LMW ve RHK Biyomedikal Bilim ve Mühendislik (GSBSE) bir sources en Enstitüsü tarafından desteklenir; RHK de Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu tarafından desteklenmiştir. Ek finansman Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIH P20-GM103423), Maine Tarım ve Orman Experiment Station (Grant sayısı ME08004-10, Jag), Tide Merkezi (NSF Grant # 1.008.498) Rising Maine ADVANCE Üniversitesi tarafından sağlandı ve phrma temel (Jag) den Farmakoloji / Toksikoloji bir Araştırma Başlatan Grant. Biz Dr teşekkür ederim. Antijen ve hücreler David Holowka ve Barbara Baird. Biz Hina Hashmi, Alejandro Velez ve ekipman ve emirleri ile yardım için Andrew Abovian minnettarız. Bu Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu yayın sayısı 3311 olduğunu.

2004 yılında, Naal ve ark. 1 degranülasyonu yüksek verimlilik testleri için bir mast hücre biyosensör geliştirildi. Bu bizim TCS çalışmaları için uyarlanmış ve bu video ayrıntılı var ki sağlam bir testtir. Önceki Naal ve ark. 1 denemesi, mast hücre degranülasyonu rutin olarak β-heksosaminidaz 59-61 ile değerlendirilir, ancak bu yöntemler, bir erken örnekleme bir anda okunur edildiği Fluorometreler faydalanılmıştır. Önemli olarak, Naal ve ark. onları...

