Biz NPY-MRFP cDNA hediye Dr. U. Ashery teşekkür ederim. Biz Dr teşekkür ederim. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani ve mikroskobu ile paha biçilmez yardım için Y. Zilberstein ve görüntü analizleri. Biz de bu yazının eleştirel okuma Dr Joseph Orly teşekkür ederim. Bu çalışma Bilimler Akademisi İsrail tarafından kurulan İsrail Bilim Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir (1139-1112 RS-e için.).

RBL hücre kültür ortamının hazırlanması 1. <ol><li> (Bu durum, örneğin% 1 PEST) yapar (bu% 10 FBS yapar) cenin sığır serumu, 56 ml düşük glikoz Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM), 500 ml karıştırın ve penisilin streptomisin 5.5 mi ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 0.22 mikron gözenek büyüklüğüne ve mağaza ile 500-1000 ml Şişe-Üst Vakum Filtreler kullanarak ortamı Filtre. </li></ol> RBL hücrelerinde 2. Kültür <ol><li> Ya da plakalar veya şişeler içinde, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, RBL hücreleri büyütün. 10 cm plakalar içinde büyüyen RBL hücreleri 10 ml ortam ile takviye edilmiş ve ~ 10 7 hücre / levha konfluent tek tabaka oluşturmak gerekmektedir. </li><li> Hücre tabakası birleştiği yaklaşan zaman, daha düşük bir yoğunlukta kültür Replate. <ol><li> Vakum bağlı steril pastör pipet kullanılarak plaka / şişeden kültür ortamı çıkarın. </li><li> (37 prewarmed hücre tek tabaka durulayınTüm tek tabaka (hacim kültürü plakası / şişenin büyüklüğüne bağlıdır kapsayan ° C),% 0.25 tripsin / EDTA, 10 cm plaka 2 ml) eklenmiştir. Bu hücreleri ayırmak olacaktır. </li><li> Alternatif olarak, fosfat hücre tek tabaka serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden durulama PBS kaldırmak ve / EDTA önceden ısıtılmış (37 ° C), tripsin ekleyin. Bu adım hızlı hücreleri ayırır. </li><li> 37 ° C&#39;de (en fazla 10 dakika) bir kuluçka makinesi içinde tabaka / içine yerleştirilir. </li><li> Onlar müstakil varsa kontrol etmek için optik mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler 10 dakika sonra ayırmak olmadıysa, yavaşça plaka / balona dokunun. </li><li> Hücrelerin süspansiyonu kültürü plakası / şişeye ortamı ilave edin (ortamının hacmi, en azından bir tripsin çözeltisinin hacmi daha büyük 2 misli olmalıdır). </li><li> 25 ° C&#39;de, 200 g, 3 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Orta hücrelerin tekrar. 01:10 hücreleri sulandırmak ve yeni bir kültür çanak tohum. Onlar reac kadar, 48-72 saat inkübe hücrelerih, yaklaşık% 90 birleşir. </li><li> 3 aya kadar (30 pasajlar) için aynı prosedürü (bölüm 2.2.1-2.2.8) tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Transfeksiyon Medya 3. hazırlanması. <ol><li> K-Borular, pH 7, Ca 2 + asetat, 1 mM çözeltisi ve Mg2 + asetat, 100 mM çözelti bir 100 mM çözelti hazırlayın. </li><li> DMEM ortamı kullanılarak 20 mM içine K-Borular, pH 7, 100 mM&#39;lik çözelti ile seyreltilir, 2 arasında nihai bir konsantrasyona kadar 10 uM ve Mg2 + asetat, 100 mM çözeltinin nihai bir konsantrasyona kadar Ca2 + asetat, 1 mM çözeltisi ekleyin mM. </li><li> Potasyum glutamat tartılır ve 128 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için çözeltiye eklenir, iyice karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C&#39;de tutun. -20 ° C&#39;de kalan çözümleri (yani., K-Borular, Ca 2+ asetat, Mg 2+ asetat) tutun. </li></ol> RBL hücrelerinde 4. transfeksiyonu <ol><li> Bir kullanarak plakası / şişesi kültür ortamı çıkarınvakum bağlı steril pastör pipet. </li><li> Tüm tek tabaka kapsamalıdır önceden ısıtılmış (37 ° C) tripsin / EDTA ile hücre mono tabakasının durulayın. 