Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü: açıklanan proje Ödülü sayısı R01MH079751 (F. Peruzzi PI) tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Aşağıdaki protokol hazır PCR plakaları kullanılarak BOS ve profil mikroRNA&#39;lar RNA izole etmek için standart prosedür açıklanmaktadır. Organik faz özütleme isteğe bağlıdır, ve bir taşıyıcı RNA RNA maksimum iyileşme sağlanması çıkarma esnasında numuneye eklenir ki unutmayın. Sonuç olarak, RNA ölçmek için herhangi bir gerek yoktur. CDNA (yaklaşık 2 saat) bir gün önce sentez edilir, genel olarak, 6-8 plakaları arasında bir ortalama bir gün içinde çalıştırılabilir. Tüm örnekler profilli ve yazılım yüklenmiş olduğunda verilerin analizi gerçekleştirilir. Karşılaştırma için örnek / grupları veya bunların kombinasyonu sayısına bağlı olarak, veri analizi, bir ila birkaç saat gerekebilir. 1.. RNA Ekstraksiyon RNA ekstraksiyonu, CSF örneklerinden yapıldı depolanmış analiz edilinceye kadar alikotları -80 ° C&#39;de donduruldu. Bu işlem için Mirvana Paris izolasyon kiti, üreticinin aletler ile, ardından, kullanılmışToplam RNA izolasyonu için seksiyonlar. Küçük RNA türlerinin zenginleştirme bu kit ile mümkün olmasına rağmen, bu adım yapılmaz ve RNA ekstraksiyon prosedürü toplam RNA izolasyonu aşamasından sonra sona erer, unutmayın. (Piyasada mevcut diğer RNA izolasyon kitleri gibi) Mirvana Paris izolasyon kiti organik çıkarma gerektirmez rağmen ek olarak, bu işlem için bir protokol aşağıda bulabilirsiniz. RNA ekstre edilmesi için protokol, iki adımdan oluşur: 1.1. Organik Ekstraksiyon (Mirvana Paris RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak eğer gerekli değildir) 1.2.2. Total RNA izolasyonu 1.1. Organik ekstraksiyon 1.1.1. Reaktifler hazırlayın <ol><li> Denatüre edici bir çözüm 2x 2-merkaptoetanol ve 375 ul, ve 4 ° C&#39;de saklayın </li></ol> 1.1.2. CSF hazırlayın <ol><li> RNA ekstraksiyon önce buz üzerinde CSF her kısım Çözülme. Yavaşça 0.5 çözülmüş CSF ml ve MS2 RNA taşıyıcının 1 ug eklemekarıştırın. Organik ekstre atlanırsa, MS2 taşıyıcı, aşağıda 1.2.2.1 &#39;de tarif edilen örnek önce RNA izolasyonu eklenecektir unutmayın. </li><li> CSF, oda sıcaklığında 2 x denatüre çözeltiden 0.5 ml karıştırın. </li><li> CSF artı 2x denatüre Çözüm kloroform: asit-fenol 1 ml ekleyin kloroform, değil karışımın üstüne yatıyor sulu tampon: asit-fenol içeren alt fazı çekilmiş emin olun. Kloroform Bu reaktif ile çalışırken bir zehir ve bir tahriş edici, kullanımı eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipman fenol içerir: Ayrıca, asit-fenol unutmayın. </li><li> 30-60 sn karıştırmak için Vortex. Kolaylık sağlamak için, numunenin 2 ml / çözelti / asit-fenol, denatüre edici: kloroform karışımı iki 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine ayrılır. </li><li> Oda sıcaklığında maksimum hızda 5 dakika (10,000 xg) için santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle alt faz veya interfazda bozmadan sulu (üst) fazının ayrılması ve bir transfertaze tüp. Iyileşti hacmi unutmayın. </li></ol> 1.2. RNA izolasyonu Bu özel bir pipet seti tezgah, ve RNA örnekleri ele için rafları olması tavsiye edilir. Çalışma alanı ve araçları RNaz Zap sprey kullanılarak dekontamine ve önceden her bir deney mendil vardır. 