Bölüm 1: cDNA Floresan Etiketleme Cy3 boya mikroarray deneyde kullanılan fotoğraf bozulmaya karşı hassas. Bu prosedür, bir ışık az miktarda yer almalıdır. Etiketleme protokol BioPrime Array CGH Genomik Etiketleme Sistemi Kılavuzu 1 uyarlanmıştır. <ol><li> Etiketleme reaksiyon için reaktifler -20 ° C&#39;de saklanır. BioPrime Array CGH Genomik Etiketleme Sistemi çözülme 2.5X Rastgele Primer Buffer, 10X dCTP karışımı, ve nukleaz ücretsiz su. Ayrıca Cy3 dCTP boya Çözülme. Çözündükten sonra, kısa bir süre kullanmadan önce tüm reaktifler santrifüj. </li><li> Ayrı bir etiketleme reaksiyonu analiz edilecek her cDNA bir örnek için tamamlanması gerekecektir. 0,6 ml kalın duvarlı bir tüp içine 86 ul toplam hacmi elde etmek için cDNA 500 ng, 40 ul 2.5X Rastgele Primer Tampon ve nukleaz ücretsiz su ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve kısaca santrifüj. 5 dakika reaksiyon 100 ° C bir termalcycler inkübe edin. </li><li> Derhal reaksiyon 10 dakika buz banyosunda bulamaç haline transferi. </li><li> Her bir tüp sonra 10 ul 10X dCTP karışımı, 2 ul 1 mM Cy3-dCTP ve 2 ul Exo Klenow DNA polimeraz ekleyin. Exo Klenow DNA polimeraz dondurucuda sol ihtiyaç kadar olmalı ve her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> Iyi reaksiyon karışımı ve kısa süreli santrifüj. </li><li> 37 ° C&#39;de 16 saat bir PCR reaksiyonu inkübe edin. </li></ol> Bölüm 2: Etiketli cDNA Yağış <ol><li> NimbleGen Hibridizasyon Sistemi protokol sırayla devam eden ve önce 42 ° C&#39;ye kadar sistem dengeye izin </li><li> Her reaksiyon için Microcon sütun, 1.5 ml tüp içine yerleştirin. 300 ul 0.1x SSC etiketleme reaksiyonu (100 ul) içeriğini her sütun ekleyin. </li><li> 4 10 dakika 16,100 xg&#39;de sütun içeren tüp ° C Santrifüj </li><li> Hafif pembe renkli olması ve başka bir 300 ul 0.1x SSC, sütun ekleyebilirsiniz yoluyla akışı, atın. </li><li> 16,100 xg&#39;de 10 dakika santrifüj tekrarlayın 4 ° C </li><li> Üzerinden akış atın ve ek bir 300 ul 0.1x SSC sütun ekleyin. </li><li> 12 dakika için 16,100 xg&#39;de santrifüjleyin 4 ° C </li><li> Akış atın. Yoluyla akışı bu son yıkamadan sonra açık olmalıdır ve sütun pembe etiketli cDNA görmek mümkün olmalıdır. </li><li> Sütununda 100 ul nükleaz içermeyen su uygulayın. 1.5 ml tüp sütunu kaldırmak ve yeni bir 1.5 ml tüp içine sütun ters. </li><li> 2 dakika boyunca 2.300 xg&#39;de santrifüjleyin 4 ° C Etiketli cDNA, tüpün alt kısmındaki toplar su rehidrate edilmelidir. </li><li> DNA konsantrasyonunun hesaplanması ve nükleotid Cy3 oranı 23,15 ile çarpılır A 260 / A 550 oranı eşittir oranı boya baz hesaplanırken boya dahil değerlendirmek için, üreticinin talimatlarına göre bir NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanın . Boya oranı baz 50 ve 80 arasında olmalıdır. </li><li> CDNA yeterince etiketli Eğer, kısım 6 mikrogram yeni bir 1.5 ml tüp içine cDNA etiketli. </li><li> 3 M NaOAc pH 5.2, 0.1x hacmi ve izopropanole 1X hacmi karıştırın. Karışım, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe izin verin. </li><li> Sonraki oda sıcaklığında 20 dakika 16,100 xg&#39;de örnek santrifüj. </li><li> Pembe renk olmalıdır DNA pelet, bozmadan süpernatantı dikkatle atın. </li><li> 500 ul% 