We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

Not: tüm zebra balığı çalışmalar ve hayvan bakımı Mayo Kliniği Enstitüsü, IACUC onaylı protokol # A41213 ile uygun olarak yapılmıştır. Transgenesis 1. DNA konstruktları <ol><li> Bir DNA şablonu olarak (BACPAC kaynakları merkezine (BPRC) &#39;den) CH211-270H11 BAC klonu kullanılarak bir 5.2 kb dopamin beta hidroksilaz (d βh) promotör bölgesini 8 yükseltin. 2 dakika için 94 ° C, (94 ° C, 15 saniye, 50 ° C, 10 döngü 30 saniye 68 °: Uzun DNA şablonları ve uzun doğru PCR amplifikasyonu için bir PCR sistemi uygun ve PCR için aşağıdaki döngü programları kullanarak (94 ° C, 15 saniye, 53 ° C, 30 saniye, 68 ° C&#39;de, 8 dakika), 68 ° C, 4 dakika (ileri doğru primer 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39;, 30 devir ile takip olunan Cı, 8 dakika), ve ters primer 5&#39;-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;). </li><li> D βh -pDONRP4-P1R giriş clo oluşturne 8 gibi çoklu ağ geçidi gibi ticari rekombinant klonlama sistemi kullanılarak. Saflaştırılmış dβh PCR ürünü (172 ng / ul), 1 ul (150 ng / ul) pDONRP4-P1R donör vektörü 1 ul karıştırın (diğer ağ geçidi vektörleri Dr. Chi-Bin Chien, Univ cömert hediyeler birlikte. Utah) TE tamponu (pH 8.0), BP Clonase enzim karışımı 2 ul 4 ul, 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra bir sut TOP10 yeterli E. transform E. coli, üreticinin protokolüne göre yöntem. </li><li> Oluştur d βh: EGFP-MYCN transgenik adım 1.2&#39;de belirtilen 8 kullanarak rekombinant klonlama sistemi inşa. Her giriş klonunun 1 ul bir 5.2 kb dβh promoteri (dβh -pDONR P4-P1R yapısı), EGFP bir durdurma kodonu (pME-EGFP yapısı) eksik de dahil olmak üzere (150 ng / ml) ve insan MYCN cDNA karıştırın (cömert bir hediye Dr. Hogarty adlı Pennsylvania Çocuk Hastanesi&#39;nde, MYCN-pDONRP2R-P3 yapı), 1 ul bir I-SceI tanıma sitesi (Dr. C. GRABHER, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) &#39;dan cömert bir hediye, TE tamponu 4 ul ihtiva eden tadil edilmiş hedef vektörünün (150 ng / | il), ( LR Clonase enzim karışımı 2 ul pH 8.0) içinde, 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra transforme kimyasal olarak yetkili E. E. coli gibi bir atış ilk 10 ve üreticinin protokolünü takip ediniz. </li><li> MITF edin: MITF transgenik PNP-MITF vektör sindirilmesi ile 8 inşa Notl ve SalI kısıtlama enzimleri ile 2 saat boyunca oda sıcaklığında ve serbest 2.65-kb alt-klonlanmasıyla (Dr. D. Raible, Univ cömert bir hediye Washington). MITF promotörünü ve çevreleyici bir I-SceI tanıma sitesi ihtiva eden bir tadil edilmiş pBluescript vektörü Notl ve Mlul mevkilerine zebra balığı MITF genin kodlama dizisini ihtiva eden bir DNA fragmanı (Dr. Hui Fe cömert bir hediyeng, Boston Üniversitesi) üreticinin protokolüne göre T4 DNA ligaz kullanılmıştır. NOT: stabil MYCN -expressing hatları üreten verimliliğini artırmak için d βh: EGFP-MYCN ve MITF:. MITF DNA yapıları tek hücreli aşamada sedef embriyolara birlikte enjekte edilir Sedef nöral eksik mutant balık türü belirler tepe-türetilmiş gelişim sırasında 36 melanofor. Böylece, enjekte edilen embriyolar pigment hücrelerinin görünümü MITF entegrasyonu önerir: MITF DNA genomuna oluşturur. Bu iki ya da üç birlikte enjekte DNA yapıları, balık genomuna 31 içine ko-entegre edilebilir gösterilmiştir. EGFP-MYCN transgen ve MYCN stabil bir transgenik çizgiden daha kolay tanımlama için: Bu nedenle, MITF sentezlenmesinin neden pigmentasyon dβh entegrasyonu için markör olarak görev yapabilir. </li><li> EGFP-MYCN