bu, bir kan örneği sevkiyatı sırasında ve plazma ve WBC ayrılana kadar uygun sıcaklığın korunmasını kolaylaştırır40.
Şu anda üç tür cfDNA ekstraksiyon metodolojisi vardır: faz izolasyonu, silikon-membran bazlı spin sütunu ve manyetik boncuk bazlı izolasyon41. Silikon-membran bazlı spin sütun yöntemi, diğer cfDNA ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla yüksek bütünlüğe sahip yüksek miktarda cfDNA verdi42.
DNA'nın nicel değerlendirilmesi sıvı biyopsisinde temel bir gerekliliktir, kolay uygulanması ve geniş kullanımı için basit, uygun fiyatlı ve standartlaştırılmış bir prosedür geliştirmeye ihtiyaç vardır. CfDNA nicelemesi için yaygın olarak kullanılan üç yöntem spektrofotometrik, florometrik ve qPCR'dir. Florometrik yöntem doğruluk, maliyet ve iletim kolaylığı ile ilgili diğer yöntemlere göre daha iyi kanıtlanmıştır43.
CfDNA'nın bütünlüğü ve saflığı agarose elektroforez veya kılcal elektroforez ile tahmin edilebilir. Agarose elektroforez ne düşük cfDNA konsantrasyonunda hassasiyet gösterir ne de cfDNA'nın hassas parça boyutunu göstermek için yüksek çözünürlüğe sahiptir. Öte yandan, kılcal elektroforez, ilişkili zorlukların üstesinden gelmekle agarose elektroforez üzerinde bir avantaja sahiptir ve bu nedenle araştırmacılar tarafından cfDNA parça boyutu analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokolde, izole edilmiş cfDNA'nın parça boyutu dağılımı otomatik kılcal elektroforez cihazı kullanılarak tahmin edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>G2939BA</td><td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td></tr><tr><td>Adjustable Clip for Priming Station</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5042-1398</td><td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5067-4626</td><td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td></tr><tr><td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td><td>Norgen Biotek Corp.</td><td>63950</td><td>Norgen&#039;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td></tr><tr><td>Chip Priming Station</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-4401</td><td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&amp;mdash; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td></tr><tr><td>Electrode Cleaner Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-9951</td><td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td></tr><tr><td>Filters for Gel Matrix</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>185-5990</td><td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td></tr><tr><td>IKA Basic Chip Vortex</td><td>IKA-Werke GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>MS-3-S36</td><td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue kit</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells&lt;br/&gt; (e.g., bacteria), and many other sources.</td></tr><tr><td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td></tr><tr><td>QIAvac Connecting System</td><td>Qiagen</td><td>19419</td><td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Qubit assay tubes are 500 &amp;micro;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&amp;micro;L to 100 ng/&amp;micro;L.</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Qiagen</td><td>84010</td><td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crushed ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (96&amp;ndash;100%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating block or similar at 56 &amp;deg;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (100%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (adjustable)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