70 EtOH ve hafifçe çevirerek karıştırın ekleyerek bir etanol yıkama yapın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 16,100 xg&#39;de örnek santrifüjleyin. </li><li> Tüp, invert süpernatantı ve pelet 5 dakika kurumasını bekleyin. Bu aşamada pelet -20 saklanabilir ° C istenen veya protokol hibridizasyon adıma devam edilebilir. </li></ol> Bölüm 3: Hibridizasyon Gen İfadesi Analizi 2 Roche NimbleGen Diziler Kullanım Kılavuzu hibridizasyon işlemi uyarlanmıştır. <ol><li> 5 ul nükleaz ücretsiz su pelet çözülür. </li><li> Sonra pelet Tablo 1&#39;de yer alan hibridizasyon bileşenleri eklemek çözülür. Hibridizasyon bileşenleri Roche NimbleGen Hibridizasyon Kiti. Tüm bileşenleri eklendikten sonra toplam hacmi 18 ul toplam gerekir. İyice karıştırın ve kısaca altta içeriğini toplamak için tüp spin. </li><li> Bir sonraki adım, 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de ısı bloğu üzerine yerleştirerek etiketli cDNA doğasını. </li><li> Diziler aşağıdaki adımları hazırlanan NimbleGen Hibridizasyon Sistemi hemen tüp transferi. </li><li> Mikroarray&#39;ler her zaman dikkatli ve üreticinin talimatlarına göre muhafaza edilmelidir. Roche NimbleGen karanlıkta, oda sıcaklığında kurutucu ile ifade dizileri depolamak önerir. </li><li> NimbleGen dizi işleme aksesuarları Hassas Mikser Hizalama Aracı (PMAT) dizi yükleyin. </li> &lt;li&gt; PMAT üzerine X1 mikser Yük ve forseps ile yapışkan şeridi çıkarın. PMAT güvenli bir şekilde kapatın. PMAT delikten miksere basınç uygulayın ve yavaş yavaş, dizi ve karıştırıcı PMAT boşa bu kadar açık. </li><li> Sıkıca diziye sızdırmazlık sağlamak için mikser dışında çevresinde brayer basınç uygulayın tamamlandıktan ve varsa kabarcıkları giderin. Sıcak dizi mikser karmaşık melezleme sistemi üzerine yerleştirin. </li><li> Bir pipeti kullanarak, yavaş yavaş dolgu portuna etiketli örnek 15 ul ekleyin. Bu mikser merkezinde bulunan delik. Pipet örnek herhangi bir hava kabarcığı olmadan karıştırıcı ile eşit şekilde yayılır, böylece yavaş ve sabit bir basınç uygulayın. Liman deliklerden herhangi bir aşırı örnek silin ve yapışkanlı şeritler ile bağlantı noktası delik mühür. </li><li> Mandalı kapatın ve B NimbleGen Hibridizasyon Sistemi program kullanarak hibridizasyon çözüm karıştırma başlayın. Mikroarray&#39;ler 16-20 saat melezleşme izin verin. </li></ol> Bölüm 4: Post-hibridizasyon yıkar ve Mikroarray taranması Gen İfadesi Analizi 2 Roche NimbleGen Diziler Kullanım Kılavuzu yıkama ve tarama yönteminin uyarlanmıştır. <ol><li> Hibridizasyon Tablo 2&#39;de belirtildiği gibi yıkama tamponlar hazırlamak tamamlanması yakındır. 42 Pre-sıcak Yıkama Tampon IA ° C su banyosu. </li><li> GenePix 4000B dizi tarayıcı açın ve tarayıcı kullanmadan önce yaklaşık 15 dakika için ısıtın. </li><li> Önceden ısıtılmış Yıkama Tampon IA bir çanak içine dökün. </li><li> Jig (NimbleGen dizi işleme aksesuarları ürünle verilir) NimbleGen Hibridizasyon sistemi ve slayt dizi mikser kompleksi çıkarın. Batmak montaj ve önceden ısıtılmış Yıkama Tamponu IA içine dikkatlice kaydırarak soyma mikser kaldırmak. </li><li> Yıkama Tamponu IA 15 saniye jig ve ajitasyon dizi çıkarın. </li><li> Hızla, oda sıcaklığında Yıkama Tampon IB