Wir möchten Dr. Claycomb für die Bereitstellung von HL-1 Zellen und detaillierte Wartungsprotokoll zu danken. Wir würden auch gerne an Frau Elena Carrillo und Dr. Seth Robia für ihre Unterstützung bei der Erzeugung der Zell Film und Mr. Pete Caron für seine Unterstützung bei der Herstellung von ein paar Accessoires für unsere Dual-Channel-optische Abbildungssystem danken. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 zu XA), National Institutes of Health (HL113640 XA) und Loyola University Research Development Fund (XA) unterstützt.

1. Herstellung der Lösung <ol><li> Norepinephrin (NP) Lösung <ol><li> Man löst 40 mg NP in 25 ml 30 mM Ascorbinsäure (0,1475 g Ascorbinsäure in 25 ml gereinigtem Milli-Q (MQ) Wasser. Vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung während dieser Mittelaufbereitung, weil Noradrenalin (NP) ist lichtempfindlich. </li><li> Filtern der NP-Lösung mit einem 0,22 um-Spritzenfilter. Aliquot der Lösung in 1 ml sterile Reaktionsgefäße und bei -20 ° C. Einmal eingefroren, ist NP für einen Monat stabil. </li></ol></li><li> Ergänzte Wash und Final Claycomb Medien <ol><li> Beginnen mit 43,5 ml Claycomb Medium und Ergänzung mit 5 ml fötales Rinderserum (FBS), 0,5 ml Penicillin / Streptomycin, 0,5 ml NP und 1: 100 verdünnt, L-Glutamin in 50 ml final ergänzt Claycomb Medium. Vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung während dieser Mittelaufbereitung, weil Claycomb Medium ist lichtempfindlich. </li><li> Bereiten Sie die Wasch Claycomb Medium mit dem gleichen Rezept wie die supgänzt Claycomb Medium außer plus 5% FBS und lassen Sie den NP und L-Glutamin-Komponenten. HINWEIS: Der Abschluss ergänzt und Wash Claycomb Medien sind gut für zwei Wochen bei 4 ° C ohne direkte Belichtung gespeichert. </li></ol></li><li> Sojabohnen-Trypsin-hemmende Lösung <ol><li> Man löst 25 mg Sojabohnen-Trypsininhibitor in 100 ml Ca-frei und magnesiumfreien Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Filtern der Lösung unter Verwendung eines 0,22 um-Spritzenfilter. HINWEIS: Die sterilisierte Lösung wird für einen Monat bei Lagerung bei 4 ° C gelagert. </li></ol></li><li> Gelatine / Fibronektin Gericht Beschichtungslösung <ol><li> Man löst 0,1 g Gelatine in 500 ml Wasser MQ bis 0,02% Gelatine machen. </li><li> Autoklaven, dann verdünnt 1 ml Fibronektin in 199 ml von 0,02% Gelatine und vorsichtig mischen. </li><li> Aliquoten 6 ml Gelatinelösung in getrennten Röhren und bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Hanks-Salzlösung <ol><li> Mit AufsehenPlatte, lösen die folgenden Salze in MQ Wasser (mmol / l), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCO 3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl 2 (1,261). </li></ol></li><li> Calcium-empfindlichen Farbstoff (Rhod2) Lösung <ol><li> Gebrauchslösung: 1 mg Rhod2 Trockenpulver in 400 ul 20% Pluronic F-127 in DMSO, um eine Rhod2 Farbstoffstammlösung und bei -20 ° C. </li><li> Verdünnen Sie diese Stammlösung 1: 1000 mit Hanks-Salzlösung, um eine endgültige Arbeitslösung vor Beginn des Versuchs zu machen. </li></ol></li><li> Spannungsempfindlichen Farbstoff (Rh237) Lösung <ol><li> Verdünnen Sie 5 mg Rh237 mit 2 ml DMSO-Stammlösung und bei -20 ° C zu machen. Von der Stammlösung 1: 1000 mit Hanks-Salzlösung, um eine endgültige Arbeitslösung vor Beginn des Versuchs zu machen. </li></ol></li></ol> &amp; #160; HINWEIS: 1-4 Lösungen basieren auf der Claycomb HL-1-Zellkultur-Protokoll mit geringen Modifikationen basiert. 2. Passagieren und Kultivierung HL-1 Vorhofmyozyten auf Deckgläser HINWEIS: Die HL-1 Zellen können aus Dr. Claycomb (Louisiana State University) bezogen werden. <ol><li> Wachsen HL-1 Zellen in T25-Kolben und füttern mit 5 ml ergänzt Claycomb Medium täglich. Passage der Zellen in T25-Kolben alle fünf Tage nach der Claycomb HL-1-Zellkultur-Protokoll (unten beschrieben) 10. </li><li> Platz runden Deckgläsern (20 mm Durchmesser) in 12-Well-Kulturplatten 24 Stunden bevor die Zellen in der T25-Flasche vollständig konfluenten und bereit, passagiert werden und dann die Abdeckung die Deckgläser mit Gelatine / Fibronektin über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Am nächsten Tag absaugen und entsorgen Sie die Gelatine / Fibronektin aus den Kulturplatten und ersetzen mit 1,5 ml ergänzt Schluss Claycomb Medium