ve MITF: d βh Mix MITF DNAI-SceI enzim 1 ul tampon maddesi ve 0.75 ul bir 15 ul reaksiyon toplam hacim içinde: 1 oranında 3 de yapıları. Reaksiyonda DNA toplam tutarı 750 ng geçmemesi emin olun. </li><li> 4 saat veya O / N için oda sıcaklığında I-SceI sindirimi yürütmek. İkinci günde,-SceI- DNA&#39;lar mikroenjeksiyon için hazır olan veya ileride enjeksiyon için -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir dijeste edilmiştir. Bunu, enzim etkinliğini korumak için küçük kısımlar halinde, -80 ° C&#39;de bir I-SceI enzim saklayın. </li><li> Dr. C. GRABHER (a cömert bir hediye bir pENTRY1A vektörünün EcoRI ve Notl mevkilerine pcDNA3 vektörü insan ALKF1174L ve vahşi tip ALK gen (Dana Farber Kanser Enstitüsü&#39;nde Dr. George cömert bir hediye) 7-klonlanmıştır, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) üreticinin protokolüne göre T4 DNA ligaz kullanılmıştır. </li><li> D βh oluşturun: ALKF1174L &lt;/ Em&gt; veya dβh: Protokolü 1.2 belirtildiği gibi rekombinant sistemini kullanarak ALKWT transgenik yapıları. Kısaca, üç giriş klonlar birleştirmek dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (veya ALKWT -pENTRY1A) ve P3E- poliA, I-SceI tanıma sitesi (Dr. C. GRABHER, Karlsruhe cömert bir hediye içeren değiştirilmiş hedef vektörüne Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) üreticinin protokolüne göre, LR Clonase enzim karışımı kullanılmıştır. </li><li> Karıştırın d βh: ALKF1174L (veya dβh: ALKWT) ve dβh: MCherry DNA 3&#39;te oluşturur: 1 oranında PROTOKOL 1,5-1,6 tarif edildiği gibi I-SceI enzim ile linearize. </li></ol> 2. Mikroenjeksiyon <ol><li> Tüm enjeksiyonlar 37 için, 1.0 mm çaplı cam mikropipetler kullanın. Enjeksiyondan önce bir jilet ile cam mikropipetlerin ucunu kırın. Inject enjeksiyon hacmi kalibremineral yağı, bir damla halinde H2O ing. Elde edilen damlacıkların çapı ölçülür ve enjeksiyon hacmi bir hücre aşamasında embriyoların toplam hücre hacminin% 10&#39;undan daha az olmasını sağlamak için mikroenjektör (basınç ya da basınç palsının süresini) ayarlayın. </li><li> DNA ihtiva eden enjeksiyon çözeltisi, 5 ul taze bir I-SceI enzim (5 ünite / ul) ilave 0.5 ul ekle enjeksiyon transgenesis 38 etkinliğini arttırmak için hemen önce oluşturur. Tek hücre aşamasında embriyoların sitoplazmasına Doğrusal hale getirilen DNA yapıları 50-80 pg enjekte edilir. Enjeksiyon başarısını sağlamak için, görselleştirme için% 0.25 fenol kırmızısı ile örnek karıştırın. Hücreler enjeksiyondan sonra kırmızı açarsanız, bu mikroenjeksiyon başarılı olduğunu gösterir. Transgenik balık üretmek için yüksek bir başarı oranı sağlamak için, biz genellikle 500 kadar embriyolar enjekte. </li><li> EGFP-MYC: stabil MYCN sentezleyen transgenik balık oluşturmak için, çizgiselleştirilmiş d βh birlikte enjekteK ve MITF: MITF DNA yapıları, (3: 1 oranında), bir hücre aşamasında pigmentasyon mutan sedef zebrabalıkları embriyolara. MITF ifadesi balık genomunda transgenik yapıların entegrasyonu için bir muhabir olarak hizmet vermektedir. </li><li> Dβh ile; ALK F1174L (ALKWT veya dβh:): yabani tipte veya MYCN transgenik embriyolar ALK mozaik aşırı ekspresyonu için, doğrusallaştırılmış d βh birlikte enjekte bir hücreye: MCherry DNA (1 oranında 3 de) oluşturur vahşi tip AB balık ile transgenik balık: F1 heterozigot Tg (EGFP-MYCN dβh) olarak ıslah kaynaklanan embriyolar. Bu nedenle, yavru yarısı MCYN için transgenik olan ve yarı vahşi tip bulunmaktadır. </li></ol> Kararlı ya da Mozaik Transgenik balık için 3. Ekran <ol><li> Tricaine (% 