Name: voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer at JoVE.com

Biz HL-1 hücreleri ve ayrıntılı bakım protokolü sağlamak için Dr. Claycomb teşekkür etmek istiyorum. Biz de bizim çift kanal optik haritalama sistemi için bazı aksesuarlar yapım ile yaptığı yardım için hücre film ve Sayın Pete Caron üreten ile yardım için Bayan Elena Carrillo ve Dr Seth Robia teşekkür etmek istiyorum. Bu eser (XA 10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478) Amerikan Kalp Derneği, Ulusal Sağlık Enstitüleri (XA HL113640), ve (XA) Loyola Üniversitesi Araştırma Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.

1. Çözüm hazırlanması <ol><li> Norepinefrin (NP) çözeltisi <ol><li> . Saflaştınlmış Milli-Q (MQ), 25 ml su içinde, 30 mM askorbik asit (0,1475 g askorbik asit, 25 ml içine NP 40 mg çözülür norepinefrin (NP) ışığa duyarlı olduğu için bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışığa maruz kaçının. </li><li> 0.22 mikron şırınga filtresi ile NP çözüm Filtre. -20 ° C&#39;de 1 ml steril mikrotüpler içine çözeltisi ve mağaza alikosu. Dondurulmuş sonra, NP, bir ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Tümlenmiş Yıkama ve Son Claycomb medya <ol><li> Claycomb ortamının 43.5 ml ile başlar ve fetal sığır serumu (FBS), 5 ml, penisilin / streptomisin, 0.5 ml, NP, 0.5 ml, 1 ile ek: son takviye Claycomb ortamı 50 ml yapmak için L-glutamin seyreltildi 100. Claycomb orta ışığa duyarlı olduğundan bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışık maruz kalmaktan kaçının. </li><li> Sup aynı tarifi kullanarak yıkayın Claycomb orta hazırlayınhariç eklentilerle Claycomb ortamı% 5 FBS ekleyebilir ve NP ve L-glutamin bileşenleri ihmal. NOT: Doğrudan ışığa maruz kalmadan 4 ° C&#39;de saklandığında takviye Final ve Yıkama Claycomb medya iki hafta için iyi. </li></ol></li><li> Soya fasulyesi tripsin önleyici çözelti <ol><li> Ca-içermeyen ve Mg-içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ml (PBS) içine soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 25 mg eritin. </li><li> 0.22 mikron şırınga filtre kullanarak çözüm Filtre. Not: 4 ° C&#39;de depolandığında steril çözelti, bir ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Jelatin / Fibronektin çanak kaplama çözümü <ol><li> % 0.02 jelatin yapmak için MQ 500 ml su içine jelatin ve 0.1 g. </li><li> Otoklav, ardından% 0.02 jelatin 199 ml fibronektin 1 ml sulandırmak ve hafifçe karıştırın. </li><li> Kısım, -20 ° C&#39;de jelatin ayrı tüplere çözeltisi ve deposunun 6 mi. </li></ol></li><li> Hanks tuz çözeltisi <ol><li> Bir heyecan kullanmalevha, NaCl (136.9), KCI (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409) NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO 4 (0,8142), D-GLC MQ su (mg / L) içinde, aşağıdaki tuzlar eritildi (5,051), NaHCO 3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl2 (1,261). </li></ol></li><li> Kalsiyum duyarlı bir boya (Rhod2) çözeltisi <ol><li> Bir Rhod2 -20 ° C &#39;de stok çözeltisi ve mağaza boya için DMSO içinde% 20, Pluronic F-127 400 ul Rhod2 kuru tozun, 1 mg seyreltin. </li><li> Deneye başlamadan önce, son çalışma çözeltisi için 1.000 Hanks tuz çözeltisi ile: bu stok çözeltisi 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Voltaja duyarlı bir boya (Rh237) çözeltisi <ol><li> -20 ° C de stok çözeltisi ve depolayın DMSO 2 ml Rh237 5 mg seyreltin. Deneye başlamadan önce son bir çalışma çözüm yapmak için 1.000 Hanks &#39;Tuz çözeltisi ile: stok solüsyonu 1 sulandırınız. </li></ol></li></ol> &amp; #160; Not: 4/1 çözüm küçük değişiklikler ile Claycomb HL-1 hücre kültürü protokolüne dayanmaktadır. 2. Pasajlanması ve Kültürleme HL-1 Atriyal miyositlerde lameller üzerine NOT: HL-1 hücreleri, Dr. Claycomb (Louisiana Eyalet Üniversitesi) elde edilebilir. <ol><li> T25 şişelerinde HL-1 hücrelerinin büyümeye ve günlük takviye Claycomb 5 ml ortam ile beslenir. Geçiş T25 hücreleri Claycomb HL-1 hücre kültürü protokolü (aşağıda tarif edilen), 10 göre, her beş günde şişeleri. </li><li> 24 saat T25 şişesi içinde hücreler önce 12 gözlü kültür levhaları içerisine Mermiyi lamelleri (20 mm çapında) pasajlandı ve daha sonra gece boyunca 37 ° C&#39;de jelatin / fibronektin ile lamelleri kapak için tamamen birleşir ve hazır. </li><li> Sonraki gün, aspirat ve kültür plakalarından jelatin / fibronektin atmak ve de her takviye Nihai Claycomb ortamı, 1.5 ml ile değiştirin. </li><li> Bir T25 Kültür Split hücreleraspire birleşik kültürü içeren T25 şişesi ortamı ve 37 ° C &#39;de PBS ile kısa süreli bir kültür durulama 5. günde tam kaynaşmaya eriştikten sonra E şişe. </li><li> PBS aspire ve hücreler ile doğrudan temasını engellemek için T25 şişesi alt üzerine tripsin / EDTA ile pipetleme 37 ° C&#39;de, 3 ml% 0.05 tripsin / EDTA ilave edin. 1 dakika için 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Aspirasyon ile tripsin / EDTA çıkarın ve T25 şişesi başına başka tripsin 1.3 ml / EDTA ekleyin. 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bir mikroskop altında incelemek ve hücreler hala balona bağlı ise, tam kalan hücreleri çıkarmak için dokunun. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine şişeden hücreler ve transfer hücrelere soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 1.3 ml ilave edilir. Yıkama Claycomb 5 ml ortam ile boş bir şişe durulayın. 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde hücrelere durulama ekleyin. 