in jedem Well. </li><li> Split Zellen aus einem T25 culture-Kolben nach Erreichen der vollen Zusammenfluss an Tag 5. Saugen Sie das Medium aus dem T25 Kolben mit dem konfluenten Kultur und spülen Sie die Kultur kurz mit PBS bei 37 ° C. </li><li> Aspirat PBS und 3 ml von 0,05% Trypsin / EDTA bei 37 ° C durch Pipettieren der Trypsin / EDTA auf die Unterseite des T25-Kolben zur direkten Kontakt mit den Zellen zu vermeiden. Bei 37 ° C für 1 min. </li><li> Entfernen Trypsin / EDTA durch Aspiration und fügen Sie eine weitere 1,3 ml Trypsin / EDTA pro T25-Flasche. Inkubiere bei Raumtemperatur für 1 min. Untersuchen unter dem Mikroskop und wenn Zellen sind immer noch mit dem Kolben verbunden, tippen Sie auf, um vollständig zu entfernen übrigen Zellen. </li><li> Hinzufügen 1,3 ml Sojabohnen-Trypsininhibitor für die Zellen und Übertragungszellen aus dem Kolben in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Die leere Flasche mit 5 ml Wasch Claycomb Medium spülen. Hinzuzufügen, um die Spülung der Zellen in dem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min. </li><li> Nach dem Zentrifugieren den Überstand aspirieren und sanft resuspendieren Zellpelletin 6 ml ergänzt Schluss Claycomb Medium. </li><li> Saatgut jede Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen mit 0,5 ml Zellsuspension aus Zell Passagierung. Führen Sie die Zellen mit frischem supplementierten Schluss Claycomb Medium täglich. HINWEIS: das Wachstum der Zellen genau zu überwachen, in der Regel die Zellmonoschichten zu erreichen konfluent Status an Tag 4 und die spontane Aktivitäten sichtbar bleiben. Dann wird die kultivierte Mono bereit für optische Mapping am Tag 4-5 ist. </li></ol> 3. Laden Calcium und spannungsempfindliche Farbstoffe zu den Zellen <ol><li> Für optische Abbildung Studien, entfernen Sie das Deckglas aus der 12-Well-Zellkulturplatte und spülen Sie mit Hanks-Salzlösung. </li><li> Zellen mit Ca-empfindlichen Farbstoff Rhod2 färben, Inkubation der Zell-Monoschicht auf dem Deckglas mit 3 ml des oxygenierten (Blasen mit 5% CO 2/95% O 2 -Gas) Rhod2 Arbeitslösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min . </li><li> Um die Zellen mit V m empfindlichen Farbstoff färbenRh237, tauchen Sie die Rhod2 geladen Zellmonolayer in 3 ml sauerstoffhaltigen Rh237 Arbeitslösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für weitere 15 Minuten. </li></ol> 4. Dual Channel Optical Mapping <ol><li> Setzen Sie den Zellrasen, der mit V m und Ca Farbstoffe doppelgefärbt ist, in eine Umlaufkammer auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie einen beheizten Kreislaufsystem, um die Temperatur der Zellkammer bei 35 ± 1 ° C zu halten. Die Temperatur des Perfusats sorgfältig zu steuern, indem die Geschwindigkeit des Umlaufflusses durch die Kammer, um einen Gradienten von mehr als 0,3 ° C in der Kammer zu vermeiden. <ol><li> Vor der Aufnahme V m / Ca-Signale, waschen Sie die Zellschicht mit frischen Hanks-Lösung für ca. 5 min, um den restlichen Farbstoff aus den vorherigen Färbeschritte entfernen. </li></ol></li><li> Pace gesunde Zellmonoschichten mit einer bipolaren Elektrode eines Glaspipette mit Hanks-Salzlösung und eine Silv gefüllt ister Draht um die Pipettenspitze aufgerollt, wie zuvor beschrieben 12,17. </li><li> Pace gesunde Zellmonoschichten mit einer Zykluslänge von 200-500 msec und einer Impulsbreite von 2 msec, erwartet eine Reizschwelle bei etwa 1 mV. HINWEIS: Für jede Charge von gezüchteten Monoschichten, mindestens zwei nicht-behandelten Monoschichten verwendet, um den Zustand der Zelle Charge prüfen. Gesunden Kontrollmonoschichten sollten in der Lage, durch elektrische Stimulation bei Zykluslängen von 200 bis 500 ms erfasst werden können. Wenn die Kontrollmonoschichten elektrisch stimuliert werden versagen, bedeutet dies, dass die gesamte Zelle Charge möglicherweise nicht geeignet für optische Abbildungs ​​Versuche. </li><li> Sowohl V m und Ca empfindliche Farbstoffe anzuregen, eine LED-Lichtquelle (520 nm Wellenlänge) gekoppelt, mit einem Anregungsfilter (510 nm / 40) und einen dichroitischen Spiegel (561 nm). <ol><li> Sammeln Sie die Fluoreszenzsignale von den Zellen über einen 40X-Objektiv und Split mit einem dichroitischen Spiegel (594 nm) in eine V m-Komponente und einer Ca-Komponente emittiert.Filtern des