0,02) bir öncelikli olarak enjekte sedef embriyolar anestezi stabil MYCN -expressing hatlarının tespiti verimini arttırmakT gün pigmentasyon postfertilization ve ekranın 3-5. Germ hücreleri EGFP-MYCN transgenini: d βh taşıyan kurucu balık için daha fazla tarama için cinsel olgunluk onları taze yumurta su ile yeni bir petri pigmentasyon ile embriyolar transfer ve yükseltmek. </li><li> EGFP-MYCN, daha genotiplemede için 1-2 gün sonrası döllenme de EGFP-pozitif embriyolar için yabani tip AB balık ve ekran outcross pigmentli F0 yetişkin balık germ iletimi ile kurucusu tanımlamak için. PCR tüp içine tek bir EGFP-pozitif F1 embriyo yerleştirin ve tüm sıvı çıkarın. 4x liziz tamponu 12.5 ul, 35 ul H2O ve 2.5 | il proteinaz K tek embriyo (10 mg / ml) içeren gDNA ekstraksiyon tamponu 50 ul ekle. 4x liziz tamponu içinde 50 ml yapmak için K proteinaz inaktif için 98ºC inkübasyondan 10 dakika, ardından 55 ° C&#39;de 2-3 saat boyunca reaksiyonu, inkübe 1 M Tris, 500 ul (pH 8.4), 2.5 mL 1 M KCI tH 2 O o 47 ml NOT: F0 MYCN istikrarlı transgenik balık vahşi tip AB balık ile yetiştirilen sonra, yavruların hepsi pigmentli bulunmaktadır. Böylece, pigmentasyon MYCN- olumlu balık belirlenmesi için işaretleyici olarak hizmet edemez. MYCN transgenik balık iken, EGFP-MYCN füzyon proteini gibi ve soğanilikteki gibi üstün servikal ganglionlar ve sempatik zincirin sıralı segmental ganglion ve non-PSNS dopaminerjik nöronların sempatik nöronlar da dahil olmak üzere, PSNS ifade edilir kranial ganglion 8. Bu nedenle, EGFP ekspresyonu MYCN kararlı transgenik embriyo tanımlanması için bir markör olarak görev yapabilir. </li><li> Şablon olarak pigmentli F1 embriyo ekstre gDNA 2 ul kullanarak MYCN primerleri -test F1: 5&#39;-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3: 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 &#39;ve aşağıdaki program zekâh GC açısından zengin bir PCR Sistemi: 3 dakika için 95 ° C&#39;lik 1 döngü, 30 saniye için 95 ° C 25 döngü, 30 saniye için 58 ° C ve 3 dakika için 72 ° C. Genellikle, pigmentli embriyolar entegre MYCN transgenin varlığı MITF ve MYCN aşırı ifade fazla 6 kurucu balık bu yöntem ile belirlenmiştir emin olmak için tek eşleşme gelen 14-16 pigmentli embriyolar genotiplemesi. </li><li> EGFP-pozitif F1 embriyoların kalanını kadar kaldırın. Fin klip ayrıca balık içine MYCN transgen entegrasyonu onaylamak için yukarıdaki protokolü kullanılarak yaş 2-3 ay onları Genotip ve. F1 MYCN vahşi tip AB balık ile stabil transgenik balık Breed. ALK F1174L (veya dβh: ALKWT) dβh ile: doğrusallaştırılmış d βh Co-enjekte PROTOKOL 2.4 açıklandığı gibi MCherry DNA tek hücreli embriyolara oluşturur. </li><li> Sıralama deneyde embriyolar -expressing MYCN üç boyutlu bir flor kullanarak protokol 2.4 de tarifEscence mikroskop ve gün PSNS EGFP-MYCN ifadesi için postfertilization 1-3 öncelikle enjekte embriyolar ekran. Daha sonra, gün postfertilization 2-5 sırasında tricaine (% 0.02) ile embriyolar anestezi ve üç boyutlu bir floresan mikroskobu kullanılarak PSNS içinde mCherry sentezlenmesi göre yine bu MYCN- pozitif ya da negatif embriyolar sıralamak. mCherry sentezlenmesi mozaik birinci enjekte edilmiş hayvanların dokularında ALK birlikte ekspresyonuna için bir markör olarak görev yapar. Not: ALK F1174L ve dβh: mCherry, dβh: ALKWT ve dβh: mCherry veya dβh vahşi tip balık MYCN kararlı transgenik balık üretimi kaynaklanan ~ 600 yavru d βh de dahil olmak üzere, doğrusallaştırılmış DNA yapısı ile, grup başına enjekte edilmiştir : MCherry tek