N.G., Fransız "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" ve Philipp Vakfı'ndan burs alan; R.S., Lucile Packard Çocuk Sağlığı Vakfı ve Stanford NIH/NCRR CTSA ödül numarası UL1 RR025744 tarafından desteklenmektedir; Not: Max Kade Vakfı ve Avusturya Bilimler Akademisi'nden Max Kade Bursu ve Avusturya Bilim Fonu'nun (FWF) Schröder Bursu tarafından desteklenmektedir: J3399-B21; S.J.G., Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin U19 AI104209, NS 080062 ve Kaliforniya Üniversitesi Tütünle İlgili Hastalık Araştırma Programı'ndan destek verdiğini kabul eder; L.L.R., Artrit Ulusal Araştırma Vakfı (ANRF) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi K99AI110645'in desteğini kabul ediyor.

Tüm hayvan bakımı ve deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yönergelerine uygun olarak ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin özel onayıyla gerçekleştirildi.
1. Kemik İliği Türevi Kültürlü Mast Hücrelerinin (BMCMC) Üretimi ve Karakterizasyonu.
Not: Donör BMCMC'ler, alıcı MC eksikliği olan farelerle aynı genetik arka plandaki kemik iliği hücrelerinden üretilmelidir. Erkek kökenli donör BMCMC'ler dişi farelerin engraftmenti için uygun değildir. Kadın kökenli donör BMCMC'ler hem erkek hem de kadın alıcılara başarıyla kazınacaktır.
<ol><li>Kemik İliği Çıkarma.<ol>
<li>Steril fosfat tamponlu salin (PBS) 6 kuyu kültür plakasına (fare başına 1 kuyu) dökün ve buza yerleştirin.</li>
		<li>Diseksiyon aletlerini sterilizasyon için% 70 etanolde ıslatın.</li>
		<li>Donör fareleri karbondioksit (CO2)soluma ve ardından servikal çıkık ile ötenazi edin, ardından farelere manipülasyon yerlerinde% 70 etanol püskürtün.</li>
		<li>Herhangi bir kemik epifizini kesmeden uyluk kemiği, kaval kemiği ve fibula kemiklerini çıkarmak için steril diseksiyon aletleri kullanın.</li>
		<li>Kemikleri bir kümesle sabitlerken, steril makas (veya neşter bıçakları) kullanarak tüm dokuyu kemiklerden kazıyın (ve fibulayı atın). Tüm kemikler toplanana kadar kemikleri PBS'ye buz üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Steril doku kültürü davlumbazında kalan tüm adımları uygulayın. Steril aletler kullanarak, kemikleri epulps ile sabitleyin ve medüller boşluğu ortaya çıkarmak için her iki epifizi de kesin.</li>
		<li>3 ml şırınga ve 30 G iğne ve soğuk yıkama ortamı (Dulbecco Modifiye Kartal Ortası [DMEM] ile desteklenmiş %10 fetal baldır serumu [FCS, ısı inaktive], 2 mM L-glutamin, %1 antibiyotik-antimycotic çözeltisi, 50 μM Β-mercaptoethanol), kırmızı kemik iliğini Petri kabına yıkayın.</li>
		<li>Tekrarlanan nazik aspirasyon ve fırlatma ile yıkanmış kemik iliği hücre kümelerini ayrıştırmak için aynı şırındıcı kullanın.</li>
		<li>Her fareden bir 15 ml santrifüj tüpüne havuz femoral ve tibial kemik iliği. Kemik iliği hücrelerini ve santrifüjleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da yıkamak için tüpü soğuk yıkama ortamıyla doldurun.</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMC'ler Kültür.<ol>
<li>Süpernatantı çıkarın ve 10 ml kültür ortamında peletlenmiş kemik iliği hücrelerini kurtarın (DMEM% 10 fetal baldır serumu ile desteklenir [FCS, ısı inaktive], 2 mM L-glutamin, %1 antibiyotik-antimycotic çözelti, 50 μM Β-mercaptoethanol ve %20 WEHI-3 hücre şartlandırılmış ortam [IL-3 kaynağı olarak; alternatif olarak 10 ng/ml'de rekombinant fare IL-3 kullanın]).</li>
		<li>Hücreleri uygun boyutta doku kültürü şişesine yerleştirin(örneğin,1 fare için T25, 2 fare için T75, vb.).</li>
		<li>Hücreleri kapladıktan 1-2 gün sonra, orta ve süspansiyon hücrelerini (döküntü ve yapışkan hücreleri şişenin dibine yapışarak bırakarak) yeni bir şişeye aktarın ve taze kültür ortamı (10 ml / fare) ekleyin.</li>
		<li>Sonraki haftalarda, hücreleri her 3-4 günde bir besleyin (fare başına 10 ml kültür ortamı ekleyin). 2,5 x 105 -1x 106 hücre/ml arasında hücre yoğunluğunu koruyun. Yapışmayan hücreleri, kültür şişesinde yapışan hücre bulunmayana kadar haftada bir kez yeni bir şişeye aktarın. MC eksikliği olan farelere in vitro tahliller veya gravür için kullanmadan önce hücrelerin olgunluğunu test edin (aşağıya bakın). NOT: BMCMC'lerin tamamen farklılaşması 4-6 hafta sürecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMC olgunluğunun değerlendirilmesi.<ol>