emittierten Lichts in der V m Kanal mit einem Langpass-Filter (700 nm) und das emittierte Licht in der Ca-Kanal mit einem Bandpassfilter (585/40 nm). </li><li> Sammeln Sie die gefilterte Fluoreszenzlicht mit zwei CCD-Kameras (80 x 80 Pixel, 1.000 fps; Redshirt Imaging). </li><li> Um Farbstoff Ausbleichen zu vermeiden, sollten Aufnahmen für weniger als 2 Sekunden auf jedem Blickfeld, um die Zeit der Belichtung zu begrenzen. Hier, in der Regel vier verschiedene Bildbereiche für jede Monoschicht. </li></ol></li></ol> 5. Datenverarbeitung von V m oder Ca Recordings <ol><li> Sowohl V m und Ca-Signale (80 x 80 Pixel), ist der Mittelwert der Intensitätswerte der fünfundzwanzig (5 x 5) benachbarten Pixeln in einem Intensitätswert an unterschiedlichen Aufzeichnungszeitpunkten, um Hintergrundrauschen zu reduzieren. HINWEIS: Nach der Datenmittelung, die jeweils die Aufnahmezeit Punkt eines individuellen Aktionspotential oder Ca-Transienten ergibt eine Datenmatrix, die 16 x 16 gemittelten Intensitätswerte (gemitteltDatenkanälen) mit einer räumlichen Auflösung von 50 um. </li><li> Definieren Aktivierungszeit (AT) der aufgezeichneten V m oder Ca-Signale. <ol><li> Um eine Aktivierungszeit (AT) eines einzelnen Aktionspotentials oder Ca transienten definieren, bestimmen die Zeit von 50% der Spitzenamplitude des V m oder Ca-Signale unter Verwendung einer maßgeschneiderten MATLAB-basierten Algorithmus, wie vorher beschrieben. 12 </li><li> Manuelle Korrektur gelesen das analysierte ATs, um alle Fehler, die während der Programmanalyse auftreten können, zu beseitigen. </li><li> Bewahren Sie die definierten AT-Matrix (16 x 16 gemittelten Daten Kanäle) der aufgezeichneten Aktionspotential und Calciumtransienten jeweils in der verwendeten Software. </li></ol></li><li> Berechnen Aktionspotential oder Calciumtransienten Leitungsgeschwindigkeit (CV) Vektoren auf der AT-Matrix mit dem Vektorfeld-Analyseverfahren wie zuvor mit geringen Modifikationen 12,18 beschrieben. <ol><li> Berechnen der CV Vektor eines Datenkanals relativ zu seiner Umgebung AT Datenpunkte (5 ×; 5 benachbarten gemittelten Datenkanäle), um eine glatte Oberfläche des Polynoms Aktivierungszeiten (AT Fläche simulieren) unter Verwendung eines Least-Square-Algorithmus innerhalb der MATLAB-Programm 12,18. </li><li> Berechnen Leitungsvektor mit Hilfe der nachstehenden Formeln Formel 1: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formel 2: θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)] HINWEIS: Ve ist ein CV Vektor an x- und y-Achse projiziert wird; dx / dT ist die Projektion des Vektors in CV x-Achse; dy / dt ist die Projektion der CV Vektor in y-Achse. T ist die an der Oberfläche; x, y beziehen sich auf die 2-D-Koordinaten; T x = ∂T / ∂x ist die partielle Ableitung T in Bezug auf x; T y = ∂T / ∂y die partielle Ableitung der T in Bezug auf Y ist; θ ist der letzte Richtung eines CV-Vektor. </li><li> Gruppe alle Vektoren der AT-Matrix in 36 Bahnen, von denen jede umfasst einen Zehn-Grad-Sektor auf dem Kompass. &lt;/ Li&gt; <li> Wählen Sie den Weg, der die größte Bevölkerung der CV-Vektoren unter den 36 Leitungsbahnen. Berechnen Sie die durchschnittliche CV dieses Weges, um den Lebenslauf der Monoschicht zu vertreten. </li></ol></li></ol> 6. Visualisierung der Wellenfrontausbreitung <ol><li> Normalisieren der Signalintensität eines einzelnen Aktionspotential oder Ca-Transienten an verschiedenen Aufnahmezeitpunkten relativ zu seinem Spitzenwert mit MATLAB-Software. </li><li> Vorübergehend die normierten Intensitätsdaten eines jeden aufgezeichneten Zeitpunkt in eine 16 x 16 Matrix-Intensität in der MATLAB-Software zu speichern. </li><li> Konstruieren Sie eine farbkodierte Intensitätskarte aus der gespeicherten Intensitätsmatrix jedes Aufzeichnungszeitpunkt mit dem surf.m Funktion. HINWEIS: In der Intensitätskarte, rot steht für hohe Intensität der V m oder Ca-Signale und Blau reflektiert geringe Intensität der Fluoreszenzsignale. </li><li> Erstellen Sie eine .avi-Datei mit Hilfe des avifile.m Funktion. </li><li> Speichern Sie alle das intensity Karten bei unterschiedlichen Aufnahmezeitpunkte des Aktionspotentials oder Ca-Transienten mit dem addframe.m Funktion. HINWEIS: An dieser Stelle werden zwei separate AVI-Dateien von V m und Ca Fortpflanzung erzeugt werden. </li></ol>