başına, sırasıyla. MCherry mozaik ifadesi öncelikle enjekte balık 70-90% olarak görülebilir. Bir buçuk, bir-Enjekte balık üçüncü tümör izlemek için larva aşamasında kurtuldu. </li><li> MCherry + MYCN + ve mCherry + MYCN tüm toplamak - zebra balığı kitap 39, standart protokollere göre, embriyo ve 5 hafta postfertilization başlayarak tümör başlangıç ​​izler. </li></ol> Mozaik Transgenik balık 4. Tümör İzle <ol><li> Tümör başlangıcı kanıtı için 5 hafta postfertilization başlayan her 2 hafta mCherry- pozitif öncelikle enjekte balık izleyin. </li><li> MCherry varlığı için tricaine (% 0.02) ve ekranın balık anestezisi - ve EGFP dijital görme DS-U1 kamera ile donatılmış Nikon SMZ-1500 stereoskopik flöresanlı mikroskop altında PSNS tümörlerin -expressing. </li><li> Tümörler ALK transgen ifade olup olmadığını doğrulamak için, mCherry- ve ALK genotiplemesi PCR için EGFP-pozitif kitleleri izole. </li><li> PCR kullanarak, genomik DNA&#39;yı büyütmemiştirALK P7: 5&#39;-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 &#39;ve ALK P18: 5&#39;-TGT CAG CTT GCT GAT GTT GC-3&#39; ve aşağıdaki PCR reaksiyonu: 1 döngü, aşağıdaki primerler ile geliştirilen tümörleri ekstre 5 dakika boyunca 94 ° C, 30 döngü (30 saniye için 30 saniye için 94 ° C, 55 ° C ve 60 sn için 72 ° C). Daha sonra, sıra ALK P7 primeri ile PCR ürünü, bundan başka MCherry pozitif tümörlerde mutant veya yabani-tür ALK varlığını teyit etmek için. </li></ol>

<ol>
	<li>Tenesa, A., Dunlop, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+aetiology+of+colorectal+cancer+from+genome-wide+association+studies.">New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies.</a> Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).</li><li>Maher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+takes+centre+stage+in+cancer+profiling.">Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling.</a> Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).</li><li>Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+cancer+genomes+through+second-generation+sequencing.">Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).</li><li>Chung, C. C., Chanock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+genome-wide+association+studies+in+cancer.">Current status of genome-wide association studies in cancer.</a> Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).</li><li>Mosse, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ALK+as+a+major+familial+neuroblastoma+predisposition+gene.">Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene.</a> Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).</li><li>Janoueix-Lerosey, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+and+germline+activating+mutations+of+the+ALK+kinase+receptor+in+neuroblastoma.">Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).</li><li>George, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+ALK+provide+a+therapeutic+target+in+neuroblastoma.">Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+Collaborates+with+MYCN+in+Neuroblastoma+Pathogenesis.">Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Amatruda, J. F., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+cancer+in+zebrafish.">Genetic models of cancer in zebrafish.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).</li><li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299 (5608), 887-890 (2003).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphoblastic+lymphoma+cells+express+high+levels+of+BCL2,+S1P1,+and+ICAM1,+leading+to+a+blockade+of+tumor+cell+intravasation.">T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation.</a> Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).</li><li>Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+penetrant+melanoma+in+a+zebrafish+model+is+independent+of+ErbB3b+signaling.">Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).</li><li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing's+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis.">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).</li><li>Le, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock-inducible+Cre/Lox+approaches+to+induce+diverse+types+of+tumors+and+hyperplasia+in+transgenic+zebrafish.">Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RAS+on+the+genesis+of+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Genes &amp; development. 21 (11), 1382-1395 (2007).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KRAS+induces+progenitor+cell+expansion+and+malignant+transformation+in+zebrafish+exocrine+pancreas.">Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas.</a> Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmrk,+kras+and+myc+transgenic+zebrafish+liver+cancer+models+share+molecular+signatures+with+subsets+of+human+hepatocellular+carcinoma.">Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma.</a> PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).</li><li>Forrester, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9-transgenic+zebrafish+develop+a+myeloproliferative+neoplasm+and+provide+new+insight+into+mechanisms+of+myeloid+leukaemogenesis.">NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis.</a> British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).</li><li>Alghisi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogene+expression+to+endothelial+cells+induces+proliferation+of+the+myelo-erythroid+lineage+by+repressing+the+Notch+pathway.">Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway.</a> Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+responses+to+exogenous+DNA+in+mammalian+cells+and+its+effect+on+oligonucleotide-directed+gene+modification.">Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification.</a> Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+high-risk+neuroblastoma.">The genetic landscape of high-risk neuroblastoma.</a> Nature genetics. , (2013).</li><li>Berry, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK(F1174L)+mutation+potentiates+the+oncogenic+activity+of+MYCN+in+neuroblastoma.">The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma.</a> Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).</li><li>Heukamp, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+mutated+ALK+induces+neuroblastoma+in+transgenic+mice.">Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).</li><li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate.">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish.">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li><li>Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu temsili çalışmada, bu genler, belirgin bir şekilde bileşik kararlı transgenik balık coexpressing bizim önceki bulgusuyla tutarlıdır nöroblastom başlamasını hızlandırmak için işbirliği göstermek için transgenik balık -expressing MYCN içinde MCherry raportör geni ile geçici birlikte enjeksiyonu ve aktif ALK yakımının birlikte kullanılır Her iki ALK ve MYCN 8 aktif. Bu yöntem ile mozaik transgenik bir yaklaşım geleneksel bir yöntem...

