Tüm yazarlar NHMRC CTC, Sydney, Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (JDRF), Avustralya Üniversitesi ve Rebecca Cooper Vakfı, Avustralya altyapı desteği kabul. Bu araştırma WW, RJF Aah Avustralya Araştırma Konseyi (FT110100254) ve JDRF, Avustralya (CRN201314) hibe yoluyla finanse edildi ve MVJ tüm ıslak laboratuvar deney yürütülen, ASJ veri analizi gerçekleştirmiştir. WW ilk taslağını yazdı. AAH çalışma planlanmış ve verileri analiz. Tüm yazarlar okuma ve yayımlanmak üzere gönderilen el yazması, rakamlar ve çalışma nihai sürümü üzerinde anlaştılar.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell.">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development,+regeneration+and+diabetes.">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li><li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes.">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development.">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li><li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer.">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies.">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24 (2006).</li><li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects.">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89 (2009).</li><li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients.">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li><li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases.">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer.">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148 (2008).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3.">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li><li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs:+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR.">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma.">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292 (2014).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media.">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury:+A+TaqMan(R)+Low+Density+Array+study.">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms:+microarray,+beads+array,+and+quantitative+real-time+PCR+array.">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167 (2011).</li><li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer.">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li><li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens.">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta, ., V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

Madde işleme / yayın masrafları yayın için bu yazının kabul edilmesini müteakip, Life Technologies tarafından karşılanmıştır.

doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek prob-temelli QPCR protokoller çerçevesinde kritik adımlar RT-ürünün aynı hacim ve konsantrasyon her qPCR reaksiyon yüklenen) emin 1 yapmak için vardır, 2) bileşenleri doğru oranları ve hacimleri için gerekli QPCR Reaksiyon hazırlandı ve de, 3) doğru ve tutarlı hacimleri qPCR reaksiyon eklenir karıştırılmış ve hala dikkatli ise 4) her bir numune ve reaksiyon, karışımın hazırlanması ve yüklenmesi, mümkün olduğu zaman, en kısa sürede tamamlanır edilir Yukarıdaki kritik adımlar daha önce belirtildiği. Mikroakiskan dizi kartları uygun santrifüj ve özel kovalar gerekir. Her kova 3 kartları (yüklü / boş) kadar tutabilir. Her bir kova 3 slot işgal ve kepçe santrifüj karşı yuvasına benzer kova (bu kova da boş veya tam 3 kart, içermelidir) koyarak dengeli olduğundan emin olun. Kepçeli kartı yerleştirilirkent tutucu, 8 rezervuarlar yukarı proje ve reaksiyon kuyuları santrifüj dış duvar baktığından emin olun. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 331 x g&#39;de kartları dönerler. İlk spin sonra, santrifüj açmak ve görsel reaksiyon karışımı 384 kuyudan dağıtılan olmuştur emin olun. 1 kez daha aynı ayarlarda sıkma tekrarlayın. Kova kartı çıkarın ve 8 rezervuarların her reaksiyon karışımı seviyesi muntazam olduğundan emin olun. Rezervuar sol sıvı hacminde herhangi bir tutarsızlık daha kullanmak için kart uygunsuz olun. RT ürünün aynı konsantrasyona sahip olmak üzere, RNA aynı giriş konsantrasyonu, her bir RT reaksiyonu ilave edilir. Toplam RNA konsantrasyonu, bir mikro-volumespectrophotometer kullanılarak ölçülür. gözlenen 260/280 oranı, plazma / serum izole edilen RNA için 1.3 kadar düşük olabilir; mansap qPCR ilgili işlem veya veri 30 oluşturulan bu bir etkiye sahip görünmemektedir. Aynı şekilde, 260/280 oranıBurada test edilen RNA örnekleri gözlenen qPCR hiçbir anormal etkisi ile 1,3-1,7 arasında idi. Bu tür Biofluids gelenler gibi düşük RNA içerik örnekleri kullanarak, bu işlemden önce RNA miktarını belirlemek için zor olabilir. Biz RNA izolasyonu sentetik başak-in kullanımı yanı sıra ters transkripsiyon aşamalarını öneririz. Bizim deneyim, Arabidopsis thaliana miRNA adayları (sporcudan-miR-159a ve sporcudan-miR-172a) bizim deneyim yüksek olabilir, (örneğin cel-miR-39 ya da cel-miR-54 gibi) Caenorhabditis elegans miRNA&#39;lar tercih edilir A. daha benzerlik thaliana. Böyle sahne özgü başak-in kullanımı, farklı zamanlarda tahlil birden numuneler arasında miRNA veri normalleşmesi için hesap edebilirsiniz. CDNA sentez reaksiyonu için RNA sabit giriş hacmi kullanılması da 32,33 tavsiye edilir. miRNA ölçümü için üç prob-tabanlı protokoller burada anlatılan değişen miktarlarda ihtiyaçToplam RNA girişi, farklı iş akışları ve maliyetleri. Iş akışlarının her biri MiRNA hedeflerin sayısının ve analiz edilecek numune sayısına göre farklı bir verim sağlamak için tasarlanmıştır. Artan verim (384 rxn 3072 rxn 96 rxn) ile birlikte, reaksiyon başına maliyeti, zamanda bir birim elde edilen veri miktarı bir artması ile azalmaktadır. Bu platformların her TaqMan kimyası kullanmak için, elde edilen verilerin kalitesi benzer olması beklenebilir. TaqMan qPCR serum / plazma örneklerinde 9,11,27 yılında miRNA&#39;lar bolluğu tanımlamak için köklü bir yöntemdir. Burada ele alınan üç platform aynı kimya paylaşmalarına rağmen reaksiyon hacminde bir azalma transkript tespit dinamik aralığı içinde bir azalma (Farr, RJ ve diğ., Yayınlanmamış veriler), yol açar. 96-kuyu qPCR platformu düşük verim, ancak yüksek hassasiyet platformudur ve bizim görünümünde, tüm prob-tabanlı (ya bazlı boya) PCR platformları için &quot;altın standart&quot;. Bununla birlikte, bu zararNumunelerin birkaç yüz veya binlerce tahlil ve birden microRNA için ediliyorsa en ekonomik ya da verimli bir platform değildir. Mikroakiskan (TLDA) ve NANO AKIŞKAN (OA) platformlar kısa sürede büyük veri alma sağlamak için tasarlanmış yüksek verimli / içerik platformları vardır. Toplu farklılıklar TLDA kartları gözlenmiştir, ancak bu aynı partiden TLDA kartı talep ile en aza indirilebilir. Düşük bolluk miRNA&#39;lar TLDA kartları farklı gruplar aynı örneği kullanarak test edildiğinde - Biz TLDA platformu (Şekil 3) orta% 17&#39;sinde belirgin farklılıklar gösterdiğini görüyoruz. Bu nedenle TLDA kartlarını kullanarak analiz için aynı parti numaralarını kullanarak öneririz. Bu değişim aynı zamanda olası yükleme ve pipetleme hataları da dahil olmak üzere teknik değişkenlik nedeniyle olabilir. Ancak, biz TLDA kartları aynı toplu talebinde / önerisi. Önemli bir parti değişimi OA platformunda gözlenmiştir. Buna rağmen, TaqMan experimen tabanlıtal qPCR plazma / serum örneklerinde miRNA&#39;lar bolluğu ölçmek için teklif kolaylığı yaklaşır. Burada tartışılan, düşük, orta ve yüksek kapasiteli yaklaşımları son derece verimli, tekrarlanabilir ve temiz (düşük arka plan gürültü) kimya kullanılarak numunelerin ve miRNA&#39;ların bir dizi analiz esneklik sunuyor.

MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;ların) gen ifadesinin 1-3 düzenleyicileri olarak işlev, ~ 22 nükleotid kodlayıcı olmayan (NC) RNA bulunmaktadır. Hayvanlarda çoğu miRNA&#39;ların gen ifadesinin 2-4 negatif regülasyonuna yol açar 3 &#39;UTR, hedef, bir mRNA ile sekansa özel baz eşleştirme yoluyla işlev görür. Bu, genellikle, mRNA dönüşümünün bir engellenmesi ile veya ribozomal açılan kapalı gerçekleşir. Dolaşımdaki miRNA&#39;ların diyabet 5-7, yumurtalık 8, prostat 9 ve meme kanseri 10,11, hepatit B 12 ve diğer otoimmün hastalıklar 13 gibi hastalıkların, çeşitli araştırma ve klinik alanlarında yeni biyomarkerler olduğu gösterilmiştir. Araştırma daha erişilebilir ve 9,11-15 daha az invaziv insan plazma ve serum örneklerinden, dolaşımı gibi, farklı hücrelerde veya dokularda bol miRNA&#39;lar tespit için yapılmıştır. MiRNA miktar Farklı yöntemler, e olmuşturBu tür standart 96-plaka platformu 4,12,16-18, Mikroakiskan kartı platformu 12,18-23 ve NANO AKIŞKAN dizisi platformu 17,24 gibi birden çok platform kullanarak stablished. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) çoklu (dye- veya prob-bazlı) kimyaları kullanarak transkript göreceli veya mutlak sayıları ölçmek için yeteneği sunar. Probe-tabanlı gerçek zamanlı PCR kimya, tek bir transkript kopya tespit etmek için düşük eşiğe ve yüksek hassasiyet yarar vardır. Nispeten miktarının ve miRNA ifade 25 belirlemek için ona bir tercih yöntemi yaparak, etkin kullanımı basit ve son derece tekrarlanabilir mal edilir. Transkripsiyon (RT) ve qPCR 4,26,27 ters: Probe-tabanlı qPCR yöntemi genellikle iki adımdan oluşur. Sap-halka RT primer olgun veya birincil MiRNA molekülüne hibridize tamamlayıcı (c) DNA haline dönüştürülür burada RT. CDNA ürününün miktarının belirlenmesi sonra MiRNA özgü PCR primerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir26-28. sistemi tabanlı qPCR prensibi floresan-etiketli prob hidrolizini içerir, gerçek zamanlı olarak tamamlayıcı şerit uzantısı, tespitine dayanmaktadır. Bu sondalar, bir flüoresan raportör ve FRET (flüoresan rezonans enerji transferi) izin vermek için sadece ayrı olan bir söndürücü içerecek şekilde dizayn edilmiştir. Floresan muhabiri (verici) den emisyon Algılama söndürücü molekülünün yakınlığı ile maskelenir. Taq polimeraz (POL) ve yukarı akan primerde uzanır ve bir çatal (probun 5 &#39;ucu) ulaştığında, Taq pol ekzonükleaz aktivitesi söndürücü floresan damlatıcının fiziksel ayrılma / ayrılmasına yol açan sonda hidrolize eder. Floresan vericisi tek bir molekülün Bu sürüm, detektör tarafından kaydedilir ve çok iyi / reaksiyonundan flüoresan sinyalinde bir artış kademesi olarak sunulmuştur. Floresanstaki artış doğru qu izin üretilen PCR ürününün miktarı ile orantılıdıramplifiye edilmiş hedef 26,28 arasında antification. MiRNA miktarının artan talep ile birlikte, yüksek hacimli teknolojilere ortam numunelerinin daha fazla sayıda kısa bir miktarda işleme izin vermek için geliştirilmiştir. TaqMan Düşük Yoğunlukta Dizi (TLDA) bir plaka üzerinde analiz miRNA&#39;ların sayısında bir artış sağlar sistemi tabanlı qPCR kimyasına dayanan bir orta akış yenilikçi mikroakışkan tasarımdır. TLDA cDNA&#39;yı sentezlemek için kullanılan RT-primerler, önceden tanımlanmış bir havuz kullanılmasını içerir. Sonra, bu cDNA&#39;lar qPCR 22,26,29 kullanarak birden fazla miRN&#39;nın ekspresyonunu belirlemek için özelleştirilmiş bir 384 gözlü mikro-akışkan kart içine döndürülmektedir. Kartın her çukuru, bu nedenle tek bir TLDA kartı 26 içinde işlenebilir 384 reaksiyonlara, spesifik miRNA (ler) çoğaltmak için primerler ve problar, kurutuldu içerir. NANO AKIŞKAN dizi gen transkriptlerinin saptanması için kullanılan yüksek verimli bir platformdur <sup&gt; 24 ile aynı prob bazlı kimyası kullanılarak. Bu geçiş delikleri paslanmaz çelik slayt 24 3072 bir diziye 33 nanoliter reaksiyon karışımının kolay yüklemeyi kolaylaştırmak için hidrofobik-hidrofilik etkileşimler sunan özel bir matris kullanır. Bu makalede, serum / plazma içinde miRNA&#39;lar ölçülmesi için bu yöntemler uygulandı ve performans ve bu verileri yorumlarken dikkat edilmesi gereken kritik faktörler nasıl gösteren odaklanır. Hesaba alındığında, bireysel fayda ve sınırlamalar, bu makalede ele alınacak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