Mast hücreleri son derece astım anahtar arabulucu olarak hizmet immün efektör hücreleri, alerji, parazit savunma ve kanser 13-16 granül vardır. Degranüle için aktif kadar güvenli bir şekilde sitoplazmik granül alerjik ve inflamatuvar mediatörlerin depoladığınız Onlar, hemen her vaskülarize doku 15 bulunur. Degranülasyonunun gibi histamin, triptaz ve lökotrienler 15 olarak farmakolojik olarak aktif mediatörlerin salınımı ile sonuçlanır membrana bağlı granül, en ekzositoz olduğunu. Türü başlatılmasında Bu işlem sonucu ben parazitlere karşı savunma montaj yanı sıra, alerjik astım ve kanserojen yanıtları 15 başlatmada kritik aşırı duyarlılık reaksiyonları. Mast hücreleri ve bazofiller FcεRI reseptörleri, imünoglobulin E (IgE) ve 17 için yüksek afiniteli reseptör çıkarırlar. Bir alerjen ya da antijene maruz kalma çok Ig-bağlı reseptör FcεRI 17 toplama neden olur ve bu stirosin fosforilasyon olaylarını, iç mağazalarından fosfolipaz C kalsiyum akış aktivasyonu ve hücre 18 içine kalsiyum akışı bir çağlayan: degranülasyon işlemi başlatır Ig-bağlı Fc reseptörleri &quot;çapraz bağlama&quot; O-adlandırılır. Bu, kalsiyum girişini degranülasyonu için gerekli olan ve bundan başka, granül ekzositozu 15 neden önce membran ile granül füzyon işaret eder. Deneysel olarak, bir kalsiyum iyonofor yukarı olmak ya da alt akışında bir toksik madde tarafından bir yol hedefin tanımlanması için izin doğrudan aslında tüm sinyal transdüksiyon kalsiyum girişini adımı 20&#39;ye önce adımlar atlar hücre zarı 19 üzerinden servis aracı kalsiyum için kullanılabilir kalsiyum 20 sinyal. Degranülasyon histamin 6 yanında granüller doğrusal bir serbest hücre yüzer içine, β-heksosaminidaz salınımını izleyerek hızlı ve etkili bir şekilde ölçülebilir, ancak, Iin daha kolay tahlil floresan ürünü için basit bir enzim-substrat reaksiyonu ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak tespit etmek. Gibi protokol bölümünde ayrıntılı olarak bu mikro-tahlil ile, β-florojenik substrat bölünme 4-metilumbelliferil-N-asetil-β-D-glucosaminide rakamlarla başlangıçta Naal ve ark. Sağlam bir yöntem, 1 dayanmaktadır heksozaminidaz. Triklosan burada vurgulanır ile Biz, ilaç ve toksik maddelerin test etkileri tahlil değiştirdiniz. Bu yöntem, güvenilir bir degranülasyonu miktarını belirler, örneğin, akış sitometrik-tabanlı algılama yöntemleri 21, pahalı olmayan bir alternatif olan ve anti-alerjik ilaçlar geniş bir yelpazede yüksek verimli tarama için güzel bir şekilde bir aday potansiyeline sahip, yanı sıra immunotoksik veya alerjik kimyasallar. Bu son nokta 21. Yüzyılda 2007 Ulusal Araştırma Konseyi raporu &quot;Toksisite Test ışığında özellikle önemlidir: Bir Vizyon ve bir Stratmadır &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> bu da fareler gibi geleneksel laboratuar hayvanlarının pahalı kullanımını azaltmak için hücre kültürü kullanan yüksek verimli toksikoloji testleri geliştirilmesi için savunmaktadır). Naal ve arkadaşları. 1 tarafından geliştirilen ve bize 2 tarafından değiştirilen degranülasyonunun protokolü, homolog insan mukozal mast hücreleri veya bazofil 3-5 için iyi kabul modeli RBL-2H3 hücre hattı, kullanır. (Kültürlenmesi RBL-2H3 hücreleri için Yöntemler Hutchinson ve ark ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 22). Bu deney, büyük olasılıkla, bağlı mast hücre tipine adapte edilebilir. Triklosan (TCS) hastaneler, kişisel bakım ürünleri ve tüketim malları 23,24 fazla 30 yıldır kullanılan bir geniş spektrumlu antimikrobiyal olduğunu. TCS&#39;nin antimikrobiyal özellik için Tesir inhibe enoil-asil ile muhtemelen, yağ asidi biyosentezi inhibisyonutaşıyıcı protein redüktaz 25,26. Bu tür duş jeli, el kremi, diş macunu, diş macunu, ve% 0.3 ya da 10 mM 24 kadar konsantrasyonlarda sabunda gibi tüketici ürünleri için çok geniş bir yelpazede dünya çapında bulunur. TCS yaygın kullanımı insanlarda 27-29 ve nehir ve akarsu 30 saptanabilir düzeyde sonuçlandı. Allmyr ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. 27 TCS ve metabolitleri plazma ve emziren anneler süt hem de mevcut olduğunu göstermiştir. Önemli olarak, TCS kolayca deri 31-37 emilir. Queckenberg ve ark. 37 mast hücrelerin bulunduğu cilt, önemli konsantrasyonu ile sonuçlanan, 12 saat içinde insan deri içine bir ~ 70 mM TCS krem ~% 10 emilme bulduk. TCS insan alerjik deri hastalığı 7-11 yönetmek için klinik olarak gösterilmiştir, ama TCS alerjik deri hastalıkları hafifletir hangi mekanizma 38 bilinmeyen olmuştur. Floresan mikro testi ayrıntılı açıklamalar yapmak Kullanımıd bu video, son zamanlarda 2 mcM kadar düşük konsantrasyonlarda TCS, önemli ölçüde bu klinik verileri 2 için potansiyel bir açıklama getirmek, mast hücre fonksiyonu ve degranülasyonuna azalttığı göstermiştir. Bu klinik veriler için bir açıklama sağlamak için ek olarak, Palmer vd bulgular. 2 TCS Kalsiyum girişi aşağı sinyal molekülleri hedef olduğunu göstermektedir. Birçok immünolojik ve diğer biyolojik süreçlerde sinyal kalsiyum önemi nedeniyle, TCS potansiyel olarak gerekli biyolojik süreçlerin çok çeşitli olumsuz etkileri olabilir. Aslında, Udoji ve ark. 39 ASR önemli bir doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu, insan doğal katil hücre litik aktivitesini baskıladığı gösterdi. Alerjik deri hastalığı (ya da tam tersine, bir immunotoxicant gibi) bir tedavi aracı olarak potansiyel ötesinde, TCS da Topu 40-49 bir endokrin olabilir. Bu nedenle, çözüm bu kimyasal hazırlamak konusunda net bir prosedür itoksikoloji ilgilendiren s. TCS küçük hidrofobik molekülün olduğu için, organik bir araç genellikle su içinde daha fazla çözünür hale getirmek için kullanılır. TCS test edilmiştir en toksisite çalışmalarında, hazırlama, örneğin etanol, aseton, 2,50,51 veya yağ gibi bir organik çözücü yardımı ile su içinde çözünme yer almıştır. Ancak, çoğu kez bu çözücülerin ve böylece test kimyasal veriler 51 yorumlanması zorlaştıran, kendileri biyolojik olarak aktiftir. Aslında, Rufli et al. 52 ve diğerleri 53, bu akut toksisite deneylerinde test solüsyonları toksisite eserler oluşturmak için kimyasal çözücüler potansiyeli nedeniyle, kimyasal yöntemlere göre fiziksel yöntemler kullanılarak hazırlanır önerilir. Daha önce TCS% 0.24 etanol / su (hacim / hacim) içinde çözüldü ve 30 dakika azaltan RBL mast hücre degranülasyonunu 2 sonike göstermiştir. % 0.24 &#39;den daha yüksek konsantrasyonlarda Etanol mast hücre degra engellemek için gösterilmiştirnulation 54,55-örnekler toksisite çalışmaları organik çözücülerin potansiyel karıştırıcı etkileri. Sadece bu organizma ya da çalışma için kullanılan hücreler üzerinde çözücülerin etkisi dikkate alınması önemlidir, ama aynı zamanda bu test kimyasal kendisinde bir çözücü etkisini izlemek için önemlidir. Örneğin, Skaare ve ark. 51 yağların erime fonksiyonunun tam kaybına yol ise polietilen glikol TCS (genellikle diş macunu ve gargara bulunan) eritilmesi sağlıklı kadın kadınlarda anti-bakteriyel ve anti-plak etkilerini zayıflattı bulundu. Bu nedenle, farklı çözücüler yeteneği TCS da dahil olmak üzere toksik madde ve modüle etmek için ilaç, etkilerini tahlil tasarımında dikkate alınmalıdır. Yağ veya lezzet Katkı maddelerinin kullanımı çeşitli ürünler 50,51 içinde TCS etkilerini etkileyebilir. Organik çözücüler kullanma ihtiyacı ortadan kaldırmak için bir çaba olarak, organik bir sol ve kullanımı ortadan kaldırarak TCS 2 çözülmesi için yöntem üzerine geliştirilmişdelik. Bu protokol, ısı (≤ 50 ° C) ile sulu tampon doğrudan TCS granül çözülür ve daha sonra UV-Vis spektrofotometresi bu TCS stok konsantrasyonu doğrulayın. TCS 40 uM (kadar suda çözünür olduğu için bu gelişmeler mümkündür <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) ve 50 ° C (ısıtıldığında, bozulmaya karşı dayanıklı gösterilmiştir <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. TCS da güçlü 4.200 L / mol / cm 12 molar sönüm katsayısı ile 280 nm 58 de emmek için bilindiği gibi biz de, UV-Vis spektrofotometre yararı var. Bu protokol, düşük maliyetli ve hızlı bir şekilde tesbit de dahil olmak üzere bir organik çözücü yardımı olmadan, bir tampon içine TCS granüller çözmek için basit ama etkili bir yol sağlarkonsantrasyon ve mast hücre degranülasyonu kimyasal etkileri izlenmesi için güçlü bir floresan mikro testi açıklar.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