Kanser hastalarının tümörlerindeki mutasyonların belirlenmesi hastalık yönetiminde çok önemli bir adımdır. Bu mutasyonlar tümör tanısının yanı sıra kanser hastalarında tedavi seçimi ve yanıtı için biyobelirteç görevi görür. Tümör mutasyonlarını tespit etmek için mevcut altın standart yöntem, tümör biyopsileri yoluyla tümör DNA'sının genetik testini içerir. Ancak bu invaziv yöntemin tümör mutasyon repertuarının takip testi olarak tekrar tekrar yapılması zordur. Sıvı biyopsisi, tümör mutasyonlarını kullanımı kolay ve invaziv olmayan bir biyopsi yaklaşımı olarak tespit etmek için yeni ve gelişmekte olan bir tekniktir.
Kanser hücreleri hızla çoğalır. Buna paralel olarak, çok sayıda kanser hücresine apoptoz geçiriliyor. Bu hücrelerden elde edilen döküntüler, tümör DNA mutasyonları taşıyan hücresiz DNA (cfDNA) parçaları adı verilen ince parçalanmış DNA parçalarıyla birlikte hastanın dolaşım sistemine salınır. Bu nedenle, sıvı biyopsi tekniği kullanılarak CFDNA bazlı biyobelirteçlerin tanımlanması için kanser hastalarından kan örnekleri toplanır, ardından plazma ve buffy coat ayrılması yapılır. Daha sonra, plazma cfDNA'nın izolasyonu için işlenir ve ilgili buffy kat hastanın genomik DNA'sının izolasyonu için işlenir. Her iki nükleik asit örneği de daha sonra miktarları ve kaliteleri için kontrol edilir; ve yeni nesil dizileme (NGS) teknikleri kullanılarak mutasyonlar için analiz edildi.
Bu yazıda, sıvı biyopsisi için kan alma, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA'nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Plazma Ayırma CfDNA veya cfRNA koruyucu tüplerde toplanan 8,5-9 mL kan, hacim olarak yaklaşık 4 mL plazma verir. EDTA tüplerinde toplanan kandan ayrılan plazma hacmi sıcaklığa bağlı olarak değişebilir. Kan içeren EDTA tüplerinin 37 °C'den yüksek bir sıcaklıkta maruz kalması plazma hacmi veriminin düşmesine yol açar44.
Florometre Tahlil Sonuçları glioma hastalarının her birinin 1 mL plazmasında cfDNA konsantrasyonu #1 sırasıyla 137 ng, 12.#H2 6 ng, 6.52 ng, 2.26 ng ve 2.48 ng olmak üzere #H3 #H1 #3 ve sağlıklı kontroller #H1. Bununla birlikte, glioma hastasında #2 cfDNA konsantrasyonu florometrede tespit edilemeyecek kadar düşüktü. bir kanser hastasının 1 mL plazmasında cfDNA konsantrasyonu 0,5 ila >1000 ng18arasında değişmektedir ve ortalama değeri 20 ng'dir. Sağlıklı kişilerde, cfDNA konsantrasyonu tespit edilemeyen bir konsantrasyondan 16 ng'ye kadar değişir ve ortalama değeri 8 ng45 'tir. 200 μL buffy coat'dan (PBMC) izole edilen genomik DNA yaklaşık 25-50 μg DNA verir.
DNA parça analizörü tahlil sonuçları Daha önceki bir çalışmaya göre, cfDNA, bir hastanın plazmasındaki toplam cfDNA'nın ~% 85'ini oluşturan 166 bp uzunluğunda parçalar halinde zenginleştirilmiştir. Buna karşılık, 332 bp uzunluğunda parçalar% 10'u ve 498 bp uzunluğunda parçalar cfDNA46'nın%5'ini oluşturur. CFDNA parça analizörü tahlil sonuçlarını etkileyen iki ana faktör PBMC'lerden genomik DNA kontaminasyonu ve düşük cfDNA konsantrasyonudur. Şekil 1, cfDNA parçalarının 166 bp'de zenginleştirilmesi ve örnekte genomik DNA kirlenmesinin olmadığı glioma hasta #1 beklenen cfDNA biyoanalizör grafiğini göstermektedir21. Şekil 2, glioma hasta #1 cfDNA'sının NGS kütüphanesi hazırlanmasından sonra parça zenginleştirme grafiğini göstermektedir ve parça zenginleştirme, 125 bp indeks ve adaptörlerin bağlanması nedeniyle 166 bp'den 291 bp'ye kaydırılır. Şekil 3, glioma hasta #2 cfDNA parçalarının çok az zenginleştiğini göstermektedir. Glioma hasta #2 düşük cfDNA konsantrasyonuna rağmen, CFDNA ve PCR amplifikasyon adımlarına NGS adaptörlerinin eklenmesi, parça zenginleştirme grafiğinde görünür cfDNA kütüphanesi zirvesine yol açar Şekil 4. Bu nedenle, kütüphane Şekil 4'tegösterildiği gibi bu düşük konsantrasyon cfDNA örneğinden başarıyla hazırlanmıştır. Şekil 5'te, glioma hasta #3 cfDNA parçalarının 166 bp'ye yakın zirve yaptığı gösterilmiştir, ancak genomik DNA kontaminasyonu da 10380 bp referans merdiven zirvesinin yakınında belirgindir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61449/61449fig01.jpg"> Şekil 1: Glioma örnek #1 cfDNA'nın ideal bir cfDNA parça analizörü test grafiği. 166 bp'de büyük bir zirve, 332 bp'de ise daha küçük bir zirve gözlendi. 10.380 bp'lik üst işarete yakın bir yerde meydana gelen bu örnekte genomik kontaminasyon görülmedi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61449/61449fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61449/61449fig02.jpg"> Şekil 2: Glioma örneğinin ideal bir cfDNA parça analizörü test grafiği #1 cfDNA kütüphanesi. 125 bp yeni nesil sıralama kitaplığı adaptörlerini bir arada tuttuktan sonra, 166 bp ve 332 bp cfDNA parçaları sırasıyla 291 bp'de büyük bir zirve ve 457 bp'de daha küçük bir zirve gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61449/61449fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61449/61449fig03.jpg"> Şekil 3: cfDNA parça analizörü glioma örnek #2 cfDNA'nın test grafiği, 166 bp'de çok küçük bir zirve gösteriyor. CfDNA'nın düşük konsantrasyonu nedeniyle, 166 bp'deki zirve zar zor görülüyordu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61449/61449fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61449/61449fig04.jpg"> Şekil 4: cfDNA parça analizörü glioma örnek #2 cfDNA kütüphanesinin test grafiği. 125 bp yeni nesil sıralama kitaplığı adaptörlerini birleştirmek ve kütüphane hazırlığı sırasında PCR döngülerini gerçekleştirdikten sonra, 166 bp'de zar zor görünen cfDNA zirvesi veya 332 bp ve 498 bp'de tamamen görünmez zirveler açıkça görülüyordu. 291 bp'ye yakın büyük bir zirve mevcuttu ve 457 bp, 623 bp, 789 bp ve 2.500 bp'ye yakın daha küçük bir zirve gözlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61449/61449fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61449/61449fig05.jpg"> Şekil 5: glioma örnek #3 cfDNA'da genomik DNA kontaminasyonini gösteren cfDNA parça analizörü testi. 166 bp'deki küçük bir zirve, üst belirteç (10.380 bp) yakınında cfDNA ve zenginleştirme varlığının genomik DNA kontaminasyonu olduğunu gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61449/61449fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo S1: 1 mL plazma numunelerinin işlenmesi için gereken lizis tamponu ve taşıyıcı RNA (Tampon AVE'de çözünmüş) hacimleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61449/Supplementary_Table_S1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Bu yazıda kan toplama, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA'nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere invaziv olmayan sıvı biyopsi tekniği için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