<li>
Akış sitometrisi kullanarak.
		<ol>
<li>Hücreleri (5 x 104-5 x10 5 hücre/durum) buz gibi FACS tamponu (PBS, %0,5 FCS) ile 5 ml polistiren yuvarlak alt tüpte yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj. Aspirate süpernatant.</li>
			<li>Fare önleyici CD16/32 (klon 93 veya 2.4G2) monoklonal antikorları FACS tamponunda 1:200 (2.5 μg/ml) seyreltin. Her pelede 10 μl ekleyin ve kısa bir girdapla yeniden depolanın. Fc bağlamasını engellemek için buzda 5 dakika kuluçkaya yaslanın. NOT: Kalan tüm adımlar için numuneleri doğrudan ışıktan koruyun.</li>
			<li>Seyreltik fitoerythrin (PE) konjuge anti-fare Fc φRI α (klon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) ve floresan izotiyosiyanat (FITC) konjuge anti-fare KIT (CD117; klon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("boyama çözeltisi") veya FACS tamponunda ilgili etiketli izotip kontrol antikorları ("izotip kontrol çözümü").</li>
			<li>Engellenen hücrelerin yarısını adım 1.3.1.2)'den ek bir polistiren yuvarlak alt tüpe bölün ve bir tüpe 20 μl "boyama çözeltisi", diğer tüpe 20 μl "izotip kontrol çözeltisi" ekleyin. Buzda 30 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
			<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da 3 ml buz gibi FACS tamponu ve santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve peleti 1 μg/ml propidium iyodür (PI, ölü hücrelerin tanımlanması için) içeren 300 μl FACS tamponunda yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine geçin (bkz. Şekil 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Toluidin mavisi lekeleme kullanarak.<ol>
<li>1 x 105 hücreyi PBS ile bir kez oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleme ile yıkayın, ardından 200 μl PBS'de hücreleri aspire edin ve yeniden depolayın.</li>
			<li>Hücre süspansiyonunu mikroskop slaydına bağlı hazırlanmış bir sitokunnale aktarın ve bir sitosantrifüj kullanarak sito-santrifüjleme ile devam edin (5 dakika boyunca 40 x g).</li>
			<li>10 dakika boyunca hava kuru kaydıraklar ve pap kalem kullanarak hücrelerin etrafına balmumu daire çizin. Hücreleri kapsayacak şekilde% 0.1 Toluidin mavisi çözelti ekleyin. 1 dakika kuluçkaya yaslanın. Akan musluk suyundaki slaytları 1 dakika yıkayın, ardından 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.</li>
			<li>Montaj ortamını kullanarak kapak hücreleri. Işık mikroskobu analizine geçin (bkz. Şekil 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mast Hücre eksikliği olan Farelerin BMCMC'lerle engraftment.
<ol><li>intradermal (i.d.) enjeksiyonu ile kulak gravür. NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin kulak pinnasına benimsenen transferi için, kulak pinna başına her biri 1 x 106 hücreden (toplam 2 x 106 hücre için) iki enjeksiyon yapmanızı öneririz. BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin kulak pinnaesine intradermal engraftasyonu, pasif kesesel anafilaksi (PCA)24,27modelleri, zehirlere karşı konak savunma 28 ve kronik aşırı duyarlılık (CHS) reaksiyonları29,30dahil olmak üzere birçok modelde birçok araştırmacı tarafından kullanılmıştır.<ol>
<li>Soğuk DMEM'de 4 x 107 BMCMC/ml'de (1 x 106 BMCMC/ 25 μl) hücreleri sayın ve yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 30 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.</li>
		<li>İzofluran kullanarak 4-6 haftalık MC eksikliği olan fareleri uyuşturmak (%2,5 v/v). Anestezinin derinliğini ayak parmağıyla kıstırın, belirtilmişse izofluranları ayarlayın ve işlem boyunca solunum ve ayak parmağı sıkışma tepkisini izlemeye devam edin. Göz kuruluğu önlemek için bir Q ucu ile oftalmik merhem uygulayın.</li>
		<li>İşaret parmağı ile ventral yüzü ortaya çıkarmak ve germek için kulak pinnasının dorsal yüzünde dikey basınç oluşturun.</li>