1.2.1. Reaktifler hazırlayın: <ol><li> MiRNA Yıkama Çözeltisi 1,% 100 etanol içinde 21 ml ilave edilir ve yıkama çözeltisi 2/3 40 ml% 100&#39;lük etanol. MiRNA Yıkama Çözeltisi 1 potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir guanidiun tiyosiyanatını içerdiğini unutmayın. </li></ol> 1.2.2. Total RNA izolasyonu <ol><li> Organik ekstre gelen sulu faza oda sıcaklığında% 100 etanol içinde 1.25 hacim ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Toplama Tüpler birine bir Filtre Kartuşu yerleştirin. </li><li> Filtre Kartuş üzerine lizat / etanol karışımı Pipet fazla 700 ul. </li><li> En fazla 30 saniye boyunca santrifüjhızı. Aynı filtre arda uygulamalarda 700 ul aşan karışımı uygulayın. Her santrifüj sonra flow-through atın ve yıkama adımlar için Toplama Tüp kaydedin. </li><li> Maksimum hızda 15 saniye boyunca Filtre Kartuş ve santrifüj 700 ul miRNA Yıkama Çözüm 1 uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin. </li><li> Maksimum hızda 15 saniye için 500 ul Yıkama Çözeltisi 2/3 ve santrifüj uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin. Maksimum hızda 15 saniye süreyle ikinci bir 500 ul Yıkama Çözeltisi 2/3 ve santrifüj uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin. Filtreden kalan sıvıyı almak için maksimum hızda 1 dakika için montaj dönerler. </li><li> Taze Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu aktarın. Uygula 100 &amp; pl, Filtrenin merkezine önceden ısıtılmış (95 ° C) nükleaz içermeyen su içinde çözünmüş ve kapağı kapatın. RNA kurtarmak için maksimum hızda 30 saniye boyunca santrifüjleyin. </li><li> Seyrelti içeren RNA toplamak ve daha sonraki uygulama için -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> NanoDrop 2000C spektrofotometre kullanılarak RNA&#39;nın 1 ul ölçmek. Bir RNA taşıyıcı RNA ekstraksiyonu esnasında numuneye eklenir ise RNA miktar atlanabilir unutmayın. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bu durumda, RNA, 8 ul cDNA sentezine tabi tutulur. </li></ol> 2. miRNA bilgileri: Mah-PCR Protokolü MiRNA profilleme için protokol iki adımdan oluşur: <ol><li> Birinci-şerit cDNA sentezi </li><li> Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu </li></ol> 2.1. Birinci-şerit cDNA sentezi 2.1.1. Şablonu RNA sulandırmak <ol><li> 5 ng / nükleaz serbest su kullanılarak ul bir konsantrasyona kadar şablon RNA numunelerinin her ayarlayın. EğerRNA (adım 1.2.2.9 bakınız) miktarı değil, daha sonra RNA 8 ul cDNA sentezi için kullanılmaktadır </li></ol> 2.1.2. Reaktifler hazırlayın <ol><li> Yavaşça 5x Reaksiyon tampon çözülme ve serbest su nükleaz ve hemen buz üzerine yerleştirin. </li><li> Vorteks ile karıştırın. Süspanse RNA başak-tüpe 40 ul nükleaz ücretsiz su ekleyerek ve vorteks karışım göre; 15-20 dakika buz üzerinde bırakın. Kullanımdan hemen önce, dondurucu enzim karışımı kaldırmak tüpleri hafifçe vurarak karıştırın ve buz üzerine yerleştirin. Tüm reaktifler aşağı spin. </li></ol> 2.1.3. Ters transkripsiyon reaksiyonu setup <ol><li> Bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne veya eşdeğer bir RT çalışma çözeltisinin gerekli miktarda hazırlayın (oranlarda RNA şablonu haricinde, Tablo 1 &#39;de gösterilen), (maksimum hızda 1-2 saniye) vorteks karışım, kısa bir süre için (aşağı spin biz sabit hızda 10 sn) ile mini bir Eppendorf santrifüj kullanmak ve buz üzerine yerleştirin. Not UniSp6 RNA başak-(Tablo 1 e bakınız) olarak bir RT reaksiyonu önce numuneye eklenir. </li><li> Nükleaz ücretsiz PCR tüpleri içine RT çalışma çözüm dağıtmak. </li><li> Her bir tüp içinde template RNA dağıtın. Not:% 10 fazla hacmi / pipetle ve / veya robotik ölü hacim için her ayıraç hesaplamak için hatırlıyorum. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Panel I Hacim (ul) </td><td> Panel I + II Hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5x reaksiyon tamponu </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> Enzim karışımı </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA Spike-in şablonunda </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Şablon total RNA (5 ng / ml) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Toplam Hacim </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Transkripsiyon reaksiyonu kurulum Ters. </li></ol> 2.1.4. Mix ve reaktifler dönmeye <ol><li> Reaktif maddeler iyice karışmasını sağlamak için yumuşak (1-2 saniye) vorteks ile reaksiyonu karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, (sabit hızda 10 sn mini Eppendorf santrifüj) aşağı doğru döndürün. </li></ol> 2.1.5. Inkübe ve ısı etkisizleştirilmiş <ol><li> Aşağıdaki gibi bir PCR Makinenizi programlamak: </li><li> 42 ° C&#39;de 60 dakika boyunca inkübe </li><li> 95 ° C&#39;de 5 dakika boyunca ters transkripsiyon Isı inaktive </li><li> 4 ° C&#39;ye hemen soğuk </li><li> 4 ° C veya dondurma depolayın Not: protokol bu aşamada kesilebilir. Seyreltilmemiş cDNA kadar 5 hafta (en fazla 4 gün süreyle 4 ° C&#39;de isteğe bağlı mağaza) boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu 2.2.1. Gerçek-zamanlı PCR için reaktifler hazırlamak <ol><li> Buz üzerine (aşama 2.1.5 &#39;dan itibaren) cDNA yerleştirin. </li><li> Buz Çözülme nükleaz ücretsiz su ve PCR Master mix. Alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan PCR Master mix şişeleri koruyun. Kullanımdan hemen önce, mini santrifüj 1-2 sn vorteks PCR Master mix mix ve 1 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li></ol> 2.2.2. SYBR Green ana karışımı, su ve cDNA birleştirin ve PCR plakaları ekle Aşağıdaki yordam tüp yüzeye yapışmasını cDNA düşük konsantrasyonlarını önlemek için tavsiye edilir: <ol><li> Plaka mühür çıkarmadan önce, kısaca 1 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de soğutmalı santrifüj içinde plaka (lar) aşağı doğru döndürün. </li><li> 15 ml konik tüp, 2x PCR Master mix ve su birleştirir. Panel I: 2.000 ul 2x master miks ve 1980 ul su; Panel I + II: 4.000 ul 2x master miks ve 3.960 μ, L su. </li><li> 20 ul cDNA (panel I) ya da 40 ul cDNA (I + II panel) ekleyin ve karıştırın. </li><li> 1-2 saniye karıştırın hafifçe karıştırın ve 1 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de soğutmalı santrifüj içinde aşağı doğru döndürün. </li><li> Bir çok kanallı pipet haznesinde PCR Master mix / cDNA karışımı yerleştirin. Bu çok kanallı pipet uzunluğuna sahip olan bir rezervuar tespit etmek gerekebilir. Bu çok kanallı boyunca eşit hacim kesri izin yeterince yüksek hacimli düzeyde tutar. Bu son birkaç alikots eleştirmekte. </li><li> 10 ul PCR Master karışım dağıtın / cDNA 16 kanallı bir pipet kullanarak 384 oyuklu plakanın her oyuğuna karıştırın. </li><li> Optik conta ile plaka mühür. </li><li> Çözüm karıştırın ve hava kabarcıklarını çıkarmak için, soğutmalı santrifüj (1 dakika için 1.500 xg) kısaca plaka Spin. Not: deney bu noktada durdurulmuş olabilir. Kadar, 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş reaksiyonları saklayın. </li></ol> 2.2.3. Real-Time PCR Tablo 2 &#39;de ayrıntılı olarak aşağıdaki parametreler, gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve erime eğrisi analizi yapın. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Süreci Adım </td><td> Ayarlar, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polimeraz Aktivasyon / doğallık </td><td> 95 ° C, 10 dakika </td></tr><tr><td> Amplifikasyon </td><td> 45 Amplifikasyon döngüleri de 95 ° C, 10 saniye 60 ° C, 1 dakika Rampa-rate 1.6 ° C / sn Optik okuma </td></tr><tr><td> Erime eğrisi analizi </td><td> Evet </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Roche LightCycler 480 kullanarak gerçek-zamanlı PCR döngüsü koşulları. 2.3. Gerçek zamanlı PCR veri analizi Gerçek zamanlı PCR veri analizi, Exiqon genex Professional 5.0 ile yapılır aşağıdaki to talimatları tavsiye edilir. Genex adım adım kılavuzunu indirebilirsiniz <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> Veri analizi üç aşamadan oluşmaktadır: <ol><li> Veri ithalat </li><li> Veri Ön işleme </li><li> İstatistiksel analiz </li></ol> 2.3.1. Veri ithalat <ol><li> Roche LightCycler 480 yılında 2. türev analiz yöntemini seçin ve samid değerlerini hesaplamak. Veri bir tablo olarak ihraç ve metin dosyaları olarak kaydedilir. </li><li> Verileri, açık genex ithalat ve Exiqon ithalat sihirbazı butonuna tıklayın ve &quot;Başlat&quot; tıklayın. Biçimi, alet ve plaka düzeni dosya (lar) seçmek için yönergeleri izleyin. O tabak düzeni dosyaları (excel dosyaları) Exiqon web sitesinden (indirilen Not <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Import Panelleri I ve II ve &quot;İleri&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> Dosyası ithalat sonrasında oluşturulan tablo önceden tanımlanmış sütun içerir. Örnekler isimleri düzenlenebilir ve sınıflandırma sütun eklenir veya bu aşamada çıkarılabilir. Bitirdiniz &quot;İleri&quot; yi tıklayın. </li><li> Verilerinizi kaydedin ve Veri Editör yükleyin. </li></ol> 2.3.2. Veri Ön işleme <ol><li> Exiqon ve Genex tarafından önerildiği gibi, birden fazla tabak karşılaştırırken, yapılacak ilk şey, ön işleme menüsünden arası plaka kalibrasyon seçerek plakalar arasında veri kalibre etmektir. </li><li> Bu üçlü çalışır miRNA dizileri çalıştırmak için tavsiye edilir. Bir miRNA üç kopyaları üzerinden en az ikisini içinde mevcut değilse o nonexpressed olarak kurulacaktır. </li><li> Ön işlem bir sonraki adımda, bir kesim yola. Bir kesme değeri olarak tanımlama bir eşik döngüsü (C t) bu değerden daha yüksek olan veri atılır olduğunu gösterir. Beyin omurilik sıvısı örneği kullanılarak, bu deneylerde, kesme kapalı 39 olarak belirlenmiştir. Oradaefore, üç kopyaları içinde 39 daha C ton daha yüksek olan tüm örnekler atılır. Bir miRNA bir prob (üç kişiden birinin kopya) için&gt; 39 C t varsa, bu okuma, diğer iki sondaları C t ortalama ile değiştirilir onlar 39 ikisi de aşağıda sağlanacaktır. </li><li> Referans genleri tanımlamak. Genex Profesyonel referans genleri tanımlamak için geNorm ve / veya NormFinder kullanmak için seçeneği vardır. Tüm örneklem genelinde benzer samid değerlere sahip ve geNorm ve / veya NormFinder çalıştırmak miRNA&#39;ların bir liste seçin. Bu analize göre, burada verilen örnekte, miR-622 ve miR-1266 örneklerin arasında en düzgün değerleri vardı (Şekil 1) referans genler olarak seçilmiştir. </li><li> Daha sonra, veriler, referans genler kullanılarak normalize edildi ve elde edilen değerler ΔC t uyuşmaları </li><li> CDNA sentez reaksiyonları üçlü olarak gerçekleştirildi, bu noktada değerler ortalaması alınmalıdır. </li><li> Yeniden sayfasını doğrulamakboş ve neredeyse boş sütunları taşımak. Ön işleme penceresinde seçin &quot;Ön Onaylayın&quot; ve Kaldır boş sütunlar hattında uygulamak daha. Aşağıdaki satırda, geçerli verilerin istenilen yüzdesini seçti ve uygulamak tıklayın. Tüm örneklerin ortak sadece miRNA&#39;lar