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	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Salama, G., Hwang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts.">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+imaging+of+membrane+potential+and+intracellular+calcium.">Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium.</a> J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).</li><li>Sowell, B., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+shock-induced+arrhythmias:+role+of+intracellular+calcium.">Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).</li><li>Fast, V. G., Kleber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+conduction+in+cultured+strands+of+neonatal+rat+heart+cells+measured+with+voltage-sensitive+dyes.">Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes.</a> Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).</li><li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+HERG+in+determining+frequency+of+reentry+in+neonatal+rat+ventricular+myocyte+monolayer.">A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer.</a> Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).</li><li>Beauchamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+contributions+of+connexins+40+and+43+to+atrial+impulse+propagation+in+synthetic+strands+of+neonatal+and+fetal+murine+cardiomyocytes.">Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes.</a> Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+L-+and+T-type+Ca2++channels+in+murine+HL-1+cells.">Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).</li><li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-1+cells:+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte.">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li><li>Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+intercellular+coupling+improves+the+function+of+cardiac+pacemakers+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+activation+contributes+to+reduced+connexin43+and+development+of+atrial+arrhythmias.">c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).</li><li>White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+at+the+cellular+level:+use+of+cultured+HL-1+cardiomyocytes+for+studies+of+cardiac+muscle+cell+structure+and+function.">Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).</li><li>Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+causes+electrical+remodeling+in+cultured+atrial+myocytes.">Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).</li><li>Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+inhibition+prevents+pacing-induced+cellular+remodeling+in+a+HL-1+myocyte+model+for+atrial+fibrillation.">Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation.</a> Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).</li><li>Umapathy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogram+fractionation+in+murine+HL-1+atrial+monolayer+model.">Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model.</a> Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).</li><li>Fast, V. G., Cheek, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+arrhythmias+induced+by+strong+electrical+shocks+in+myocyte+cultures.">Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures.</a> Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).</li><li>Bayly, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+conduction+velocity+vector+fields+from+epicardial+mapping+data.">Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Dieser Artikel beschreibt die wichtigsten Aspekte der optischen Abbildung in einer kultivierten HL-1 Vorhof Myozyten-Monolayer mit Kalzium und spannungsempfindlichen fluoreszierenden Farbstoffen gefärbt. Es umfasst das Kultivieren eines optimalen HL-1-Zellmonoschicht, die Konfiguration des Abbildungsausrüstung, Abbilden eines kultivierten Monoschicht, und die Datenanalyse. Um erfolgreich map kultivierten Zellen, ist der Schlüssel zu einer gleichmäßig verteilten Zellrasen vorzubereiten. ...