detection-of-cell-free-dna-in-blood-plasma-samples-of-cancer-patients

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.9K Görüntüleme.  Bar-Ilan University. Bu yazıda kan toplama, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA'nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere invaziv olmayan sıvı biyopsi tekniği için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Video: Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Kanser Araştırmaları

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

22C 3 kullanarak Anti-PD-L1 antikor konsantre biyopsi ve küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda sitoloji örnekleri

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, and nucleic acids originating from normal tissues, but some of these substances also originate from the diseased area. The investigation and analysis of these substances in the body fluids play a pivotal role in the diagnosis of various diseases. Therefore, it is important to accurately separate the required substances, and several techniques are developed to be used for this purpose.
We have developed a lab-on-a-disc type of device and platform named CD-PRIME. This device is automated and has good results for sample contamination and sample stability. Moreover, it has advantages of a good acquisition yield, a short operation time, and high reproducibility. In addition, depending on the type of disc to be mounted, plasma containing cell-free DNA, circulating tumor cells, peripheral blood mononuclear cells, or buffy coats can be separated. Thus, the acquisition of a variety of materials present in the body fluids can be done for a variety of downstream applications, including the study of omics.

This paper describes the application of automated equipment to easily and efficiently separate and collect substances, such as cell-free DNA and circulating tumor cells, from whole blood.

Kanserle İlgili Maddelerin Klinik Örneklerden Otomatik Olarak Ayrılması ve Toplanması

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Isolation of Circulating Cell-free DNA (cfDNA): A Silica-based Membrane Procedure to Extract cfDNA from Blood Plasma of Cancer Patients

Source: Palande, V. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61449" target="_blank">Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a silica-based membrane procedure to isolate circulating cell-free DNA or cfDNA from human plasma sample. The cfDNA is a promising biomarker for cancer diagnosis and assessment.&#160;

Dolaşımdaki Hücresiz DNA'nın (cfDNA) İzolasyonu: Kanser Hastalarının Kan Plazmasından cfDNA'yı Çıkarmak için Silika Bazlı Bir Membran Prosedürü

Source: Palande, V. et al. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a silica-based ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Sinir Sistemi Kanserleri

İn vitro çalışmalar

Automated Capillary Electrophoresis Based Fragment Size Distribution Analysis of cfDNA: A DNA Microchip-based Method to Study Size Distribution of DNA Fragments Isolated from Biofluids

Source: Palande, V. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61449" target="_blank">Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients.</a> J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we analyze the size distribution of cell-free DNA or cfDNA fragments using automated capillary electrophoresis. This technique helps gain insights into the profile of DNA fragments released by cancer cells during apoptosis.

cfDNA'nın Otomatik Kapiler Elektroforez Tabanlı Parça Boyutu Dağılımı Analizi: Biyosıvılardan İzole Edilen DNA Parçalarının Boyut Dağılımını İncelemek İçin DNA Mikroçip Tabanlı Bir Yöntem

Source: Palande, V. et al. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we analyze the size ...