bir slayt rafa dizi transfer. Slayt raf 2 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. </li><li> Yıkama Tamponu II içine slayt raf transferi ve 1 dakika boyunca ajitasyon. </li><li> 15 saniye yıkayın Tampon III ve ajitasyon içine slayt raf transfer. </li><li> Dizi santrifüj kurutma slayt içine aktarın ve tüm nemi çıkarmak için 2 dakika boyunca döndürün. Tarama geçin. </li><li> Bu boya, ışık ve ozon hem de duyarlı olduğundan hemen dizi tarama önerilir. </li><li> GenePix 4000B dizi tarayıcıya dizi, barkod, aşağı yükleyin. </li><li> GenePix Pro yazılımı açın ve dizi tarama geçin. Roche NimbleGen gen ekspresyonu dizileri bir renk hibridizasyon strateji kullanmaktadır. Sonuç olarak sadece tek bir dalga boyu tarama için gereklidir. 532 nm lazer kullanarak Cy3 floresan sinyal tarayın. Donanım ayarı iletişim kutusunu açın ve değeri 500 - 532 nm lazer DEVRESEL_ÖDEME değerini ayarlayın. </li><li> Donanım ayarı iletişim kutusunda,% 100, ortalama 1 ila 5 mikron piksel boyutu, hatları, güç ve 0 mikron konumda odak. </li><li> Bir önizleme tarama yapın ve tarama alanını ayarlayabilirsiniz. </li><li> Taraması gerçekleştirin. </li><li> Bir kere tarama görüntü histogramı kontrol tamamlandı. İdeal 1e-5 normalize sayar özellikleri ~% 1-2 doymuş olduğu 65.000 doygunluk sınırı anlamı olmalıdır. Normalize sayar 1e-5&#39;ten az ise, PMT kazanç ve rescan slayt artar. Normalize sayımları 1e-5&#39;ten büyük ise, PMT kazanç ve rescan slayt azalır. </li><li> Bir kere tarama görüntüyü kaydetmek tamamlandı. Bu görüntüler için referans kolaylığı için standart bir adlandırma kuralı seçmek için tavsiye edilir. Görüntü veri normalleştirme ve yoğunluk değerlerinin hesaplanması için tercih veri analiz programı yüklenebilir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Önce 0.1x SSC ile yıkar başlayan cDNA Cy3 floresan etiketleme reaksiyon verimliliğini değerlendirmek için başlayabilir. Sonraki her yıkama sırasında üzerinden akış yoluyla geçen akışı ile açık renk daha az pembe haline gelmelidir. Buna ek olarak, bu yıkama adımları sırasında Cy3 etiketli cDNA ürün sütun üzerinde görünür olmalıdır. Üzerinden akış rengi parlak pembe veya sütununda herhangi bir pembe ürün varsa, bu etiketleme tepki doğru devam etmediği iyi bir göstergedir. Etiketleme reaksiyon nicel etiketli DNA ve baz boya oranı (Şekil 1) konsantrasyonunu belirlemek için NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak değerlendirilebilir. Etiketleme tepki rutin laboratuvarda en az 10 mg işaretli DNA elde edilir. Boya dahil, Cy3 oranı nükleotid 23,15 ile çarpılır A 260 / A 550 oranı eşittir basit bir temel / boya oranı ile hesaplanır . 50-80 gelen değişen değerler etiketleme reaksiyon yeterli boya dahil göstermektedir. Etiketleme reaksiyon mikrofon üzerine, DNA veya kötü boya dahil, örnek hibridizasyon bir düşük konsantrasyonda verimleriroarray tavsiye edilmez ve etiketleme reaksiyon tekrar edilmelidir. Görüntü histogramı ve mikroarray taranan görüntü (Şekil 2) değerlendirerek hibridizasyon kalitesinin değerlendirilmesi yapılabilir. Kabul edilebilir döllemeler doymuş özellikleri% 1-2 (yani, verimli 1e-5 65.000 doygunluk sınırını normalize sayar) PMT değeri 500 yakındır. PMT