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Yavaşça süpernatant aspire ve santrifüj sonra hücre pelet yeniden askıyatakviye Nihai Claycomb ortamı 6 ml. </li><li> Hücre pasajlayarak hücre süspansiyonu, 0.5 ml, 12-çukurlu bir levhanın her çukuruna Tohum. Günlük taze katkılı Final Claycomb ortamı ile hücreleri besleyin. NOT: yakından hücrelerinin büyümesini izlemek, tipik hücre tek tabakaları günde 4 birleşen durumunu ulaşmak ve spontan aktiviteler görünür kalır. Ardından, kültürlü tek tabakalı günde 4-5 optik haritalama için hazır olacak. </li></ol> Hücreler 3. yükleme kalsiyum ve Voltaja duyarlı boyalar <ol><li> Optik haritalama çalışmaları için, hafifçe 12-yuvalı hücre kültürü plakasının lamel çıkarın ve Hanks tuz çözeltisi ile yıkayın. </li><li> Ca duyarlı bir boya Rhod2 ile hücreleri boyamak için, 3 ml lamel, hücre tekli tabakası inkübe oksijen, 30 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de Rhod2 çalışma çözeltisi (% 5 CO 2/95% O 2 gaz kabarcıkları) . </li><li> V m duyarlı boya hücreleri boyamak içinRh237, başka bir 15 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;de oksijenlenmiş Rh237 hazır çözelti 3 ml Rhod2 yüklü hücre tek tabaka bırakın. </li></ol> 4. Çift Kanallı Optik Haritalama <ol><li> Bir ters floresan mikroskop üzerinde bir sirkülasyon odasına, V m ve Ca boyalarla çift lekeli hücre tek tabaka, yerleştirin. 35 ± 1 ° C&#39;de hücre odasının sıcaklığı tutmak için ısıtmalı sirkülasyon sistemi kullanın. Dikkatle bölmesi üzerinde fazla 0.3 ° C kadar bir gradyan önlemek için bölme içinde dolaşan akım hızını ayarlayarak perfüzat sıcaklığı kontrol eder. <ol><li> V m / Ca sinyallerini kaydetmeye önce, önceki boyama aşamalarına kalan boyayı çıkarmak için yaklaşık 5 dakika boyunca, taze Hanks çözeltisi ile hücre mono tabakasının yıkayın. </li></ol></li><li> Hanks tuz çözeltisi ve bir SILV dolu bir cam pipet oluşan iki kutuplu bir elektrot kullanarak Pace sağlıklı hücre mono tabakalarıer daha önce olduğu gibi pipet sarılı tel 12,17 nitelendirdi. </li><li> Yaklaşık 1 mV bir pacing eşiği bekliyor 2 msn 200-500 milisaniye ve darbe genişliği bir döngü uzunluğunda hızı sağlıklı hücre tek tabakaları. Not: kültüre edilmiş mono tabakaların her parti için, en az iki muamele edilmemiş tek tabakalar, hücre toplu durumunu test etmek için kullanılır. Sağlıklı kontrol mono tabakaları 200-500 msn çevrim uzunlukları elektrik pili tarafından yakalanan gerekir. Kontrol mono tabakalar elektrik tempolu olması halinde, bu, tüm hücre yığın optik haritalama deneyleri için uygun olmayabilir göstermektedir. </li><li> V m ve Ca duyarlı boyalar, her iki tahrik etmek için, bir uyarım filtre (510 nm / 40) ve bir dikroik ayna (561 nm) ile bağlanmış bir LED ışık kaynağını (520 nm dalga boyu) kullanın. <ol><li> V m bileşenine bir dikroik ayna (594 mil) ve bir Ca bileşeni ile 40X objektif ve bölünme yoluyla hücreler tarafından yayılan flüoresans sinyallerini toplamak.Bir bant geçiren filtre ile Ca kanal uzun geçiş filtresi (700 nm) ve yayılan ışık V m kanal yayılan ışığı Filtre (585/40 nm). </li><li> İki CCD kameralar (; redshirt Görüntüleme 80 x 80 piksel, 1,000 fps) kullanarak filtre floresan ışığı toplayın. </li><li> Boya photobleaching önlemek için, ışığa maruz kalma süresini sınırlamak için görüş her alanda en az 2 saniye kayıt olun. Burada, tipik görüntü her tek tabaka için dört farklı alanlarda. </li></ol></li></ol> V m veya Ca Recordings 5. Veri İşleme <ol><li> Hem V m ve Ca sinyalleri (80 x 80 piksel) için, arka plan gürültüsünü azaltmak için farklı kayıt süresi noktalarında bir yoğunluk değerine yoğunluğu yirmi beş (5 x 5) değerleri komşu pikselleri ortalama. NOT: veri ortalamaya sonra, bir bireysel eylem potansiyeli veya Ca geçici her kayıt süresi noktası ortalama x 16 16 yoğunluk değerleri ortalama içeren bir veri matrisi (verir50 um bir mekansal çözünürlükte veri kanalları). </li><li> Kaydedilen V m veya Ca sinyallerinin aktivasyon süresi (AT) tanımlayın. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi tek başına bir eylem potansiyeli veya Ca geçici bir aktivasyon süresi (AT) tanımlamak için, V m veya ısmarlama MATLAB dayalı bir algoritmayı kullanarak Ca sinyallerin tepe genlik% 50 süresini hesaplamak. 12 </li><li> Manuel Program analizi sırasında oluşabilecek hataları ortadan kaldırmak için analiz ATS tashih. </li><li> Matrisin AT tanımlanan depolamak kullanılan yazılım, sırasıyla kaydedilen aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici, (16 x 16 veri kanalları ortalama). </li></ol></li><li> Daha önce küçük değişiklikler 12,18 ile açıklandığı gibi vektör alanı analizi yöntemi kullanılarak AT matrisi üzerinde aksiyon potansiyeli veya kalsiyum geçici iletim hızı (CV) vektörleri hesaplayın. <ol><li> (5 × onun veri noktaları AT çevredeki bir veri kanalı akrabası CV vektör hesaplayın; 5 komşu MATLAB programı 12,18 içinde en az kare algoritması kullanarak) yüzeye AT aktivasyon süreleri (bir düz polinom yüzeyi simüle etmek) veri kanalları ortalama. </li><li> Aşağıdaki formüller kullanılarak iletim vektör hesaplayın Formül 1: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formül 2: θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)] NOT: Ve x- ve y-eksenleri olarak tahmin CV vektörü; dx / dt x ekseninde CV vektör projeksiyonu; dy / dt y-ekseninde CV vektör projeksiyonu. T AT yüzey; x, y koordinatları 2-D bakın; T, x = ∂T / ∂X x göre T kısmi türevi olduğu; T y = ∂T / ∂y y ile ilgili T kısmi türevi olduğu; θ CV vektörü son yönü. </li><li> Pusula on derece sektörünü kapsayan her biri 36 yollara AT matris Grubu, tüm vektörler. &lt;/ Li&gt; <li> 36 iletim yollarının arasında CV vektörlerin en büyük nüfusa içeren yolunu seçin. Tek tabaka CV temsil etmek, bu yolun ortalama CV hesaplayın. </li></ol></li></ol> Wave Front Yayılma 6. Görselleştirme <ol><li> MATLAB kullanarak pik değerine bağlı olarak farklı kayıt zaman noktalarında bağımsız bir aksiyon potansiyelinin veya Ca geçici sinyal şiddetini normalize. </li><li> Geçici kullanılan MATLAB yazılımı 16 x 16 yoğunluk matris içine kaydedilen her zaman noktasında normalleştirilmiş yoğunluk verileri depolamak. </li><li> Surf.m fonksiyonunu kullanarak her kayıt süresi noktasının saklanan yoğunluğu matris bir renk kodlu yoğunluk haritası Construct. NOT: yoğunluk haritasında, kırmızı V m veya Ca sinyallerinin yüksek yoğunluğunu temsil eder ve mavi floresan sinyalleri düşük yoğunluğunu yansıtır. </li><li> Avifile.m işlevini kullanarak bir .avi dosyası oluşturun. </li><li> Tüm i kaydetaddframe.m işlevini kullanarak aksiyon potansiyeli veya Ca geçici farklı kayıt süresi noktalarında ntensity haritalar. NOT: Bu noktada, V m ve Ca yayılma iki ayrı avi dosyaları oluşturulur. </li></ol>