Eine einzigartige Calcium (Ca) und Spannung (V m) Dual-Channel-Mapping-Technik optische 1-5 wird als effizientes Werkzeug, um gleichzeitig aufnehmen V m und Ca-Signale sowohl in intakten Herzen und kultivierten Zellmonoschichten entstehen. Diese Technik ermöglicht es, leistungsfähige Informationen bezüglich der Beziehung zwischen Calciumtransienten und Aktionspotentiale, die zugrunde liegenden Mechanismen der elektro Herzarrhythmien besseres Verständnis zu erhalten. Kultivierte Zellmonoschichten haben sich als nützliche zelluläre Modell Herz-Elektrophysiologie und den zugrundeliegenden Mechanismus Arrhythmien studieren. 4,6-8 HL-1-Zellen sind eine gut charakterisierte atrialen Myozyten Kulturlinie. HL-1-Zellen halten auch ein einzigartig differenzierte Genotyp und Phänotyp, die morphologischen, elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften von Erwachsenen Vorhofmyozyten umfasst. Diese Zellen exprimieren Herz Gene und Proteine, einschließlich important kardialen Ionenkanäle (dh, L- und T-Typ-Calciumkanäle) 9 und reifen Isoformen sarkomerischen kontraktilen Proteine ​​in der Regel in der Erwachsenen Vorhofmyozyten als Anderen gefunden und wir bereits berichtet haben. 10-13 Zusätzlich HL-1-Zellen sein können kultiviert, um einen 2-dimensionalen (2-D) Myozyten Monoschicht zu bilden. Somit werden die Vorteile der Verwendung von kultivierten HL-1 Monoschichten umfassen: 1) relativ niedrige Kosten und eine einfacher Myozyten Kulturlinie als Isolierung und Kultivierung primärer neonatalen Myocyten zu erhalten; 2) eine konfluente Monoschicht von Zellen verringert die strukturelle Komplexität, die aus dem 3-D-Struktur des Herzens führen; 3) eine Zellschicht kann die Interferenz interstitielle Fibrose, die in der intakten Herzens auftritt eliminieren. Dies kann verwendet werden, um bestimmte elektrophysiologische Funktionen aus einer Gruppe von Myozyten ohne Störung von Fibroblasten und interstitiellen Matrix zu zerlegen ist; 4) Bewertung der funktionellen Konsequenzen von pharmakologischen oder genetische Manipulation in culrierte Zellmonoschichten können effektiv erreicht werden. Deshalb haben HL-1-Zellen zu einem weit verbreiteten Zellmodell zur Untersuchung diverse Aspekte der Myozyten Physiologie sowie Schrittmacher-induzierte abnorme elektrische Aktivitäten. 13-16 ist jedoch eine besondere Handhabung und Pflege der Kultur erforderlich gesunde Zellmonoschichten, die mit externen antworten elektrische Stimulation für die optische Abbildung Studien. Zusätzlich können doppelte fluoreszierende Farbstoff Färbeverfahren leicht zu einer Beschädigung der Integrität der kultivierte konfluente Zellmonoschichten. So Durchführung V m / CA Dual-Channel-optische Abbildung in kultivierten HL-1 Monoschichten war eine große Herausforderung. Das Ziel dieser Methode ist es, die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Durchführung zweikanaligen optischen Abbildungs ​​in kultivierten HL-1 Monoschichten bereitzustellen. Hier haben wir umfangreiche Informationen zu einem optimierten Protokoll für HL-1-Zellmonolayer Vorbereitung, Dual-Channel-optische Abbildung eines kultivierten Zellschicht und Mapping der Datenverarbeitung zur Verfügung gestellt.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 dry powder</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronic</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