Kanserler zamanla patolojik mutasyonlar, silmeler ve kromozom kazançları birikimi ile işaretlenmiş ilerici hastalıklardır. Bu genetik anormallikler, hipoksi gibi yanıtları stres hücre iskeletinin hücre döngüsü, hücre ölümü, enerji metabolizmasında ve montaj kadar çok sayıda hücresel süreçleri etkileyebilir. Bu nedenle, tümörigenezin biyolojik süreçlerin bir yelpazede çok sayıda genetik bozuklukların kolektif eylemleri yansıtır. Tüm genom dizileme, exome sıralanması, hedeflenen sıralama, derin sıralama ve genom dernek çalışmaları da dahil olmak üzere son bütünleştirici genomik araştırma çabaları, tümörlerin 1-4 esasen her türlü yeni genetik değişikliklerin giderek artan sayıda belirledik. Birçok durumda, genetik lezyonlar hastalığın patogenezinde işbirliğini düşündüren, bir rastgele olmayan bir şekilde 5-8 birlikte görülür. F Elde edilen anormal ifade edilen genlerin büyük bir dizi onkojenik rolleri KesmeBu genomik lezyonları rom, yeni tedavi stratejileri hazırlamak ve bu ajanların tümör hücrelerinin tepkilerini anlamak için gerekli, ancak bu yüksek verimli fonksiyonel genomik analiz yürütülmesinde çok sağlam hayvan modeli sistemleri gerektiren, zor bir görev olduğunu kanıtlamıştır vivo. Memeliler, özellikle kemirgenler, kanser biyolojisinde tercih modeller olmasına rağmen, Zebra balığı büyük ilgi çekmek için başlamıştır. Teleost zebra balığı (Dario rerio) 1960 yılından bu yana gelişim incelemesi için bir model organizma olarak kullanılmaktadır ve birinci 1982 9-11 tümör patojenez çalışma uygulanmıştır. Bakım, küçük vücut büyüklüğü ve yüksek doğurganlık kolaylığı Zebra balığı anormal ve patolojik fenotipleri 10 görüşmek mutasyonları tespit etmek büyük ölçekli ileri genetik ekranlar için sağlam bir model olun. Zebra balığı embriyolarının optik şeffaflık gibi, bu kanser modelinin daha geniş kullanımını destekleyen bir başka önemli özelliğiBu, gerçek zamanlı 9, kemirgen 12 nispeten zor bir uygulama, tümör gelişmesini bulmak için yapılacak in vivo görüntüleme sağlar. Zebra balığı referans genom (Zv9) son karşılaştırmalı genomik analiz,% 71% 82 Man (OMIM) veritabanında 13 Online Mendel Kalıtım hastalıkla ilişkili genleri ile ilişkili olan insan ortologlara, sahip, 26.206 protein kodlama genleri ortaya 14. Sonuç olarak, Zebra balığı nöroblastom 8 dahil olmak üzere insan kanserlerinin farklı tipleri, modellemek için kullanılır olmuştur, T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) 15,16, melanom 17,18, Ewing sarkomu 19, rabdomiyosarkoma 20,21, pankreas karsinomu 22, hepatoselüler karsinom 23 ve miyeloid 24,25 malignitesinin ve Ksenonakilden bir kanser modeli 11,26 çalışmalar olarak seçilmiştir. Stabil bir transgenikZebra balığı yaklaşım yaygın kazanç fonksiyon-normal gelişimi veya hastalık patogenezinde 27,28 genlerin etkisini incelemek için kullanılır. Bu tip bir model (Şekil 1A) geliştirmek için, bir tek hücreli vahşi tip embriyolara bir doku spesifik promotör tarafından sürülen ilgili geni içeren bir DNA yapısı enjekte eder. Enjekte embriyolar cinsel olgunluğa ulaştığında Üç dört ay enjeksiyondan sonra, onlar kurucu balık olarak lisansları onların germline içinde inşa DNA entegrasyonu gösteren olanlar için ekrana vahşi tip balık çaprazlanırlar. Bu tür kopya sayısına ve transgen entegrasyonu alanı olarak bir çok faktör, kararlı transgenik hatlarda transjenin ekspresyonunu etkilemektedir. Bu nedenle, transgenik bir tümör modeli geliştirmek için, tek bir onkojenini aşırı ifade çok kararlı transgenik çizgiler, ilk oluşturulan ve tümör indüksiyonu yol açacak bir seviyede transgen ifade hattı için taranması gerekecektir. Fakat, eğer bir aday o aşırı ekspresyonuncogene germ hücreleri için toksik olan, doğrudan transgen 29 aşırı eksprese eden stabil bir transgenik çizgiden üretmek zordur. Dolayısıyla, bu