Bir doğru ve tekrarlanabilir bir analiz sağlayan en hassas algılama yöntemlerinin biri olduğu sistemi tabanlı bir kantitatif PCR (qPCR), kopya çokluğunu ölçmek için tercih edilen bir yöntemdir. Probe-tabanlı kimya diğer (boya-tabanlı) kimyaları ile karşılaştırıldığında en az arka plan floresan sunuyor. Halen, transkript bolluğu ölçmek için kullanan prob-tabanlı kimya kullanılabilir çeşitli platformlar vardır. 96 oyuklu bir plaka içerisinde QPCR ancak 96 numune veya miRNA&#39;ların sadece maksimum tek bir çalışma olarak test edilebilir en rutin olarak kullanılan bir yöntemdir. Numunelerin büyük bir sayı / miRNA&#39;ların analiz edilecek ise, bu, zaman alan ve sıkıcı bir iştir. Örneğin, mikroflüidik (örneğin TaqMan® Dizi Card) NANO AKIŞKAN diziler (örneğin, OpenArray) teklif kolaylığı gibi yüksek verimli tarama sistemi tabanlı platformların yeniden üretilebilir ve etkili bir şekilde kısa bir süre içinde numune çok sayıda çok sayıda mikroRNA bolluk tespit etmek. Burada, deneysel kurulum a göstermeknd hacmi artan düzeyi sunan sistemi tabanlı kimya ve üç değişik platformlar (96 boşluklu plaka, mikroflüidik ve NANO AKIŞKAN dizileri) kullanılarak, serum ya da plazma örnekleri EDTA gelen MiRNA nicelendirilmesi için protokol.

Bir miRNA prob-bazlı analiz qPCR reaksiyonu için önerilen hacim 20 ul. NOT: 5 ul bir reaksiyon hacmi 20 ul hacim 4,7,30 kullanılarak elde edilenlere benzer sonuçlar elde etmek mümkün olduğunu doğrulamıştır. 5 ul reaksiyon hacmi düşürülmesi duyarlılığında önemli bir kayıp olmadan reaktif maliyetlerinde% 75&#39;lik bir azalmaya da izin verir. Şekil 2&#39;de de görüldüğü gibi, reaksiyon, 20 ul hacimler ve 5 ul kadar (0.92 r 2, p = 0.0002) ile 39 döngü kadar güçlü bir eş ilişki olduğunu göstermektedir. Mikroflüidik dizisi, geleneksel 96 plaka PCR&#39;ler kıyasla çoklu örnekleri analiz daha etkili bir yoldur, (Kart A ve B Kart için) yaklaşık 5 saat içinde bir numunede ifade 754 miRNA&#39;lar verileri elde etmek için bir araç sağlar. &lt;B Bland-Altman arsa (gösterir - Biz aynı örnek için miRNA Mikroakiskan dizi kartları karşılaştırıldığında (Örnek A ve A tekrarlama Numune) Şekil 3A.Güçlü&gt; Şekil 3A), bu örnekler için test edilen bütün 754 miRNA&#39;ların korelasyonu arsa (3B). Kartları (Kart A ve B) birden çok yerde hem rastgele yerleştirilmiş 3 farklı kontrol miRNA&#39;ların (U6, RNU44 ve RNU48) vardır. U6 döngüsü eşiği (Ct) değerleri 2 koşular arasında karşılaştırıldığında, biz değerler (Tablo 4) arasında anlamlı farklılık gözlenmedi. Bu U6 değerlendirildi numunedeki fazla bolluk (alt Ct değeri) olarak ifade edilmektedir ki burada dikkat etmek de önemlidir. Daha sonra genel olarak katsayısı% 98 tayini (Şekil 3C-D) miRNA&#39;ların içindeki ifade vardı çalışır (n = 150), hem de 0-19,99 arasında Ct değerleri, tüm miRNA&#39;lar karşılaştırıldı. Betwee anlamlı fark miRNA&#39;lar sayısı. - Her iki çalışır, 20 ve 29,99 arasında Ct değerlerine sahip 277 miRNA&#39;lar, 16 Mirs özgün ve tekrar çalışır (F Şekil 3E) arasında anlamlı farklılıkCt değerleri, her iki çalışır (- H Şekil 3G) için 30-40 arasında seçildi zaman n çalışır (327 89) artmıştır. NANO AKIŞKAN dizi platformu Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, test edilen her serum / plazma numunesinden 754 miRNA&#39;ların için veri sağlar Bu amplifikasyon eğrileri incelemek için önemlidir -., tüm qPCR olduğu gibi - sonuç doğru amplifikasyon göstergesi olduğundan emin olmak için. 48 altdizilimlerden Her (Şekil 1) de üç en popüler &quot;temizlik&quot; ncRNAs için bir deneyi içerir:. U6, RNU44 ve RNU48 Şekil 4B U6 tipik bir kümelenme tek örnek çoğaltır göstermektedir. Bu çoğaltır düşük standart sapma (SD &lt;0.5) görüntüler ve böylece güvenilirlik bir göstergesidir. Seçenek olarak ise, Şekil 4C, bir ikinci numunede U6 çoğaltır (SD&gt; 0.5) daha fazla değişkenlik gösterir. Bu geçerlilik o ortadan kaldırmamaktadırKalan deneyleri f, her ne kadar daha kapsamlı bir eleştirisini gerektirecek yapar. U6, biyolojik sıvılarda en &quot;temizlik&quot; miRNA&#39;lar gibi, bir değişken ifade olabilir. Bu Şekil 4C&#39;de belirtilen örneklerin biri Şekil 4B&#39;de sunulmaktadır daha az U6 içeriği 4 kat görüntüler dikkate alınmalıdır. 4C&#39;de sunulan numunede U6 seviyesi bir panel 4B&#39;de sunulmaktadır daha başlamak üzere% 75 daha az olduğu için, daha büyük bir teknik değişkenlik küçük reaksiyon hacmi 17 daha da ağırlaştırmaktadır transkript Poisson dağılımına bağlı olarak tahmin edilmektedir. Çalışma tamamlandıktan sonra başka bir araçtır ihracat için kullanılabilir Kalite kontrol (QC) görüntüleri vardır. Bu bir seçim, her geçiş deliği doğru (Şekil 5) yüklenmiş olduğunu doğrulamak için ROX, qPCR reaktif karışımı bulunan pasif boya, flüoresansmı kullanır. Tr bir delik ya da gerçekten bir<html> Lastik altdizilim, yetersiz numune hacmi, buharlaşma, 384-numune plaka tamamen Accufill sistemi ya da ipuçları içinde örnek plaka mühür, ya da kusurları kaldırmak için başarısızlık kuyulardan mevcut kabarcıklar nedeniyle yük değil. Delikler aracılığıyla-gerçekte tahlil yüklü hiç zaman, &quot;saptanamaz&quot; olarak etiketleme miRNA&#39;lar önlemek için tespit edilmelidir Herhangi boşaltılır. Bu sorun, karşılaşılırsa örnek / master en az 5 ul 384 gözlü numune plakasının her oyuğuna yüklü olduğundan emin, Numune levhası, uygun bir şekilde, yükleme öncesinde santrifüjlenir, folyo conta tamamen uzaklaştırıldı, ve yüklenen OpenArray slayt mühürlü ve izleyen tüm koşular için ayrılan süre içinde çalıştırılır. Yükleme sorunları hala devam ediyorsa, bu daha büyük olasılıkla belirli bir toplu veya dizilerin çok veya ilgili sarf malzemeleri ve daha fazla yardım ilişkin olabilir üretici ile aranmalıdır. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52.586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: NANO AKIŞKAN Dizi iş akışı için numunelerin Düzeni: (A) Her 384 numune plaka kadar 8 NANO AKIŞKAN diziler için örnekleri tutabilir. (B) ile seyreltildi, ön-yükseltilmiş cDNA komşu 8 oyuklu grupları Havuz A ve Havuz B, 8 oyuk (4 sıra 2 sütun) yerleştirilir. Her daire bir kuyu temsil eder. (Cı) bir numunesi, plakanın her bir NANO AKIŞKAN dizinin bir alt dizisinde yüklenecektir. Her küçük kare bir SubArray temsil eder. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Şekil 2: Geleneksel 96-PCR platformları için Co-ilişki analizi: 20 ul ve BT değerleri (39 döngü) standart 96-plaka platformunu kullanarak TaqMan Gerçek zamanlı qPCR üzerinde 5 ul reaksiyon birimler arasında eş ilişkisi. 4 Farklı microRNA göre (miR-375, 4 farklı insan serum ve plazma örneklerinin miR-30c, miR-30d ve miR-7). Diğerleri saptanamayan beri sadece 11 veri noktaları çizilir. R, 2 = 0.92, p = 0.0002. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Şekil 3: (- B A) Mikroakiskan dizi kartlarını kullanarak miRNA profilleme Sirkülasyon 2 Mikroakiskan kartları (kart-A ve kart-B) kullanarak, 754 miRNA&#39;lar bir profil oluşturulur. Burada gösterildiği gibi, biz 2 Mikroakiskan dizi için aynı örneği kullanılan Mikroakiskan kartı sonuçlarının tekrarlanabilirliği kontrol etmek çalışır. Bu 0-19,99 arasında Ct değerleri ile, genel olarak miRNA&#39;ların benzer bir ifade, gözlenen (Cı - D). Tekrar çalışır arasında 20-29,99 ve önemli farklılıklar (F - E) arasında Ct değerleri ile birkaç miRNA&#39;lar (277 16) vardır. 327 Seksen dokuzyüksek Ct değerleri ile mikroRNAlar (30-40) Her iki çalışır (- H G) arasında önemli farklılıklar sergiledi. &#160; Veriler eşleştirilmiş T testi kullanılarak analiz edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Şekil 4: PCR Ürün Amplifikasyon Curves Temsilcisi Profili: Bir insan plazma numunesi için tüm miRNA hedefler kombine (A) amplifikasyon eğrileri temsili figür var. U6 için bir deney (ortak bir kontrol ncRNA) her alt dizisinde yerleştirilir. (B) örnek &lt;(0.5 (C), yüksek standart sapma SD) gösterirken (0.5 düşük değişkenlik SD)&gt; U6 çoğaltır içinde gösterir. Her iki numune de tota olaninsan plazmasından izole l RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Şekil 5: NANO AKIŞKAN Diziler QC Analizi: Bir doğru yüklendiğinden NANO AKIŞKAN dizi (solda) ve bir yanlış yüklenmiş NANO