Bu yöntemler nöroblastom metastazının ilk zebra balığı modelini geliştirmek için kullanılmıştır. Ve bu modelin nöroblastom riski yüksek hastalarda görülen metastazın birçok özelliğine sadık bir şekilde yeniden sahip olabileceğini göstermek için. Bu metastatik zebra balığı modelinin ana avantajı, metastazın ne zaman ve muhtemelen nasıl oluştuğunu daha iyi anlamak için tümör yayılımının gerçek zamanlı in vivo görüntülemesidir.
Bu teknik nöroblastom için özel değil. Tümör hücreleri tanımlanabildiği ve bir dizi olasılığa yol açan izlenebildiği sürece çeşitli kanser türlerinin zebra balığı modellerine uygulanabilir. Başlamak için, MYCN ve LMO1 transgenik çizgilerini melezleyerek hem MYCN hem de LMO1'i aşırı ifade eden heterozipöz transgenik bir balık hattı geliştirin.
Döllenmeden sonra bir günde, EGFP pozitif noktaları olarak sunulan EGFP ekspresyasyonu için outcross soyunu sıralamak için stereoskopik bir floresan mikroskobu kullanın. Sıraladıktan sonra, taranmış embriyoları ayrı Petri kaplarına izole edin ve bulaşıkları MYCN pozitif veya MYCN negatif olarak etiketlendir. Döllenmeden üç ila dört gün sonra LMO1 ekspresyasyonu için her iki grubun embriyolarını görselleştirin ve sıralayın.
Özellikle arka beynin oblongata medullasında hem üstün servikal ganglion hem de PSNS olmayan dopaminerjik nöronal hücrelerde kırmızı floresan lekeler arayın. Embriyolar döllenmeden beş gün sonrasına ulaşmadan önce taramayı gerçekleştirin. Daha sonra sıralanmış balıkları farklı genotiplerden oluşan dört gruba ayırın ve etiket yalnızca MYCN, yalnızca LMO1, MYCN ve LMO1 hem de vahşi tip olarak etiketlendirilir.
Standart protokollere göre aynı koşullarda yükseltin. Tümörü görüntülemek için her iki yan tarafında metal bir spatula ile balıkları hafifçe çevirerek stereoskopik floresan mikroskopla tümörleri görselleştirin. Olası tümör taşıyan balıkların tanımlanmasından sonra, onları doğum tarihini, tümörün tarandığı tarihi ve genotipi içeren uygun etiketlerle ayrı bir tankta izole edin.
Döllenmeden altı hafta sonra, daha önce taranmış balıklar için tümörlerin varlığını doğrulamak veya yeni olası tümör taşıyan balıkları tanımlamak için tümör taşıyan balıkları ve tümör olmayan balıkları taramak için önceki adımları tekrarlayın. Floresan pozitif kütlenin ve onaylanmış tümör taşıyan balıkların sürekli veya artan boyutunu arayın. Tümör taşıyan balıkları tanımladıktan sonra, tümör genesis birincil bölgesinden uzakta küçük EGFP veya mCherry pozitif tümör kitleleri olarak ortaya çıkan tümör hücre göçü kanıtı için onları iki haftada bir izleyin.
Bu balıkları gerektiğinde ayrı tanklara izole edin ve olası metastazları belirtmek için uygun şekilde etiketlenin. LMO1 balıklarında heterozipöz MYCN'yi yorumladıktan ve soylarını sıralarken, EGFP MYCN ekspresyumu, Döllenme sonrası bir günde PSNS olmayan dopaminerjik nöronal hücrelerde belirgindi. Buna karşılık, LMO1 ekspresyolü hem PSNS hücrelerinde hem de PSNS olmayan dopaminerjik nöronal hücrelerde belirgindi.
Organlardaki dokularda floresan pozitif tümör kitleleri, bileşik transgenik balıklarda primer tümör bölgesinden uzak, hem MYCN hem de LMO1'in aşırı ekspresyonu ile tespit edildi, ancak sadece MYCN ekspresyonu ile transgenik balıklarda saptanmamıştır. Cerrahi bölümlerin H&E lekesi, primer tümörün nöroblastom hastasında primer hastalığın en yaygın yeri olan insan böbrek üstü bezinin zebra balığı eşdeğeri olan interrenal bez bölgesinden ortaya çıktığını göstermektedir. Böbrekler arası bezden uzak tümör kitleleri, böbreğin distal kısmı, yörüngesi, solungaç, dalak ve kalbin atriyal odasının iç duvarı dahil olmak üzere birden fazla bölgede tespit edildi.
Primer tümördeki tümör hücrelerinin PSNS nöroblast soyu ve tüm metastatik bölgeler doğrulandı. MYCN LMO1 tümörlerinde sadece MYCN'yi ifade eden tümörlere kıyasla önemli ölçüde artmış miktarlar ve PSR lekeli kollajen liflerinin kalınlığında artış saptanmıştır. Bu prosedürden sonra, metastatik kanserleri önlemek ve tedavi etmek için alternatif ajanların geliştirilmesine yol açabilecek yeni kanser tedavileri ilaç taraması ve test edilebilir.