		<li>Kulak pinnasının ventral yüzünün iki farklı bölgesine iki adet 25 μl id. bmcmc çözelti enjeksiyonu, kulağın ortasına ilk enjeksiyon ve ikinci enjeksiyonu kulak pinna ucuna doğru gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.d. gravürden sonra 4-6 hafta bekleyin. Not: Deneyimlerimize göre, o zamana kadar kulak pinnasının orta kısmındaki MCs / mm2 dermis sayısı genellikle vahşi tip farelerde ilgili konumdakine benzerken, kulak pinnaesinin çevresindeki MCS / mm2 sayıları genellikle ilgili vahşi tip farelerdekilerden önemli ölçüde daha düşüktür27,28. Bu tür MC ile kaplanmış farelerle deneyler tasarlarken bu akılda tutulmalıdır(örneğin,MC işlevi üzerinde olası etkileri olan ajanlar kulak pinnaesinin orta kısmına enjekte edilmeli ve bu tür tedavilerin etkilerinin analizi de o alana odaklanmalıdır).</li>
	</ol></li>
	<li>İntraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile periton kavitesi gravür. NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin periton boşluğuna benimsenen transferi, fare başına 2 x 106 hücreden oluşan bir enjeksiyon gerektirecektir. MC eksikliği olan farelere BMCMC enjeksiyonları, zehirlere karşı konak savunma modelleri 31 veya bakteriyel sepsis32,33 de dahil olmak üzere çeşitli modellerde periton MC'lerin rollerini incelemek için birçok grup tarafından kullanılmıştır.<ol>
<li>Soğuk DMEM'de uygun sayıda hücre sayın ve 1 x 107 BMCMC/ml'de (2 x10 6 BMCMC/ 200 μl) yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 25 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.</li>
		<li>4-6 haftalık MC eksikliği olan farelerin periton boşluğuna 200 μl BMCMC çözeltisinin 1 enjeksiyonunu gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.p. gravürden sonra 4-6 hafta bekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>İntravenöz (yani) enjeksiyon ile gravür. NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelere enjeksiyon yoluyla benimsenen transferi, fare başına 5 x 106 hücrelik bir enjeksiyon gerektirecektir. MC eksikliği olan farelere BMCMC'lerin intravenöz (i.v.) enjeksiyonları, mesane enfeksiyonu34,astım35,akciğer fibrozis36ve antikor aracılı artrit37modelleri de dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde MCC'lerin rollerini incelemek için birçok grup tarafından kullanılmıştır.<ol>
<li>Soğuk DMEM'de uygun sayıda hücre sayın ve 2,5 x10 7 BMCMC/ml'de (5 x10 6 BMCMC/200 μl) yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 30 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.</li>
		<li>İzofluran kullanarak 4-6 haftalık MC eksikliği olan fareleri uyuşturmak (%2,5 v/v). Anestezinin derinliğini ayak parmağıyla kıstırın, belirtilmişse izofluranları ayarlayın ve işlem boyunca solunum ve ayak parmağı sıkışma tepkisini izlemeye devam edin. Göz kuruluğu önlemek için bir Q ucu ile oftalmik merhem uygulayın.</li>
		<li>MC eksikliği olan bir farenin kuyruk damarına (veya alternatif olarak retro-orbital damara) 200 μl BMCMC çözeltisinin bir enjeksiyonunu gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.v. gravürden sonra 12 hafta bekleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Engrafted Mast Hücre eksikliği Olan Farelerin Analizi.
<ol><li>Kulak engraftment analizi.<ol>
<li>Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık.</li>
		<li>Kulak pinnae izole ve 4 °C gece boyunca% 10 (vol/vol) tamponlanmış formalin sabitlemek. Sabit kulak pinnae'yi parafin içine gömün, 4 μm kulak pinnae bölümlerini kesin ve cam slaytlara monte edin.</li>
		<li>Slaytları oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 0.1 Toluidine mavi çözeltisi ile lekeleyin. Slaytları musluk suyunda 1 dakika yıkayın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.</li>
		<li>Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında, ardından hafif bir mikroskop kullanarak pinnae bölümleri başına engrafted MC sayısını sayın. Engrafted farelerin kulak derisindeki MCS'lerin yüzdesini ve dağılımını vahşi tip farelerle karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Periton kavitesi gravür analizi.<ol>
<li>Periton boşluğundaki mast hücreleri sayısının değerlendirilmesi.<ol>
<li>Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık. Periton boşluğunu kırmadan farelerin ventral derisini dikkatlice çıkarın.</li>