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Salama, G., Hwang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts.">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+imaging+of+membrane+potential+and+intracellular+calcium.">Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium.</a> J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).</li><li>Sowell, B., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+shock-induced+arrhythmias:+role+of+intracellular+calcium.">Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).</li><li>Fast, V. G., Kleber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+conduction+in+cultured+strands+of+neonatal+rat+heart+cells+measured+with+voltage-sensitive+dyes.">Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes.</a> Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).</li><li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+HERG+in+determining+frequency+of+reentry+in+neonatal+rat+ventricular+myocyte+monolayer.">A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer.</a> Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).</li><li>Beauchamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+contributions+of+connexins+40+and+43+to+atrial+impulse+propagation+in+synthetic+strands+of+neonatal+and+fetal+murine+cardiomyocytes.">Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes.</a> Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+L-+and+T-type+Ca2++channels+in+murine+HL-1+cells.">Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).</li><li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-1+cells:+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte.">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li><li>Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+intercellular+coupling+improves+the+function+of+cardiac+pacemakers+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+activation+contributes+to+reduced+connexin43+and+development+of+atrial+arrhythmias.">c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).</li><li>White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+at+the+cellular+level:+use+of+cultured+HL-1+cardiomyocytes+for+studies+of+cardiac+muscle+cell+structure+and+function.">Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).</li><li>Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+causes+electrical+remodeling+in+cultured+atrial+myocytes.">Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).</li><li>Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+inhibition+prevents+pacing-induced+cellular+remodeling+in+a+HL-1+myocyte+model+for+atrial+fibrillation.">Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation.</a> Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).</li><li>Umapathy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogram+fractionation+in+murine+HL-1+atrial+monolayer+model.">Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model.</a> Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).</li><li>Fast, V. G., Cheek, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+arrhythmias+induced+by+strong+electrical+shocks+in+myocyte+cultures.">Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures.</a> Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).</li><li>Bayly, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+conduction+velocity+vector+fields+from+epicardial+mapping+data.">Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Bu makalede, kalsiyum ve gerilim duyarlı floresan boyalar ile boyanmış bir kültür HL-1 atriyal miyosit tek tabaka optik haritalama kilit yönlerini açıklar. Bu, optimal HL-1 hücre tek tabaka, haritalama ekipman kurulumu kültürleme bir kültür tek tabaka eşleme ve veri analizi içerir. Başarıyla kültür hücreleri eşleştirmek için, anahtar düzgün yayılı hücre tek tabaka hazırlamaktır. Lamelleri üzerine hücreleri ekim yaparken, eşit hücrelerini dağıtmak için emi...