37 ° C&#39;de (en fazla 10 dakika) bir kuluçka makinesi içinde tabaka / içine yerleştirilir. Hücreler, optik mikroskop kullanılarak müstakil varsa kontrol edin. </li><li> Hücrelerin süspansiyonu kültürü plakası / şişeye ortamı ilave edin (ortam hacmi tripsin çözeltisinin hacmine göre en az 2 daha fazla olmalıdır). </li><li> Hemasitometre kullanarak hücre sayısını sayın. </li><li> 25 ° C&#39;de 200 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüj ile 1.5 x 10 7 hücre Pelet. Süpernatantlar atın ve transfeksiyon orta 280 ul ekleyin. 4 mm&#39;lik küvetin içine Reaksiyon karışımı aktarın. </li><li> Ekle NPY-MRFP plazmid 20 ug ve boş kontrol plasmidi ya da bir test plazmid ya da 30 ug. Reaksiyon karışımı nihai hacim 300 ul olmalıdır. </li><li> Hemen 10 dakika süreyle buz üzerine yerleştirin. Kalıntı su ve p gelen küvet silin9 ms 300 V elektroporasyon roceed. </li><li> Ekzositozu ölçümleri için, 300 ul ortam ihtiva eden 24 oyuklu doku kültür tabaklarında hücrelerin hemen Replate. Her bir reaksiyon karışımı (4 x 10 5 hücre) 8 ul ekleyin. Kontrolü için ek oyuklara 4 x 10 5 olmayan transfekte edilmiş hücrelerin ekleyin. En azından her transfeksiyon için her tedavi için kuyu çoğaltmak olması için yeterli kuyuları hazırlayın. </li><li> Zaman atlamalı mikroskopi için, 80 ul ortamı içeren bir 8-iyi odasının borosilikat coverglass sistemi hemen hücreleri Replate. Her bölme için, reaksiyon karışımı (7.5 x 10 4 hücreleri), 1.5 ul ekleyin. (Coverglass merkezinde odaları görüntü kolay coverglass kenarında odaları kullanmaktan kaçınmak için deneyin). NOT: Önemlisi, tüm hücreleri bir tetikleyici cevabını değildir ve bazen time-lapse mikroskopi sayesinde 8-iyi odasının borosi odak kaybı ve sürüklenme bindiğilicate coverglass sistemi. Bu nedenle, her bir transfeksiyon için her bir işlem için en az 8 bölmeleri hazırlar. </li><li> FcεRI aracılı aktivasyonu için hücrelerin duyarlılaştırılması için, ortam (en az 2 saat süreyle IgE ile hücrelerin inkübe) fare DNP&#39;ye özel monoklonal IgE 1 ug / ml ekleyin. </li><li> 18-24 saat sonra hücreler plazmidler ifade onaylamak için bir floresan mikroskop kullanın. MRFP floresan eksitasyon ve emisyon dalga boyları: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP SG- karşılık veziküler yapılar görünmelidir. İlgi ikinci gen, bir floresan etiketi kaynaşır ise aynı hücreler, her iki plasmidin birlikte-sentezlenmesini teyit etmek üzere bir floresan mikroskop kullanılır. Test edilen gen GFP&#39;ye birleştirilmiş Örneğin, GFP floresan eksitasyon ve emisyon dalga boyları: λEx 488, λEm 507 nm. GFP etiketli protein NPY-MRFP ifade eden aynı hücrelerde görünmelidir. </li><li> Ekzositoz ölçümleri için t devamo adım 5 ve zaman atlamalı mikroskopi için, 6. adıma geçin. </li></ol> 5. NPY-MRFP Ekzositoz Ölçme <ol><li> Tyrode tampon hazırlanması: <ol><li> 54 mM KCI, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl ve DDW içinde 8 mM NaH 2 PO 4 içinde bir çözeltisi hazırlandı. İyice karıştırın ve 4 ° C&#39;de saklayın. Bu aşama, 20x Tyrode tamponu ile hazırlanır. </li><li> 20 mM Hepes çözeltisi, pH 7, 1.8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, 5.6 mM glukoz ve DDW içinde Tyrode 20x arasında 1-20 seyreltme hazırlayın ve iyice karıştırın. Bu adım, 1x Tyrode tamponu ile hazırlanır. </li><li> -20 ° C&#39;de 1x Tyrode tamponu ve mağaza alikosu. Tekrarlanan donma ve çözülme kaçının. </li></ol></li><li> 24 plaka kültür ortamının çıkarın ve Tyrode tamponu ile 3 kez yıka. Kontrol kuyularına, 200 ul Tyrode tamponu ilave edilerek uyarılmamış hücreler hazırlayın. </li><li> / Oyuk 20X 10 ul reaktif [(örneğin, 1000 ng / ml DNP-BSA ya da DNP aktive konsantre edildi hazırlanması-HSA (Ag), 200 uM Ca 2 + iyonoforu (örneğin, A23187) ve 20 uM Ca 2 + iyonofor ve 1000 nM 12-O- tetradekanoilforbol-13-asetat (TPA)] bir kombinasyonu. Reaktifler DMSO içinde saklanır ise,% 1 DMSO içeren Tyrode tamponu içinde 20x konsantrasyonu reaktifler sulandırmak. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Bir 96 çukurlu levhaya iyi dikkatle her süpernatantlar kaldır buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kaçının. (Yüzer hücrelerinden salıverildi kimerik peptid NPY-MRFP içerir). </li><li> Her kuyuya% 0.5 Triton X-100 ihtiva eden 200 ul Tyrode tamponu ilave edin ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. (Bu adım hücrelerinden salınan değildi NPY-MRFP kalan içeren hücre lizatları hazırlanması için önemlidir). Hücre lisatlan toplayın ve bir 96 çukurlu levhaya transfer buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kaçının. </li><li> Bir fluoresc kullanılarak hücre süpernatanları ve hücre lizatlarının floresan ölçümüence plaka okuyucu, bir 590-, 20 nm bant genişliği uyarma filtresi ve 635-, 35 nm bant genişliği emisyon filtre kullanarak. </li><li> Serbest NPY-MRFP yüzdesini hesaplayın: NOT: floresan okuyucu önlem keyfi floresan üniteleri (AFU). AFU değerleri makine ve duyarlılık ve transfeksiyon verimliliğine bağlıdır. <ol><li> Boş olarak transfekte RBL hücreleri otofloresans ayarlayın. Toplam floresan her süpernatant AFU (süpernatanlarında ilgili lizatın + AFU ve AFU) bölün ve 100 ile çarpın. </li></ol></li></ol> Ekzositozu 6. Time-lapse Mikroskopi <ol><li> 8-iyi odasının borosilikat coverglass sistemi transfekte hücre / odasının 7.5 × 10 4 Tohum. 18-24 saat sonra, odalar kültür ortamının çıkarın ve Tyrode tamponu ile 3 kez yıkayın </li><li> Her bölmeye Tyrode tamponu 72 ul ekle. 10x konsantrasyon Tyrode tampon içinde aktive edici reaktifler seyreltin. </li> &lt;li&gt; ısıtılmış odasının (37 ° C) ve CO 2 kontrolör (% 4.8) ve 40X veya 63X amacı ile donatılmış bir konfokal floresan mikroskop kullanın. Mikroskop sistemleri açın: cıva lambası, bilgisayar, ve lazerler. Isıtmalı odası deney başlamadan önce doğru sıcaklıkta olduğundan emin olun. </li><li> Isıtmalı odasında odasına yerleştirin ve oda doğru ve istikrarlı yüklü olduğundan emin olun. </li><li> İlgili florofora göre floresan ışığı açın ve transfekte hücreleri görselleştirmek. Söz konusu bir hücreye ağartma ve sitotoksisite en aza indirmek için bu alanda bir kez floresan kapatın. Bu alan 2-3 transfekte edilmiş hücreleri ihtiva etmesi önemlidir. Transfekte hücreler de yayıldı ama birbirlerine dokunmadan değil edilmelidir. </li><li> Gürültü ve doyma gibi toksisite en aza indirmek için (mikroskop bağlı) lazer gücü ayarlayın ve kazanç ayarlamak ve sinyal gürültü oranı değiştirmek için ofset. Hızlı tarama veyader lazer fuar (ortalama 2) süresini en aza indirmek için. </li><li> Bu lazer gücünü azaltarak sağlar, maksimum iğne deliği boyutunu ayarlayın ve uzun bir süre için odaklanmış görüntüleri korumak için. İstenirse Z yığını iki-boyutlu konfokal optik dilim üç boyutlu, gürültü oranı için en iyi sinyal veren 1 havadar ünitesi (AU) iğne deliği boyutunu ayarlamak ve kazanmak ardışık tarama görüntü yeniden için, parametrelerini ayarlamak optik dilim ≤0.7 um z -axes. </li><li> 15-30 sn her edinimi ve 15 dakika toplam satın alma süresi arasındaki süreyi ayarlayın ve görüntüleri elde başlayın. Iktisap 5 dakika sonra zaman serisini duraklatmak. 