			<li>25 G iğne ile donatılmış 5 ml şırınga kullanarak periton boşluğuna 5 ml soğuk veya oda sıcaklığıNDA PBS enjekte edin. Periton hücrelerinin aktive olma riskini azaltmak için soğuk PBS kullanın (peritoneal MC degranülasyonunu veya periton lavaj sıvısındaki bazı MC türevli ürünlerin seviyelerini değerlendirirken bu çok önemlidir). Periton hücrelerini toplamak için 20 saniye boyunca karın masajı yapın.</li>
			<li>Periton lavajını 22 G iğne ile donatılmış 5 ml'lik bir şırınga kullanarak yavaşça emiş yapın. Emişli lavaj hacmini kaydedin (enjekte edilen hacmin% 80'ine kadar iyileşmeyi bekleyin).</li>
			<li>Periton lavaj sıvılarını 5 ml polistiren yuvarlak alt tüpe ve santrifüjü 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da aktarın. Aspirate süpernatant. Peleti 400 μl soğuk PBS'de geri kazan.</li>
			<li>Hemositometre odası kullanarak periton hücrelerinin toplam sayısını sayın. Periton boşluğundaki engrafted MC'lerin yüzdesini ve işaretleyici ifadesini değerlendirmek için hücre süspansiyonunun yarısını akış sitometri analizi için kullanın (adım 1.3.1'de açıklandığı gibi). Mutlak peritonEal GC sayısı elde etmek için toplam periton hücresi sayısını VC'lerin yüzdesiyle çarpın.</li>
			<li>1.3.2.2 adımında açıklandığı gibi kalan hücrelerle bir sitosantrifüjasyon gerçekleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kuru kaydıraklar ve pap kalem kullanarak hücrelerin etrafına balmumu dairesi çizin.</li>
			<li>Filtrelenmemiş May-Grünwald Boyama solüsyonu ile hücreleri 5 dakika örtün, ardından PBS'de her ikisi de oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın. Giemsa lekeli hücreleri deiyonize su ile 1:20 seyreltin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırnın. Slaytları musluk suyunda 2 kez 1 dakika yıkayın, ardından havayla kuru slaytlar.</li>
			<li>Montaj ortamını kullanarak hücreleri kapsar ve ışık mikroskobu kullanarak (en az 400 toplam hücre sayarak) engrafted MCS'lerin yüzdesini hesaplar. Engrafted farelerin periton lavajındaki MCS'lerin yüzdesini vahşi tip farelerle karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mezenterik pencerelerdeki mast hücrelerinin değerlendirilmesi.<ol>
<li>3.2.1 adımında açıklanan periton lavajını takiben, farelerin bağırsak sistemini açığa çıkarmak için periton zarını kesin. Fare başına 4 ila 5 mezenterik pencereyi bir slayda yerleştirin.</li>
			<li>Oda sıcaklığında Karnoy çözeltisinde (3:2:1 vol/vol/vol etanol, kloroform ve buzul asetik asit) slaytları 1 saat sabitleyin. Havayla kuru kayar ve bağırsağı çıkarın (sabit mezenterik pencereler slaytlara bağlı kalacaktır).</li>
			<li>Oda sıcaklığında 20 dk'ya kadar olan preparatları Csaba (Alcian blue/Safranin O) boyama solüsyonu ile lekelenin.<ol>
<li>500 ml Csaba lekesi yapmak için, 100 ml 1 M sodyum asetat çözeltisini 120 ml 1 M HCl ile karıştırarak 500 ml asetat tamponu hazırlayın. Daha sonra, 90 mg Safranin [kırmızı 'olgun MC'leri tanımlar], 1,8 g Alcian mavisi [mavi 'olgunlaşmamış MC'leri tanımlar] ve 2,4 g ferrik amonyum sülfatNH 4Fe(SO4)2'yi 500 ml asetat tamponuna çözün.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında, ardından hafif bir mikroskop kullanarak mezenterik pencere başına engrafted MCS sayısını sayın. Engrafted farelerin mezenterik pencerelerindeki MCS'lerin yüzdesini ve dağılımını vahşi tip farelere karşı karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.V. gravür analizi.<ol>
<li>Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık ve ilgili doku(örneğin akciğer, cilt veya dalak) hasat edin ve 4 °C'de% 10 (vol/ vol) tamponlu formalin'de bir gecede sabitlenin.</li>
		<li>Sabit dokuları parafin içine gömün, 4 μm bölüm kesin ve cam slaytlara monte edin. Slaytları oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 0.1 Toluidine mavi çözeltisi ile lekeleyin. Slaytları musluk suyunda 1 dakika yıkayın, ardından 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.</li>
		<li>Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında bulunur ve ışık mikroskobu kullanarak doku bölümleri başına engrafted MCS sayısını ve dağılımını değerlendirir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