değeri 1e-5 normalize sayıları 65.000 doygunluk sınırını elde etmek için 500 büyük ölçüde ayarlanabilir varsa, bu genellikle kötü mikroarray etiketli cDNA hibridizasyon gösterir. Veri kalitesi, veri sonraki analizi ile devam eder oluşacaktır. Hibridizasyon kalitesi de niteliksel olarak taranan bir dizi (Şekil 3) görüntüleri izlemek tespit edilebilir. Roche NimbleGen Hibridizasyon Kiti bir hizalama oligo karışımı Cy3 ve diziler üzerinde hizalama özellikleri melezleşme Cy5 etiketli 48mer oligonükleotidler içerir. Hizalama oligos yoğunluğu dizinin diğer özellikleri kalitatif değerlendirme dizinin üzerine floresan etiketli cDNA hibridizasyon verimliliği üzerinde bir kalite kontrol izin verir. Yapılan incelemelerden sonra, bir scatter plot analiz veri gen ekspresyonu göreli düzeylerini belirlemek ve farklı örnekleri (Şekil 4) arasında ifade edilir genleri tanımlamak için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="Şekil 1 Thumbnail" /> Şekil 1. CDNA Cy3 ile etiketlenir. Etiketli cDNA verim ve boya dahil NanoDrop spektrum NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak değerlendirilebilir. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="Şekil 1 Thumbnail" /> Şekil 2. Hibridizasyon mikroarray tarama Kalite için GenePix histogram görüntü histogramı değerlendirerek tespit edilebilir. Kabul edilebilir döllemeler özellikleri 1e-5 normalize sayıları ile 500 yakın PMT değeri 65.000 doygunluk sınırı doymuş% 1-2 olacaktır. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Taranmış mikroarray görüntü Hibridizasyon kalite mikroarray taranan görüntüyü görüntülerken tespit edilebilir. Görüntü özelliği floresan doğru hesaplama önlenmesi, böylece toz veya diğer engel faktörler her özellik görselleştirme yasaklayan varlığı için incelenir ve olmalıdır. Hizalama oligos yoğunluğu hibridizasyon verimliliğini değerlendirmek için dizi diğer özellikleri mukayese edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Bir analiz mikroarray deney scatter plot Bu prosedürün amacı farklı örneklerinde ifade genleri tanımlamak için. Mikroarray verileri daha detaylı analiz ve farklı ifade genleri görselleştirmek için bir scatter plot görülebilir. Tablo 1 Roche NimbleGen Hibridizasyon Kiti Bileşenleri hibridizasyon adım 2 eklemek için. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> Örnek (suda çözünen) </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> 2X Hibridizasyon Arabelleği </td><td> 9 ul </td></tr><tr><td> HYB A </td><td> 3.6 ul </td></tr><tr><td> Hizalama Oligo </td><td> 0.4 ul </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 18 ul </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Hibridizasyon Aşağıdaki diziler, yıkama için hazır olmak tamponlar yıkayın. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Yıkama Tamponu IA * </td><td> Tampon IB yıkayın </td><td> Yıkama Tamponu II </td><td> Yıkama Tamponu III </td></tr><tr><td> Su </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td></tr><tr><td> 10X Yıkama Tampon I, II ve III </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M DTT </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td></tr></tbody></table> 42 * Ön-sıcak ° C