Benzersiz kalsiyum (Ca) ve gerilim (V m) çift kanal optik haritalama tekniği 1-5 eşzamanlı sağlam kalpleri ve kültürlü hücre tek tabakalarında hem de V m ve Ca sinyallerini kaydetmek için etkili bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu teknik sayesinde daha iyi kardiyak aritmilerin yatan elektrofizyolojik mekanizmaları anlamak için kalsiyum geçici ve aksiyon potansiyellerinin arasındaki ilişki ile ilgili güçlü bilgi edinmek için yapar. Kültürlenmiş hücre tekli katmanları, kardiyak elektrofizyoloji ve aritmiler altında yatan mekanizma üzerinde çalışmak için yararlı bir hücre modeli olduğunu kanıtlamıştır. 4,6-8 HL-1 hücreleri, iyi karakterize edilmiş atriyal miyosit kültür çizgisidir. HL-1 hücreleri de morfolojik, elektrofizyolojik ve yetişkin atriyal miyositlerin farmakolojik özelliklerini içeren benzersiz farklılaşmış genotip ve fenotip korumak. Bu hücreler importa dahil olmak üzere kalp genleri ve proteinleri ekspresent kardiyak iyon kanalları (örneğin, L- ve T-tipi kalsiyum kanalları) 9 ve sarkomerik kontraktil proteinlerin olgun izoformları normal diğerleri gibi yetişkin atriyal miyositlerde bulunan ve daha önce de bildirilmiştir. 10-13 Buna ek olarak, HL-1 hücreleri olabilir 2-boyutlu (2-D), miyosit mono-katman oluşturmak için kültürlendi. Bu nedenle, kültürlenmiş HL-1 tek tabakaları kullanılmasının avantajları şunlardır: 1) göreceli olarak düşük bir maliyet ve kolay bir izole edilmesi ve birincil yenidoğan miyositleri kültür daha miyosit kültür satır elde etmek için; 2) hücrelerinin konfluent tek tabaka kalbin 3-B yapısından kaynaklanan yapısal karmaşıklığı azaltır; 3) Bir hücre tek tabaka sağlam kalbinde meydana interstisyel fibrozis girişim ortadan kaldırabilir. Bu fibroblast ve arası matris müdahalesi olmadan miyositler bir grup özel elektrofizyolojik fonksiyonlarını incelemek için de kullanılabilir; Cul farmakolojik veya genetik manipülasyon fonksiyonel sonuçları 4) değerlendirilmesiYapılandırılmış hücre mono tabakaları etkili bir şekilde elde edilebilir. Bu nedenle, HL-1 hücreleri miyosit fizyolojisi farklı yönlerini yanı sıra pili kaynaklı anormal elektriksel faaliyetleri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücresel model haline gelmiş. Harici cevap 13-16 Ancak, özel işlem ve bakım kültürü için gerekli sağlıklı hücre tek tabakaları Optik haritalama çalışmaları için elektrik pili. Buna ek olarak, ikili floresan boya boyama işlemi kolayca kültüre karışan hücre monokatmanlarından bütünlüğünü zarar verebilir. Böylece, kültürlü HL-1 mono tabakaları performans V m / CA çift kanallı optik haritalama büyük bir mücadele olmuştur. Bu yöntemin amacı, başarılı bir şekilde kültür HL-1 tek katmanlarda çift kanal optik eşleme gerçekleştirmek için temel aşamalarının temin edilmesidir. Burada HL-1 hücre tek tabaka hazırlanması, bir kültür hücre tek tabaka çift kanal optik haritalama ve haritalama veri işleme için optimize edilmiş protokol kapsamlı detaylar sağladı.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 dry powder</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronic</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