10x tetikleyici 8 ul ekleyin ve hemen satın devam edin. </li><li> , Resimleri kaydetmek, bir Dekonvolüsyonun yazılımı kullanarak dekonvulasyon gerçekleştirmek ve üç boyutlu görüntüler ve Imaris yazılımını kullanarak bir film yığınları yeniden. </li></ol><ol><li> Imaris yazılımı konfokal floresan mikroskop ile elde edilmiştir açılmış zaman serisi görüntüleri veri alma. Bu yazılım fazla 40 mikroskopi dosyaları okur. Yazılım dosyalarını okuyamaz ise; tif dosyaları ve ithalat dosyalarını dönüştürebilirsiniz. </li><li> Açık veri seti basın düzenlemek sonuna zaman noktaları eklemek için -&gt; set yeni veri Zaman Points ekleyin ve ithalat. </li><li> Yüzey sihirbazı seçeneğini kullanarak MRFP kanalının yüzeyini oluşturun. Varsayılan algoritması seçin. NPY-MRFP kanalını seçin. Gürültüyü azaltmak için düzeltme seçeneği işaretleyin. Küçük detaylar 0.05 um alan ayrıntı düzeyini azaltmak kaybını önlemek için. </li><li> Yoğunluk eşiği ayarlayın. Yeni gri yüzey görüntülenir. &quot;Ayarlar&quot; gidin ve &quot;Merkez noktası&quot; için &quot;Surface&quot; den stili geçiş. </li><li> Seçilen nesnenin özelliklerinde istatistik sekmesine gidin detaylı sekmesini ve özel bir değer suc seçinfloresan yoğunluğu olarak saat, hacim vs. </li><li> Verileri gözden ve değerler görüntüleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Örneğin, iki veya daha fazla bitişik tanecikler, bir daha büyük bir granül olarak ölçülebilir. Ortalama granül boyutu ölçülmesi için granül gerçek sayısı, birleştirilmiş granül boyutunu bölün. </li><li> Excel dosyaları istenen veri setlerini İhracat ve verileri analiz. </li></ol> f

<ol>
	<li>Abonia, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mast+cells+in+eosinophilic+esophagitis.">Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+in+allergy+and+infection:+versatile+effector+and+regulatory+cells+in+innate+and+adaptive+immunity.">Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity.</a> Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).</li><li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+controversial+role+of+mast+cells+in+tumor+growth.">The controversial role of mast cells in tumor growth.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).</li><li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells,+angiogenesis+and+cancer.">Mast cells, angiogenesis and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).</li><li>Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+immunoregulation/immunomodulation.">Mast cells and immunoregulation/immunomodulation.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).</li><li>Vries, V. C., Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators+in+tolerance.">Mast cell mediators in tolerance.</a> Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).</li><li>Kirshenbaum, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+human+mast+cells+arise+from+a+progenitor+cell+population+that+is+CD34(+),+c-kit(+),+and+expresses+aminopeptidase+N+(CD13).">Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13).</a> Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).</li><li>Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells.">Mast cells.</a> Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).</li><li>Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+biology:+introduction+and+overview.">Mast cell biology: introduction and overview.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).</li><li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+mast+cell+activation.">Molecular regulation of mast cell activation.</a> J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).</li><li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+mast+cell+activation.">Molecular regulation of mast cell activation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).</li><li>Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agents+that+release+histamine+from+mast+cells.">Agents that release histamine from mast cells.