İlk açıklamasından neredeyse30yıl sonra 38 , 'mast cell knock-in' yaklaşımı, MCS'lerin vivo olarak neler yapabileceği veya yapamayacağı hakkında değerli bilgiler sağlamaya devam ediyor. MCS'lerin işlevlerinin uzun zamandır alerjideki rolleriyle sınırlı olduğu düşünülüyordu. ' Mast cellknock-in' yaklaşımı kullanılarak oluşturulan veriler, MCS'lerin diğer işlevlerin yanı sıra, belirli patojenlere karşı konak savunmasında kritik roller oynayabileceğ...

Mast hücreleri (MCS) pluripotent kemik iliği progenitörlerinden kaynaklanan hematopoetik hücrelerdir1-3. Kemik iliği çıkışı sonrasında, MCS progenitörleri, lokal büyüme faktörlerinin etkisi altında olgun MC'lere dönüştükleri çeşitli dokulara göç ederler1-3. Doku bazlı MC'ler, dış hakaretlere karşı ilk savunma hattı olarak davrandıkları cilt, hava yolları ve gastrointestinal sistem gibi konak-çevre arayüzlerinde stratejik olarak bulunur3-6. MC'ler genellikle "temel" fenotipik özelliklerine ve anatomik konumlarına göre alt sınıflandırılır. Farelerde iki tür MC tanımlanmıştır: "bağ dokusu tipi" MCC'ler (CTMC'ler) ve mukozal MC'ler (MBC'ler)1-3,7,8. CTMC'ler genellikle venüles çevresinde ve sinir liflerinin yakınında bulunur ve serosal boşluklarda bulunurken, MPC'ler bağırsak ve solunum mukozasında intraepithelial konumları işgaleder 1-3.
MCs9-13'ünbiyolojik fonksiyonlarını incelemek için çok sayıda metodoloji uygulanmıştır. Birçok grup, hücre hatları (HMC1 14 veya LAD215,16 insan MC hatları gibi), in vitro türevliMC'ler(insan periferik kan türevliMC'ler 17veya fare kemik iliği gibi) kullanarak in vitro yaklaşımlara odaklanmıştır. türetilmiş kültürlü MCS [BMCMC'ler]18, fetal deri türevli kültürlü MC'ler [FSCMC'ler]19 ve periton hücre türevi MC'ler [PCMCs]20) veya farklı anatomik bölgelerden ex vivo izole PCC'ler. Tüm bu modeller, MC aktivasyonunda yer alan sinyal yolları gibi MC biyolojisinin moleküler ayrıntılarını incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, MCS biyolojisinin önemli bir yönü, fenotipik ve fonksiyonel özelliklerinin(örneğin,sitoplazmik granül proteaz içeriği veya farklı uyaranlara yanıt) anatomik konum ve mikroçevrim2,7ile modüle edilebilmesidir. Vivo ile karşılaşılan bu faktörlerin tam karışımı in vitro, VC işlevleri hakkında fikir edinmek için in vivo yaklaşımları kullanmayı tercih ediyoruz9.
Yaygın olarak kullanılan WBB6F1- Kit W/W-v veya C57BL/6-Kit W-sh/W-sh fareler gibi genetik MC eksikliği olan çeşitli fare suşları vardır. Bu fareler, ana MC büyüme faktörü kök hücre faktörü (SCF)21,22için reseptör olan KIT'in (CD117) ekspresyon ve /veya aktivitesinden yoksundur. Sonuç olarak, bu fareler derin bir MC eksikliğine sahiptir, aynı zamanda c-kit mutasyonları (WBB6F1-Kit W / W-v farelerde) veya azaltılmış c-kit ekspresyasyonu ile sonuçlanan büyük kromozomal inversiyonun etkileri ile ilgili ek fenotipik anormalliklere sahiptir (C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh farelerinde)9,10,12,23. Daha yakın zamanda, c-kit-bağımsız constitutive MC eksikliği olan birkaç fare türübildirilmiştir 24-26. Tüm bu fareler ve bazı yeni indüklenen MC eksikliği olan fare türleri son zamanlarda ayrıntılı olarak gözden geçirildi9,10,13.
Burada, fare kemiği iliği türevi kültürlü MC'lerin (BMCMC' ler) üretimi, MC eksikliği olan farelere benimsenen transferleri ve farklı anatomik bölgelerde benimsenen aktarılan MC'lerin sayılarının ve dağılımının analizi için yöntemleri açıklıyoruz. Bu sözde 'mast hücre vurma' yöntemi, MC'lerin ve MC türevi ürünlerin işlevlerini değerlendirmekiçin kullanılabilir. Son yıllarda geliştirilen alternatif yaklaşımlar ışığında bu yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Mast hücreleri (MCS) çeşitli dokularda bulunan hematopoetik hücrelerdir ve özellikle cilt, hava yolları ve gastrointestinal sistem gibi dış ortama maruz kalan bölgelerde bol miktarda bulunur. IgE'ye bağımlı alerjik reaksiyonlardaki zararlı rolleriyle bilinen MCS'ler, zehir ve istilacı bakteri ve parazitlere karşı konak savunmasında da önemli oyuncular olarak ortaya çıkmıştır. MC fenotip ve fonksiyonu anatomik konuma göre ve/veya immün yanıtların gelişim türüne veya evresine göre farklılık gösterebilecek mikroçevroronmental faktörlerden etkilenebilir. Bu nedenle, biz ve diğerleri MC işlevleri hakkında fikir edinmek için in vitro yöntemlere göre in vivo yaklaşımları tercih ettik. Burada, fare kemiğinden türetilmiş kültürlü MCC'lerin (BMCMC' ler) üretimi, genetik olarak MC eksikliği olan farelere benimsenen transferleri ve farklı anatomik bölgelerde benimsenen aktarılan MC'lerin sayılarının ve dağılımının analizi için yöntemleri açıklıyoruz. 'Mastcell knock-in' yaklaşımı olarak adlandırılan bu yöntem, son 30 yılda MCS ve MC türevi ürünlerin işlevlerini değerlendirmek için yoğun olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda geliştirilen alternatif yaklaşımlar ışığında bu yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