AKIŞKAN dizi (sağda) Kalite kontrolü (QC) görüntüler. (qPCR reaktif karışımı mevcut) pasif boya, ROX, bir doğru yüklendiğinden yoluyla-delik göstermek için fluoresces. Sağdaki dizi geçiş delikleri qPCR reaktif karışımı ile yüklenmez ve bu yanlış negatif PCR reaksiyonları olarak tespit edilmelidir birkaç Altdizilim / vardır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> 5 ul reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr&gt; <tr><td> RT tamponu (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTP (100 mM) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitör </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Nükleazlar içermeyen su </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Ters Transkriptaz </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tablo 1A: Standart bir 96-çukurlu plaka platformu kullanılarak TaqMan gerçek zamanlı qPCR için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> 5 ul reaksiyon başına Hacim (ul) </td><td> 20 ul reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Hızlı PCR masterkarışım (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR tahlil (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsizsu </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Toplam Hacim: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * Test, seçilen miRNA göre tahlil bileşeni. Tablo 1B: Standart bir 96-çukurlu plaka platformu kullanılarak TaqMan gerçek zamanlı qPCR bir 5 ya da 20 ul qPCR Reaksiyon hazırlanmasında QPCR reaktif karışım bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Astarlar (10x) </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> dTTP (100 mM) ile, dNTPler </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe Ters Transkriptaz (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Tampon </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitör &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 4,5 </td></tr></tbody></table> Tablo 2A: TLDA MiRNA panel için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp master (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Astarlar (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nükleazlar içermeyen su </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tablo 2B: TLDA MiRNA panel için bir 25 ul önceden amplikasyon Reaksiyon hazırlanmasında PreAmp reaktif karışım bileşenleri. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Astarlar (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dTTP (100 mM) ile, dNTPler </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe Ters Transkriptaz (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Tampon </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitör (20 U / ul) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 4,5 </td></tr></tbody></table> Tablo 3A: sistemi tabanlı NANO AKIŞKAN MiRNA panel için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşens </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp master (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Astarlar (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nükleazlar içermeyen su </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tablo 3B:. Prob-bazlı NANO AKIŞKAN miRNA paneli için bir 25 ul öncesi amplikasyon reaksiyon hazırlık PreAmp reaktif karışımı bileşenleri NOT: etkileşimli ek, üç platformlar için sağlanan excel tabloları zaten hata pipetle telafi etmek için% 5 ek hesaplar. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Numune A </td><td> Bir tekrarı Örnek </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Mikroakiskan dizisi kartını kullanarak miRNA U6 profil Sirkülasyon. İki Mikroakiskan dizi kartları (A ve B) kullanma. Örnek A U6 kontrol miRNA Cı-değerleri (toplam = 8). Koşular arasında gözlenen Tutarlı U6 kontrolü miRNA bolluğu.

Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K Görüntüleme.  The University of Sydney.  Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır. 

Video: Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Doku Mühendisliği Deneysel Yaklaşımlar

Biyoloji

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...