Optische Abbildungs ​​hat sich als eine wertvolle Technik, um die elektrische Herzaktivität sowohl intakte ex vivo Herzen und in kultivierten Myozyten-Monoschichten zu erkennen. HL-1-Zellen wurden in großem Umfang als ein 2-dimensionales zelluläres Modell zur Untersuchung diverse Aspekte der Herzphysiologie verwendet. Allerdings war es eine große Herausforderung, optisch Karte Calcium (Ca) Transienten und Aktionspotentiale gleichzeitig über dieselbe Sichtfeld in einer kultivierten HL-1 Vorhofzellmonolayer. Dies liegt daran, eine spezielle Handhabung und Pflege ist erforderlich, um gesunde Zellen, die elektrisch erfasst werden kann und optisch abgebildet vorzubereiten. Wir haben daher eine optimale Arbeitsprotokoll zur zweikanaligen optischen Abbildungs ​​entwickelt. In diesem Manuskript haben wir im Detail beschrieben, wie Sie den Dual-Channel-optische Mapping Experiment durchzuführen. Dieses Protokoll ist ein nützliches Tool, um das Verständnis der Aktionspotentialausbreitung und Ca Kinetik in Arrhythmie Entwicklung zu verbessern.

Eine kultivierte Monolayer weist eine regelmäßige Eigenrhythmus wie im Film 1 gezeigt. Wir haben dann ausgeführt V m / Ca Dual-Channel-optische Abbildung in einem vollständig zusammenfließenden HL-1-Monoschicht. 1A zeigt beispielsweise Spuren von V m und Ca-Signale von einem aufgezeichneten Einzel schlagen. Repräsentative isochronen Karten gleichmäßig ausgebreitet V m und Ca-Signale unter Verwendung der zweikanaligen optischen Abbildungssystems s...

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Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

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JoVE Journal

Biology

10.2K Aufrufe.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Serie: Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Forschung

Biotechnik

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Biologie

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Medizin

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienten und Membrane Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer

Zusammenfassung

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