'Mast cell knock-in' yaklaşımına genel bir bakış Şekil 1'degösterilmiştir ve BMCMC'lerin neslini, MC eksikliği olan farelere (deneysel tasarıma göre belirtilirse sayı değişebilir) ve enjeksiyon bölgesine bağlı olarak engraftasyon ve deney arasındaki aralığı içerir (bu aralık belirtilirse değişebilir; örneğin,MC sitoplazmik granüllerde depolanan mediatörlerin içeriği zamanla sürekli artar38). Şekil 2'de IL-3 kaynağı olarak %2...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

İn vitro türevli mast hücrelerinin üretimi, mast hücresi eksikliği olan farelere işlenmeleri ve farklı anatomik bölgelerde fenotip, sayılar ve engrafted mast hücrelerinin dağılımının analizi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, masthücrelerinin işlevlerini değerlendirmek için kullanılabilir vivo .

' MastCell Knock-in'Fareleri Kullanarak Mast Hücrelerinin İşlevlerini Analiz Etme

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

analyzing-functions-mast-cells-vivo-using-mast-cell-knock

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

10.2K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine. İn vitro türevli mast hücrelerinin üretimi, mast hücresi eksikliği olan farelere işlenmeleri ve farklı anatomik bölgelerde fenotip, sayılar ve engrafted mast hücrelerinin dağılımının analizi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, masthücrelerinin işlevlerini değerlendirmek için kullanılabilir vivo .

Video: Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.