Mast hücreleri alerjik hastalık ve parazitlere karşı bağışıklık önemli rol oynamaktadır. Bir kez (bir alerjen tarafından gibi) aktif, onlar degranüle, bir süreç bu alerjik aracıların ekzositoz ile sonuçlanır. Ilaç ve toksik maddeler ile mast hücre degranülasyonu modülasyonu insan sağlığı üzerinde olumlu veya olumsuz etkileri olabilir. Mast hücre fonksiyonu fare bazofilik lösemi mast hücrelerinin kullanımı (RBL-2H3), 3-5 insan mukozal mast hücrelerinin yaygın olarak kabul modeli ile ayrıntılı olarak disseke edildi. 6 mast hücrelerinden histamin ile birlikte doğrusal olarak serbest bırakılır, mast hücre granül bileşen ve alerjik aracı β-heksosaminidaz, kolay ve güvenilir için uygun olan bir mikroplaka deneyinde ölçülebilir floresans yoğunluğunu verecek şekilde bir florojenik substrat ile reaksiyon yoluyla ölçülebilir yüksek verimli çalışmaları 1. Başlangıçta Naal ve ark. 1 tarafından yayınlanan, böylece tarama o için bu tahlil degranülasyonu uyarlanmışf ilaç ve toksik maddeler ve burada kullanımı göstermektedir. Triklosan birçok üründe mevcut olan ve bu etkinin mekanizması bilinmemektedir, ancak, insan 7-11 alerjik deri hastalığı tedavi edici bir yardımcı olduğu bulunmuştur geniş spektrumlu bir antibakteriyel maddedir. Burada, mast hücre degranülasyonu üzerinde triklosan etkisi için bir analiz gösterilmektedir. Biz son zamanlarda triklosan güçlü mast hücre fonksiyonu 2 etkilediğini gösterdi. Bir organik çözücü kullanımını önlemek için bir çaba olarak, triklosan ısı ve karıştırma ile bir sulu tampon halinde doğrudan eritildi ve elde edilen konsantrasyon 12 (ε 280 = 4.200 L / M / cm kullanılarak), UV-VIS spektrofotometresi kullanılarak teyit edilir. Bu protokol, daha genel olarak da bir alerjik potansiyel mast hücre degranülasyonunu üzerindeki etkilerini belirlemek için çeşitli kimyasalları ile kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir ve.