Optik haritalama kalpleri ex vivo hem sağlam ve kültürlü miyosit mono tabakaları kardiyak elektriksel aktiviteyi tespit etmek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. HL-1 hücreleri, yaygın olarak kalp fizyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için bir 2-boyutlu hücresel bir model olarak kullanılmıştır. Ancak, bir kültür HL-1 atriyal hücre tek tabaka içinde aynı görüş alanında aynı anda optik haritası kalsiyum (Ca) geçici ve aksiyon potansiyelleri büyük bir sorun olmuştur. Özel kullanım ve bakım elektriksel yakalanan ve optik eşlenebilir sağlıklı hücreleri hazırlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenle, biz çift kanallı optik haritalama için optimal çalışma protokolü geliştirdik. Bu yazıda, çift kanallı optik haritalama deneyi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak tarif var. Bu protokol aritmi gelişiminde aksiyon potansiyeli yayılması ve Ca kinetik anlayışı geliştirmek için bir araçtır.

Film 1 gösterildiği gibi bir kültür birleşik tek tabaka düzenli bir içsel ritmi sergiler. Biz o zaman tam konfluent HL-1 tek tabaka V m / Ca çift kanallı optik haritalama gerçekleştirdi. Şekil 1A kaydedilmiş bir tek V m ve Ca sinyallerinin örnek izlerini göstermektedir yendi. Eşit yayılır V m ve çift kanallı optik haritalama sistemi kullanılarak, Ca sinyallerinin Örnek eş zaman haritaları Şekil 1B ve 1C&#...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer at JoVE.com

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Görüntüleme.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Video: Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Biyomühendislik

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Biyoloji

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Tıp

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler