Tutti gli autori riconoscono il supporto infrastrutturale del NHMRC CTC, Università di Sydney, la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), l&#39;Australia e la Cooper Fondazione Rebecca, Australia. Questa ricerca è stata finanziata attraverso sovvenzioni dal Consiglio australiano Research (FT110100254) e la JDRF, Australia (CRN201314) per AAH WW, RJF e MVJ effettuato tutto bagnato laboratorio di sperimentazione, ASJ effettuata l&#39;analisi dei dati. WW ha scritto la prima bozza. AAH pianificato lo studio e analizzato i dati. Tutti gli autori hanno letto e hanno concordato la versione finale del manoscritto, figure e fogli di lavoro presentati per la pubblicazione.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

Articolo costi di trasformazione / pubblicazione sono stati coperti da Life Technologies, dopo l&#39;accettazione di questo manoscritto per la pubblicazione.

Le fasi critiche all&#39;interno dei protocolli qPCR sonda-based per ottenere risultati accurati e riproducibili sono per assicurarsi che 1) lo stesso volume e la concentrazione di RT-prodotto viene caricato in ogni reazione qPCR, 2) i rapporti ei volumi corretti dei componenti necessari per reazione qPCR sono preparati e ben mescolato, 3) i volumi corretti e coerenti vengono aggiunti ogni reazione qPCR, e 4) la preparazione e caricamento di ogni campione e reazione mix è completato nel più breve lasso di tempo possibile, mentre ancora memore di i punti critici di cui sopra in precedenza. Le schede matrice microfluidica bisogno adatto centrifuga e secchi specifici. Ogni secchio può contenere fino a 3 schede (caricato / vuoto). Verificare sempre che tutti e 3 gli slot di un secchio sono occupati e il secchio è bilanciato mettendo bucket simile (questo secchio dovrebbe contenere anche 3 carte, vuote o piene) nella fessura opposta della centrifuga. Pur ponendo la scheda nel buckeSupporto t, accertarsi che le 8 serbatoi proiettano verso l&#39;alto e pozzetti di reazione di fronte la parete esterna di centrifuga. Spin carte a 331 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Dopo il primo giro, aprire la centrifuga e verificare visivamente la miscela di reazione è stato erogato attraverso i 384 pozzi. Ripetere il lancio a stesse impostazioni per 1 più tempo. Rimuovere la carta dal secchio e garantire che il livello della miscela di reazione in ciascuna delle 8 serbatoi è uniforme. Eventuali incoerenze nei volumi di liquido lasciato nei serbatoi rendono la scheda inappropriato utilizzare ulteriormente. Per avere la stessa concentrazione del RT-prodotto, stessa concentrazione di ingresso di RNA viene aggiunto in ciascuna reazione RT. La concentrazione di RNA totale viene misurata usando un micro-volumespectrophotometer. Il 260/280 rapporto osservato può essere a partire da 1.3 per l&#39;RNA isolato da plasma / siero; questo non sembra avere un effetto sul downstream processo qPCR correlati o dati generati 30. Analogamente, il rapporto di 260/280i campioni di RNA qui testati sono stati tra 1,3-1,7 senza effetti anomali nel qPCR osservati. Quando si utilizzano campioni a basso contenuto di RNA, come quelli di biofluidi, può essere difficile quantificare RNA prima dell&#39;elaborazione. Si consiglia l&#39;uso del sintetico spike-in presso l&#39;isolamento di RNA e le fasi di trascrizione inversa. Nella nostra esperienza, i candidati Arabidopsis thaliana miRNA (ATH-miR-159A e ath-miR-172 bis) è preferito su Caenorhabditis elegans miRNA (come CEL-miR-39 o cel-miR-54), che nella nostra esperienza può avere maggiore omologia di quelli A. thaliana. L&#39;uso di tale picco-in specifici per fase può spiegare la normalizzazione dei dati miRNA su più campioni analizzati in tempi diversi. Utilizzando un volume d&#39;ingresso fisso di RNA per reazione di sintesi cDNA è anche raccomandato 32,33. I tre protocolli sonda-based per miRNA quantificazione descritte richiedono quantità variabilidell&#39;ingresso RNA totale, diversi flussi di lavoro e costi. Ciascuno dei flussi di lavoro sono progettati per soddisfare diverse throughput in base al numero di bersagli miRNA e il numero di campioni da analizzare. Con l&#39;aumento della velocità (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), il costo per reazione diminuisce con un aumento della quantità di dati ottenuti in una unità di tempo. Poiché tutte queste piattaforme TaqMan utilizzano la chimica, la qualità dei dati ottenuti si può aspettare che sia simile. TaqMan qPCR è un metodo consolidato per identificare l&#39;abbondanza di miRNA in campioni di siero / plasma 9,11,27. Anche se i tre piattaforme discussi qui condividono la stessa chimica, una diminuzione del volume di reazione porta ad una diminuzione della gamma dinamica di rilevamento trascrizione (Farr RJ et al., Dati non pubblicati). La piattaforma qPCR 96-bene è un rendimento più basso, ma la piattaforma alta sensibilità e, a nostro avviso, il &quot;gold standard&quot; per tutti i probe-based (o la tintura a base) piattaforme PCR. Tuttavia, questo puònon essere la piattaforma più economico o efficiente se diverse centinaia o migliaia di campioni vengono analizzati e per più microRNA. Microfluidics (TLDA) e nanofluidica piattaforme (OA) sono piattaforme high-throughput / contenuti progettate per consentire l&#39;acquisizione di dati più grandi in un tempo più breve. Anche se le differenze lotti sono state osservate nelle carte TLDA, questo può essere minimizzato richiedendo carte TLDA dallo stesso lotto. Osserviamo che la piattaforma TLDA (Figura 3) ha mostrato variazioni significative nel 17% dei media - miRNA bassa abbondanza durante il test con lo stesso campione in diversi lotti di carte TLDA. Si consiglia pertanto di utilizzare gli stessi numeri di lotto per l&#39;analisi utilizzando carte TLDA. Questa variazione potrebbe anche essere dovuto alla variabilità tecnica, comprese eventuali potenziali errori di caricamento e di pipettamento. Tuttavia, si consiglia di ordinazione / richiesta dello stesso lotto di carte TLDA. Nessuna variazione lotto significativo è stato osservato sulla piattaforma OA. Nonostante questo, TaqMan speri baseTal qPCR avvicina offerta facilità di misurare l&#39;abbondanza di miRNA in campioni di plasma / siero. Gli approcci di throughput a bassa, media e alta discussi qui offrono la flessibilità necessaria per analizzare una serie di campioni e miRNA con un (a basso rumore di fondo) chimica altamente efficiente, riproducibile e pulita.

I microRNA (miRNA) sono ~ 22 nucleotidi non codificanti (nc) RNA, funzionante come regolatori dell&#39;espressione genica 1-3. La maggior parte dei miRNA negli animali funzionano attraverso specifiche-sequenza di basi accoppiamento con un mRNA, targeting 3 &#39;UTR, che porta a regolazione negativa dell&#39;espressione genica 2-4. Questo di solito avviene attraverso l&#39;inibizione della traduzione mRNA o ribosomiale drop-off. miRNA in circolazione hanno dimostrato di essere nuovi biomarcatori nella ricerca e campo clinico per una varietà di malattie, come il diabete 5-7, ovaie 8, 9 prostata e della mammella 10,11, l&#39;epatite B 12 e di altre malattie autoimmuni 13. La ricerca è stata condotta per identificare miRNA abbondanti in cellule o tessuti differenti, così come in circolazione dal plasma umano e campioni di siero, che è più accessibile e meno invasivo 9,11-15. Diversi metodi di quantificazione miRNA sono stati estituito utilizzando più piattaforme, come ad esempio la piattaforma piastra standard 96 pozzetti 4,12,16-18, la piattaforma di carta microfluidica 12,18-23 e la piattaforma nanofluidica matrice 17,24. Quantitativa real-time PCR (qPCR) offre la possibilità di misurare i numeri relativi o assoluti di trascrizioni con multipla (di coloranti o sonda-based) chimiche. Base-Probe real-time PCR chimica offre il vantaggio di sfondo bassa fluorescenza e alta sensibilità per rilevare una singola copia trascrizione. E &#39;relativamente conveniente, semplice da usare e altamente riproducibile, che lo rende un metodo preferito per quantificare e determinare miRNA 25. Metodo qPCR base-Probe prevede generalmente due fasi: trascrizione inversa (RT) e qPCR 4,26,27. RT è dove il primer stem-loop RT è ibridato ad una molecola di miRNA maturo o primario e convertito complementare (c) del DNA. La quantificazione del prodotto cDNA viene quindi effettuata utilizzando miRNA-specifici primer PCR26-28. Il principio di base di sonda qPCR è basato sul rilevamento di estensione filamento complementare in tempo reale, che comporta l&#39;idrolisi della sonda fluorescente-tag. Queste sonde sono progettate per contenere un reporter fluorescente e un quencher che sono solo parte per consentire FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Rilevamento delle emissioni dal giornalista di fluorescenza (emettitore) è mascherato dalla vicinanza della molecola quencher. Quando Taq polimerasi (pol) si estende dal primer monte e raggiunge una forcella (estremità 5 &#39;della sonda), la Taq attività esonucleasi pol idrolizza la sonda, portando ad una fisica di dissociazione / separazione dell&#39;emettitore fluorescente dal quencher. Questa versione di una singola molecola di fluorescenza emettitore è registrato dal rivelatore e presentato come un aumento incrementale nel segnale di fluorescenza da tale bene / reazione. L&#39;aumento della fluorescenza è proporzionale alla quantità di prodotto di PCR generato, permettendo una accurata quantification del 26,28 bersaglio amplificato. Con l&#39;aumento della domanda in miRNA quantificazione, medio tecnologie high-throughput sono stati sviluppati per consentire a un maggior numero di campioni da elaborare in un breve lasso di tempo. TaqMan Low Density Array (TLDA) è un mezzo throughput microfluidica disegno innovativo basato su sonda basata qPCR chimica offrendo un aumento del numero di miRNA analizzati su una piastra. TLDA comporta l&#39;uso di una piscina predefinito di RT-primers utilizzati per sintetizzare il cDNA. Questi cDNA vengono poi filata in una misura 384 carta e micro-fluidico per determinare l&#39;espressione di più miRNA utilizzando qPCR 22,26,29. Ogni pozzetto della card contiene asciugato primer e sonde per amplificare specifici miRNA (s), quindi fino a 384 reazioni possono essere trasformati in carta singola TLDA 26. L&#39;array nanofluidics è una piattaforma ad alta produttività che viene utilizzato per il rilevamento di trascritti genici <sup&gt; 24 utilizzando la stessa chimica probe-based. Si utilizza una matrice proprietaria offre interazioni idrofobiche-idrofilo per facilitare il caricamento della miscela di reazione 33 nanolitri in una matrice di 3072 fori passanti su uno scivolo 24 in acciaio inossidabile. Questo articolo si concentra su che dimostra come vengono eseguiti questi metodi per quantificare miRNA nel siero / plasma ed i fattori critici che devono essere considerati quando si esegue e interpretare tali dati. Preso di conto, i loro benefici individuali e limitazioni saranno discussi in questo articolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

Base-Probe PCR quantitativa (qPCR) è un metodo preferito per misurare trascrizione abbondanza, poiché è uno dei metodi di rilevamento più sensibili che fornisce un&#39;analisi accurata e riproducibile. Chimica a base-Probe offre lo sfondo minimo di fluorescenza rispetto ad altri (di tipo dye) chimiche. Attualmente, ci sono diverse piattaforme disponibili che la chimica a base di probe uso per quantificare trascrizione abbondanza. qPCR in una piastra ben 96 è il metodo più utilizzato di routine, ma solo un massimo di 96 campioni o miRNA può essere testato in un unico passaggio. Questo richiede tempo e noioso se un gran numero di campioni / miRNA sono da analizzare. High-throughput piattaforme sonda-based come microfluidica (es TaqMan carte Array) e gli array nanofluidica (es OpenArray) offrono facilità per rilevare riproducibile ed efficiente l&#39;abbondanza di più microRNA in un gran numero di campioni in breve tempo. Qui, dimostriamo il setup sperimentalend protocollo per miRNA quantificazione da siero o campioni di plasma EDTA, utilizzando la chimica probe-based e tre piattaforme differenti (96 pozzetti, microfluidica e array nanofluidica) offrono livelli crescenti di throughput.

Il volume consigliato per un saggio basato sonda miRNA reazione qPCR è di 20 ml. NOTA: Abbiamo confermato che un volume di reazione di 5 microlitri può produrre risultati simili a quelli ottenuti usando 20 ml di volume 4,7,30. Abbassando il volume di reazione di 5 microlitri consente una diminuzione del 75% dei costi dei reagenti senza perdita apprezzabile sensibilità. Come illustrato nella figura 2, volumi di reazione di 20 microlitri e 5 microlitri mostrano una forte co-relazione entro 39 cicli (con r 2 di 0,92, p = 0,0002). Matrice Microfluidics fornisce uno strumento per ottenere dati su 754 miRNA espressi in un campione di circa 5 ore (per la scheda A e Scheda B), che è un modo più efficiente di analizzare più campioni rispetto ai tradizionali 96 PCR pozzetti. Abbiamo confrontato miRNA carte di array microfluidica per lo stesso campione (campione A e campione A ripetizione) Figura 3A -. B mostra un grafico Bland-Altman (&lt;strong&gt; 3A) e Correlazione plot (3B) per tutti i 754 miRNA testati per questi campioni. Ci sono 3 differenti miRNA controllo (U6, RNU44 e RNU48) disposte casualmente su entrambe le schede (scheda A e B) in più posizioni. Quando i valori di soglia ciclo U6 (R) sono confrontati tra le 2 piste, non abbiamo osservato differenze significative tra i valori (Tabella 4). E &#39;anche importante notare qui che U6 è espresso in maggiore abbondanza (valore Ct inferiore) nel campione valutato. Abbiamo quindi confrontato tutti i miRNA che hanno valori Ct tra 0-19,99 in entrambe le corse (n = 150), che avevano simile espressione dei miRNA nel complesso con un coefficiente di determinazione del 98% (Figura 3C-D). Di tutti i 277 miRNA che hanno valori Ct tra 20 e 29.99 in entrambe le corse, 16 miR differivano significativamente tra l&#39;originale e la ripetizione piste (Figura 3E - F) Il numero di miRNA con differenza significativa betwee.n le corse sono aumentate (89 su 327) in cui sono stati selezionati i valori Ct tra 30-40 per entrambe le corse (Figura 3G - H). La piattaforma nanofluidics matrice fornisce dati per 754 miRNA da ciascun campione di siero / plasma testati, come rappresentato nella Figura 4A È importante esaminare queste curve di amplificazione -. Come è con tutto qPCR - garantire che il risultato è indicativo della vera amplificazione. Ognuna delle 48 sottoarray (figura 1), contiene anche un saggio per i tre più popolari &quot;pulizia&quot; ncRNAs:. U6, RNU44 e RNU48 figura 4B mostra un raggruppamento tipico di U6 replica da un unico campione. Queste repliche mostrano bassa deviazione standard (SD &lt;0,5) e quindi sono un indicatore di affidabilità. In alternativa, la figura 4C mostra la maggiore variabilità dei replicati U6 (SD&gt; 0,5) in un secondo campione. Questo non nega la validità of rimanenti saggi, sebbene non richiedere una critica più approfondita. U6, come con la maggior parte dei miRNA &quot;pulizia&quot; nei fluidi biologici, può avere una espressione variabile. Va notato che uno dei campioni, illustrate nella Figura 4C, visualizza 4 volte minore contenuto U6 quello illustrato nella figura 4B. Poiché il livello di U6 in campione presentato in 4C è del 75% inferiore a cominciare da quello presentato nel 4B pannello, maggiore variabilità tecnica è previsto a causa della distribuzione di Poisson di trascritti, aggravata dal piccolo volume di reazione 17. Un altro strumento utile è le immagini di controllo di qualità (QC), disponibili per l&#39;esportazione una volta che la corsa è stata completata. Una lista di questi utilizza la fluorescenza ROX, colorante passivo trovato nella miscela reagente qPCR, per confermare che ciascun foro passante è stato caricato correttamente (Figura 5). Un foro passante, o addirittura un en<html> pneumatici subarray, non può caricare a causa di volume del campione insufficiente, l&#39;evaporazione, bolle presenti nei pozzetti della piastra del campione 384-bene, la mancata rimuovere completamente il sigillo piatto del campione, o difetti nel sistema Accufill o dei suoi suggerimenti. Qualsiasi scaricati fori passanti devono essere identificati per evitare miRNA etichettatura come &quot;non rilevabile&quot;, quando in realtà il test è stato mai caricato. Se si verifica questo problema, verificare che almeno 5 ml di campione / mastermix viene caricato in ciascun pozzetto della piastra campione di 384 pozzetti, piatto del campione sia correttamente centrifugato prima del caricamento, il sigillo di alluminio è completamente rimosso, e il OpenArray caricata scivolo è sigillata ed eseguire entro il tempo previsto per tutte le esecuzioni successive. Se i problemi di carico persistono, questi possono essere più probabile di pertinenza di gruppo specifico o sacco di array o di consumo correlati e in seguito si debba sollecitare assistenza attraverso il produttore. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Layout di campioni per il flusso di lavoro Array Nanofluidics: (A) Ogni piatto del campione da 384 e può contenere i campioni per un massimo di 8 matrici nanofluidica. (B) diluito, pre-amplificato cDNA viene inserito in 8 pozzi (2 colonne di 4 righe), con Pool A e Pool B in gruppi da 8 e adiacenti. Ogni cerchio rappresenta un pozzetto. (C) Ciascun pozzetto della piastra campione verrà caricato in uno sottomatrice dell&#39;array nanofluidics. Ogni piccolo quadrato rappresenta una subarray. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi Co-relazione per convenzionali 96 pozzetti piattaforme PCR: Co-relazione tra 20 ml e 5 volumi di reazione microlitri di TaqMan Real-time qPCR utilizzando una piattaforma standard 96 pozzetti in valori CT (39 cicli). Abbiamo confrontato 4 microRNA differenti (miR-375, miR-30c, miR-30d e miR-7) in 4 diversi campioni di siero e plasma umano. Solo 11 punti dati vengono tracciati dal momento che le altre erano rilevabili. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figura 3: circolazione miRNA profiling utilizzando carte di microfluidica array utilizzando 2 schede microfluidica (carta-A e carta-B), viene generato un profilo di 754 miRNA (A - B). Come mostrato qui, abbiamo usato lo stesso campione per 2 array di microfluidica corre per verificare la riproducibilità dei risultati delle carte microfluidica. Abbiamo osservato una simile espressione dei miRNA nel complesso, con valori Ct tra 0-19,99 (C - D). Ci sono pochi miRNA (16 su 277), con valori Ct tra 20-29,99 e significative differenze tra piste di ripetizione (E - F). L&#39;ottanta nove di 327microRNA con valori Ct più alti (30-40) hanno mostrato differenze significative tra le due piste (G - H). &#160; I dati vengono analizzati utilizzando il test T abbinato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figura 4: Profilo Rappresentante di curve PCR prodotto di amplificazione: è una figura rappresentativa delle curve (A) di amplificazione combinati di tutti i bersagli miRNA per un campione di plasma umano. Un test per U6 (a comune controllo ncRNA) è posto in ogni subarray. Il campione in (B) dimostra bassa variabilità (SD &lt;0,5), mentre (C) mostra alta deviazione standard (SD&gt; 0.5) entro U6 replica. Entrambi i campioni sono total RNA isolato dal plasma umano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figura 5: Analisi QC di nanofluidica Array: controllo della qualità (QC) immagini di un nanofluidica matrice caricato correttamente (a sinistra) e un nanofluidica matrice erroneamente caricata (a destra). Il colorante passiva, ROX (presente nella miscela reagente qPCR), fluorescenza per indicare un corretto caricata foro passante. La matrice di destra ha diverse sottoarray / fori passanti che non sono caricati con la miscela dei reagenti qPCR e questi dovrebbero essere identificati come reazioni falsi negativi PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per 5 reazione microlitri (ml) </td></tr&gt; <tr><td> Tampone RT (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTP (100 mm) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNase inibitore </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Trascrittasi inversa </td><td> 0,33 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabella 1A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per TaqMan tempo reale qPCR utilizzando una piattaforma standard piastra a 96 pozzetti. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per 5 reazione microlitri (ml) </td><td> Volume per 20 microlitri di reazione (ml) </td></tr><tr><td> Veloce Mastermix PCR (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR assay (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Senza Nucleaseacqua </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Volume totale: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * Componente saggio basato sulla miRNA selezionato testato. Tabella 1B: qPCR componenti della miscela di reagente in un 5 o 20 microlitri qPCR preparazione di reazione per TaqMan tempo reale qPCR utilizzando una piattaforma standard piastra a 96 pozzetti. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTP con dTTP (100 mm) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> MultiScribe trascrittasi inversa (50 U / ml) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ml) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 2A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per pannello TLDA miRNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex preamplificatore Primer (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 2B: preamplificatore componenti della miscela di reagente in un preparato reazione 25 microlitri di pre-amplificazione per il pannello TLDA miRNA. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTP con dTTP (100 mm) </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> MultiScribe trascrittasi inversa (50 U / ml) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20 U / ml) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 3A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per pannello nanofluidica miRNA probe-based. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex preamplificatore Primer (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 3B:. Preamplificatore componenti della miscela di reagente in un preparato reazione 25 microlitri di pre-amplificazione per il pannello nanofluidica miRNA sonda-base NOTA: Il supplementare interattivo fogli di calcolo Excel previste per le tre piattaforme, rappresenta già l&#39;aggiunta del 5% per compensare pipettaggio errore. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Campione A </td><td> Campione A ripetizione </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: circolazione miRNA U6 profiling utilizzando microfluidica carta array. Utilizzando due carte di matrice microfluidica (A e B). Ct-valori di miRNA controllo U6 da Campione A (totale = 8). Controllo U6 coerente miRNA abbondanza osservata tra le piste.

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Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l&#39;abbondanza dei microRNA circolanti.

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JoVE Journal

Biology

32.9K Views.  The University of Sydney.  MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti. 