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , (2008).</li></ol>

Burada ayrıntılı dahil olmak üzere birçok mikroarray protokolleri, hibridizasyon ölçme ve nicel bir araç olarak floresan boya kullanın. Cy3 floresan boya, fotoğraf ve ozon bozulması duyarlı. Bu prosedür minimal aydınlatma yapılan olması tavsiye edilir. Buna ek olarak, küçük toz parçacıkları hibridizasyon ve tarama engelleyebilir. Çalışma alanını temiz ve tozdan arındırılmış emin olmak için özel dikkat verilmelidir. Bu prosedürde açıklanan etiketleme proto...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Array Microcentrifuge Dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C-1303-T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioPrime Array CGH Genomic Labeling System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18095-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanine 3-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>NEL576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Array Processing Accessories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223539001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223474001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization System 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223652001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223504001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X1 Mixers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223725001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

global gene expression analysis using a zebrafish oligonucleotide microarray platform

Roarray teknolojisi genom bazında transkript seviyeleri kantitatif ölçüm ve gen ekspresyon profil izin verir. Roarray teknolojisi uygulamaları gelişimsel aşaması ile ilgili olarak küresel bir hastalık durumu gen ekspresyon analizi de dahil olmak üzere çeşitli pek çok biyolojik disiplinlerde kullanılan ve zehirli yanıtlarında. Burada, küresel gen ekspresyon analizi kapsamlı bir zebrafish özel oligonükleotid mikroarray platformu kullanarak bir göstergesi sayılabilir. Zebrafish ifade mikroarray platformu hedef yüzde 12 problar kadar 37.157 hedefleri sorguya 385.000 probları, uzunluğu 60 baz çifti içerir. Bu platform için, Zebra balığı kullanılabilir tüm cDNA ve genomik bilgiler Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (dahil olmak üzere çeşitli genomik veritabanlarından toplanmıştır. http://genome.ucsc.edu) ve ZFIN (http://www.zfin.org). Sonuç olarak bu ifadeyi dizi güncel zebrafish transcriptome tam kapsama alanı sağlar. Zebrafish ifade mikroarray Roche NimbleGen (Madison, WI) tarafından basılmıştır. Bu teknik bir gösteri floresan cDNA bir ürün etiketleme, etiketli cDNA ürün mikroarray platformu hibridizasyon, ve tek renk analizi strateji kullanarak sinyal alımı için dizi tarama içerir.

Watch this Scientific Journal Video about Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform at JoVE.com

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gen mikroarray&#39;ler genom düzeyinde gen ekspresyonu güçlü araçlardır. Bu teknoloji, gelişim biyolojisi ve toksikoloji de dahil olmak üzere biyolojik disiplinlerin çeşitli uygulaması vardır. Bu video zebrafish için kapsamlı bir oligonükleotid mikroarray platformunu kullanarak küresel gen ekspresyon analizi için detaylı bir protokoldür.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

global-gene-expression-analysis-using-zebrafish-oligonucleotide

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Görüntüleme.  Purdue University. Gen mikroarray'ler genom düzeyinde gen ekspresyonu güçlü araçlardır. Bu teknoloji, gelişim biyolojisi ve toksikoloji de dahil olmak üzere biyolojik disiplinlerin çeşitli uygulaması vardır. Bu video zebrafish için kapsamlı bir oligonükleotid mikroarray platformunu kullanarak küresel gen ekspresyon analizi için detaylı bir protokoldür.

Video: Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Zebra balığı Gal4 kullanma Gene Yakalama

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...