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).</li><li>Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-dependent+down-regulation+of+antigen-specific+immune+responses+by+mosquito+bites.">Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites.</a> J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).</li><li>Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+evades+the+extracellular+antimicrobial+activity+of+mast+cells+by+promoting+its+own+uptake.">Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake.</a> J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).</li><li>Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+Toll-like+receptor+4+and+mast+cell-dependent+innate+immunity+responses.">Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses.</a> IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).</li><li>Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin+E-Toll-like+receptor+network.">The immunoglobulin E-Toll-like receptor network.</a> Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).</li><li>Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+adenosine+receptors+function:+a+focus+on+the+a3+adenosine+receptor+and+inflammation.">Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation.</a> Front Immunol. 3, 134 (2012).</li><li>Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+mast+cell+mediators+and+the+pathogenesis+of+inflammation.">Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation.</a> Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).</li><li>Caughey, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+proteases+as+protective+and+inflammatory+mediators.">Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).</li><li>Lundequist, A., Pejler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+preformed+mast+cell+mediators.">Biological implications of preformed mast cell mediators.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).</li><li>Metz, M., Maurer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells--key+effector+cells+in+immune+responses.">Mast cells--key effector cells in immune responses.</a> Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).</li><li>Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+a+source+of+multifunctional+cytokines.">Mast cells as a source of multifunctional cytokines.</a> Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).</li><li>Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+regulation+of+mast+cell+exocytosis+by+networks+of+Rab+GTPases.">Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases.</a> J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).</li><li>Stenmark, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rab5+GTPase+activity+stimulates+membrane+fusion+in+endocytosis.">Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis.</a> EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).</li><li>Azouz, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab5+is+a+novel+regulator+of+mast+cell+secretory+granules:+impact+on+size,+cargo,+and+exocytosis.">Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis.</a> J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

Biz ekzositoz için bir raportör gen kullanılarak canlı hücrelerde SG- zaman-lapsed üç boyutlu görüntüleme ile MCs Ekzositoz ve dört (x, y, z, t) boyut sayımsal kantifikasyonunu birleştiren yenilikçi bir strateji tarif. Bu teknik olarak erken olgunlaşma yoluyla Golgi kendi çıkış, ekzositoz yetkinlik ve degranülasyonun satın olarak başlayan bu tür izleme SG- MC fonksiyonu üzerindeki etkileri için protein aileleri tarama sağlar. Birlikte SG- morfometrik ve kinetik karakterizasyonu ile ekzositoz ö...