yaklaşım uygun bir kanser modeli oluşturmak için başarısızlık riski yüksek olan, zaman alıcı olabilir. Burada, in vivo fonksiyonel genomik çalışma için geleneksel sabit transgenesis benzersiz avantajlar sağlamaktadır mozaik geçici transgenezi (Şekil 1B) dayalı bir alternatif strateji göstermektedir. Bu yaklaşımda, bir veya daha fazla transgen yapıları transgenik ya da vahşi türdeki embriyo tek hücreli aşamada enjekte edilir. transgenleri ihtiva eden enjekte DNA yapıları, tek tek balık 30, çok hücreli bir popülasyon içindeki karıştırılmış genotipler ile sonuçlanan, daha sonra mosaically rastgele primer enjekte balık entegredir. Ayrıca, birden fazla DNA ko-enjeksiyon tek hücreli embriyolar yapıları birlikte entegrasyon rasgele sitelerde aynı hücreye, Tra için izin açarTransjenlerin hücreleri ce ve mozaik hayvanlarda 31 hastalık patogenezi sırasında farklı genlerin etkileşimi keşfetmek. Prensip kanıtı olarak, geçici olarak doğal tipte balık ve MYCN ifade eden transjenik balık dopamin beta hidroksilaz (d βh) promoteri kontrolü altında, periferal simpatetik sinir sistemi (PSNS) &#39;de MCherry raportör geni ile mutationally aktive ALK (F1174L) aşın. bir reseptör tirosin kinazını kodlamaktadır ALK, yüksek riskli nöroblastom 5-7,32,33 de en sık mutasyona genidir. ALK en yaygın ve potansiyel somatik aktive mutasyonlar olarak (F1174L), temsil edilen aşırı bir MYCN- yüksek riskli hastalar nöroblastom büyütülmüş ve stabil bir transgenik fareler ve transjenik zebra balığı model 8,34,35 hem de nöroblastom tümörogenez hızlandırmak için MYCN aşırı ekspresyonu ile sinerjize etmektedir. Mozaik tarafındanMYCN transgenik balık mCherry ile ALK (F1174L) geçici olarak aşın, mozaik transgenezi stratejisi için hızlı ve etkili bir şekilde kullanılabileceğini düşündüren, ALK (F1174L) ve MYCN hem aşırı ifade eden stabil transgenik balık gözlemlenen tümör başlangıç ​​ivme değinmeyecek in vivo tümör başlatılması birden onkojenlerin göreceli katkıları değerlendirmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Expand Long Template PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td style="width:119px;">11681834001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR-TOPO vector&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:119px;">451641</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td style="width:119px;">M0202M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway LR Clonase II enzyme 
			Mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#174; BP Clonase&#174; II enzyme mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">GC-RICH PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td>12 140 306 001</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Meganuclease I-SceI&#160;</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon digital sight DS-U1 camera</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Mutationally aktif ALK F1174L veya vahşi tip ALK aşın nöroblastom indüklenmesinde MYCN ile işbirliği olup olmadığının araştırılması için, MYCN ifade eden transjenik balık PSNS d βh promoterinin kontrolü altında aktive edilmiş insan ALK ya da vahşi-tipli insan ALK ya aşın. ALKF1174L veya dβh - - aşağıdaki yapıları, dβh herhangi biri ALKWT, dβh ile birlikte enjekte edildi - mCherry te...

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis at JoVE.com

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis | Developmental Biology | Video

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-functional-genomic-analysis

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Genetics

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

11.0K Görüntüleme.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Video: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...