50 kadar ısıtıldığında ° C de 90 dakika boyunca, ASR UV Vis absorbans spektrumu Şekil 1 &#39;de gösterilen, 280 nm&#39;de bir zirve ile yaklaşık 260 ve 300 nm arasında güçlü, hafif bir eğri, üretir. 280 nm Molar soğurma katsayısı yayınlanan 4,200 L / mol / cm 12 olduğu için UV-VIS spektrofotometresi, bu nedenle, konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilecek önemli bir araçtır. Biz TCS 50 ° C ısıtma (veriler gösterilmemiştir) ardından, tüm degranülasyonunun deney zaman dilim...

Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast hücre degranülasyonu, alerjik aracıların salınması, alerji, astım ve parazit savunmada önemlidir. Burada degranülasyonunun uyuşturucu ve toksik etkileri değerlendirmek için teknikleri 1 göstermek, yöntem son zamanlarda antibakteriyel madde triklosan 2 güçlü inhibitör etkisi sergilemeye kullandı.

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K Görüntüleme.  University of Maine, Orono.  Mast hücre degranülasyonu, alerjik aracıların salınması, alerji, astım ve parazit savunmada önemlidir. Burada degranülasyonunun uyuşturucu ve toksik etkileri değerlendirmek için teknikleri 1 göstermek, yöntem son zamanlarda antibakteriyel madde triklosan 2 güçlü inhibitör etkisi sergilemeye kullandı. 

Video: A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

Formaldehit maruz bir fare modeli Atopik dermatit yenidoğan kapsaisin tedavi tarafından indüklenen etkileri

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...