Direk Hücreler (MC), en iyi, artrit, astım, eozinofilik özofajit, kronik dermatit ve koroner arter hastalığı 3,5 ve anafilaktik şok 1,2 yanı sıra diğer patolojiler gibi alerjik ve iltihabik reaksiyonlarda katılımı için bilinen bağışıklık hücreleri Kanser 3,4. Buna ek olarak, MH&#39;si allogreft toleransı 5,6 uyaran örneğin, bakteri ve parazitlere karşı konak savunmasında ve bağışıklık tepkilerinin bastırılması hem doğuştan ve edinilmiş bağışıklık önemli rol oynamaktadır. AN + / CD117 + pluripotent progenitör hücrelerin CD34 7 gelişen, kemik iliğinden köken. Taahhüt kemik iliği MC ataları kana salınan ve bağ doku ve epitel yüzeylere 8 içinde ağırlıklı olarak lokalize periferik dokulara göç vardır. Olgunlaşma ve terminal farklılaşma sonunda etkisi o altında elde edilirÇevredeki ortam 8,9 içinde f sitokinler. AN olan karşılaşma immunglobulin E (IgE) üretimi sonuçlandı antikorlar yazın bir alerjene (antijen, Ag) tarafından aktive edilebilir. Aynı Ag yeniden maruz kaldıktan sonra IgE bağlı hücre çapraz bağlanması, ardından MC&#39;nin FcεRI reseptörlerine IgE bağlanması, FcεRI birikmesi ve hücre degranülasyonu sonuçlanan bir sinyal akışının başlamasında sonuçları [10,11 gözden] . AN da nöropeptidler 5,12 ile, bağımsız olarak IgE, aktive edilmiş 13, bakteriyel ve viral antijenlerin 14,15, toplu olarak, temel salgı bağışıklık hücreleri ve sitokinler 5,13,12,16 olarak adlandırılır, pozitif yüklü bir dizi peptit toksinlerdir , 17. AN ayrıca inflamatuar yanıtı yükseltmek, kendi serbest aracıların, birçok kişi tarafından aktive edilir. AN immuno ihtiva salgı granülleri (SGS) ile paketlenirBu tür kimaz ve triptaz, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve çeşitli sitokinler ve kemokinlerin 8,9 gibi histamin ve (kemirgenlerde) serotonin vazoaktif aminler, proteoglikanlar, proteazlar da dahil olmak üzere düzenleyici aracılar. Bu aracılar &quot;gitmeye hazır&quot; ve MH&#39;si uygun bir uyaran ile aktive kez, bu arabulucuların dakika 18,19 saniye bir konuda düzenlenen Ekzositoz (degranülasyona) hücrelerden salınır. Bu ilk etkinlik arakidonik asit metabolitlerinin, çoklu sitokinler ve kemokinlerin 20,21,22 de dahil olmak üzere, biyolojik olarak etkili maddeler, geniş bir dizi de novo sentezi ve serbest izlemektedir. Yeni sentezlenen ürünlerin Yayın bağımsız SG sürümü oluşur. Toplu olarak, bu aracılar, erken ve geç faz enflamatuar ve alerjik cevap başlar. Bu nedenle, MC aktivasyonu ve degranülasyonu muhasebe mekanizmalarının anlaşılması teorik ve klinik imp hemortance. genetik birincil ve kültürlü MCs işlemek için zorluk zayıf çözülmesi kaldı MC degranülasyonu yatan mekanizmaları, aydınlatmak için girişimlerini engellemiştir. Ilgi konusu bir gen ile bu sorunun üstesinden gelmek için, biz eş zamanlı olarak transfekte mukozal mast hücre çizgisi, fare bazofilik lösemi bir raportör göre bir deney geliştirildi (RBL) -2H3 (burada RBL olarak anılacaktır) ya da kemik iliğinden elde edilen AN (BMMC&#39;ler), 30 ve nöropeptid Y (NPY), bir SG muhabir olarak, monomerik RFP (MRFP) erimiş. NPY önce diğer sistemlerde endojen SG belirteçleri davranışını özetlemek gösterilmiştir. MRFP floresan duyarsız pH ifadesi çünkü Ayrıca, NPY-MRFP 96 oyuklu plakalar bir floresan plaka okuyucu kullanarak asidik SG- görselleştirilmesi gibi ekzositozu kantitatif bir değerlendirmesini sağlamaktadır. O NPY-MRFP RBL hücrelerinde ve BMMC&#39;ler asidik SG- teslim olduğunu göstermiştir ve hücreler salınırendojen SG kargo (yani, β-heksosaminidaz ve serotonin) 30, 32 yanında düzenlenmiş moda. Bu protokol kendi fenotipik ve RBL hücrelerinde 32 SG özellikleri ve degranülasyonunun fonksiyonel etkisi ilgi tarama genleri izin veren bir yüksek-çözünürlüklü görüntüleme bazlı bir metodoloji sağlar. Özellikle, bu protokol gerçek zamanlı MC SG- izleme ve kendi alanında veya hacim büyüklüğü, sayısı, montaj kinetik, hücre hücre iskeletinin boyunca onların hareket ve farklı koşullar altında plazma zarı ile nihai füzyon kantifizasyonunu. Örneğin, DNP spesifik IgE ile hücrelerin duyarlılaştırılması farklı düzensizlikler altında bir çok-Ag (DNP konjuge serum albümini) ile hücrelerin tetiklenmesi (yani, ağırlık veya mutant gen ekspresyonuna ya da farmakolojik manipülasyonlara fazla ilgi genlerinin yok etme) ve kontrol hücreleri ile mukayese etmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

Direk Hücreler (MC) oluşan önceden ve yeni sentezlenmiş, alerjik iltihap ve bağışıklık mediatörler salgılayarak kendi fizyolojik ve patolojik fonksiyonlarını yerine bağışıklık sisteminin salgı hücreleri bulunmaktadır. MCnin arabulucular alerjik ve bağışıklık yanıtları sonuçlanan birden dokuları ve organları etkiler. MC aracıların sentezi, depolama ve serbest derece düzenlenir. Önceden oluşturulmuş arabulucular plazma zarı ile kaynaştırmak ve düzenlenmiş ekzositoz kendi içeriğini serbest sitoplazmik salgı granülleri (SG) paketlenir. SGS hedeflenen endojen SG aracıların yanında düzenlenmiş bir şekilde serbest bırakılan bir raportör gen ile ilgi konusu bir genin ortak ifadesine dayalı bir protokol, mevcut. protokol MC SG- analizleri ve tetiklenen ekzositoz için biyogeneze kendi zaman çizelgesini takip yüksek çözünürlüklü dört boyutlu konfokal sağlar. Böylece, inter genleri taranması için bu protokolü kullanarakkendi fenotipik ve fonksiyonel etki için est MC SG- ve biyogenezi ve ekzositoz düzenleyen moleküler mekanizmaları deşifre ve ilgili düzenleyici belirlenmesi sağlar. Böylece, sağlık ve hastalık MCs işlevi hesap hücresel mekanizmaları içine daha fazla anlayışlar sağlanmalıdır.

Çünkü MCs düşük transfeksiyon verimi, genetik manipülasyonlar endojen SGS arabulucular tarafından ölçülen ortalama salgılanması çıktılan üzerinde bir etki bırakmak için olası değildir. Bununla birlikte, özel olarak ilgi konusu geni ifade eden hücre popülasyonu izlenmesinde raportör gen NPY-MRFP tam eş-ifade ve aynı hücre ko-transfekte edilmiş plazmid NPY-MRFP sonuçlarının izlenmesi kurarak. Bu nedenle, geleneksel yöntemler ile karşılaştırıldığında, bu deneyde avantajı seçici Ge...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis at JoVE.com

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K Görüntüleme.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder. 

Video: Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Sigara litik Ekzositoz görselleştirme<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Dijital Işık mikroskopi ile Makrofagların gelen

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

' MastCell Knock-in'Fareleri Kullanarak Mast Hücrelerinin İşlevlerini Analiz Etme

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek için Aynı Türden Antikorlar Kullanarak Çift Etiketleme İmmünofluoresans

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.