karşılaştırmak istiyorsanız Örneğin,% 100 seçin. </li><li> Eksik veri işlemek. Ön işleme menüsünden &quot;Eksik veri&quot; seçin ve eksik verileri işlemek için seçeneklerden birini seçti. Bu adım gereklidir. Eğer işlenmeyen eksik veri içeren dosyaları yüklemeye çalışırsanız genex size hata verecektir unutmayın. </li><li> Örnekler (örneğin, kontrole karşı. Deneyi) grupları arasında nispi miktarını belirler. Gruplar arasında rölatif ölçümü ΔΔ C t yöntemi kullanılarak hesaplanır. Genex yılında, ön işleme sekmesini tıklatın ve nispi miktarını seçin. Penceresinde referans grubu seçin ve uygulayın vurdu. İfade, grafiksel gösterimleri ve / veya ileri istatistiksel analizler için unutmayınEssion verileri bir logaritmik ölçeğe dönüştürülmesi gerekir. Ön işleme menüsünde, Log2 seçin. </li></ol> 2.3.3. İstatistiksel Analiz Genex yazılım T-testi ve ANOVA gibi istatistiksel analizler, geniş bir yelpazede sağlar. <ol><li> Genex ve açık veri yöneticisi içine nihai mdf dosya yükleyin. Bu istatistiksel analiz yapılır hangi örneklerin doğru örnekleri veya grupları seçmek için önemlidir. </li><li> &quot;İstatistik&quot; seçeneğini seçin ve istenen teste karşılık simgesini seçti. </li><li> Kontrol paneli pencerede &quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Excel veya mdf dosyaları gibi sonuçları kaydedin. </li></ol> 2.3.4. İfade profilleme Aşağıdaki gibi MikroRNA&#39;lar ve numuneler, sınıflandırılmış kümelenmiş ve ısı haritaları ve dendogramlardaki görüntülendi olabilir <ol><li> Genex ve açık veri yöneticisi içine nihai mdf dosya yükleyin. Numune veya miRNA&#39;ların grupları seçmek ve oluşturmak için bu pencereyi kullanın. İşiniz bittiğinde &quot;Uygula&quot; yı tıklayın. </li> &lt;Sol üst köşesinde seçin kümede li&gt; ve heatmap simgesine tıklayın </li><li> Kontrol paneli pencerede &quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Heatmap TIFF veya bmp gibi çeşitli biçimlerde kaydedilebilir, aynı zamanda kopyalanan ve gerektiğinde değiştirilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

MicroRNA çeviri engellenmesi ve / veya mRNA bozulmasını 2 teşvik gen ekspresyonunu regüle küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar bulunmaktadır. Nedeniyle hücre içermeyen koşullarda yüksek kararlılık, microRNA birçok vücut sıvılarında tespit edilmiştir. Ayrıca, microRNA ayrı ekspresyon profili, insan kanserlerinin 3-9 çeşitli sahne ve / veya ilerlemesi ile ilişkili olmuştur. Klasik çip dizilimleri veya son derin sıralama teknolojisi dahil micr...

MikroRNA&#39;lar post-transkripsiyonel gen ifadesini düzenleyen noncoding RNA (uzunluğu nt 21-23) küçük ailesine aittir. microRNA nispeten kararlı olduğu görünen hücre dışı boşlukta salgılanabilir. MiRNA ifade değişiklikleri belirlemek miRNA profillerini performans ve veri büyük miktarda taşıma, biyolojik belirteçlerin belirlenmesi yönünde önemli bir adım olabilir iken korkutucu olabilir. Burada, bir hassas, gerçek zamanlı PCR ile (veya diğer vücut sıvıları için geçerlidir) beyin-omurilik sıvısında miRNA ifade değişiklikleri belirlemek için bir protokol açıklar. Ayrıca, istatistiksel analiz ve sonuçların grafik gösterimi de dahil olmak üzere, veri analizi için yazılım kullanımını tarif eder. Tüm prosedür nispeten kolay ve basittir ve, profil ve gerçek zamanlı PCR makinelerin sayısı mevcut değil, aynı zamanda nispeten hızlı edilecek numune sayısına bağlı olarak değişebilir. Deneysel bölüm işlemedeki doğruluk gerektirir384-iyi plaka içine RNA ve pipetleme, genex kullanarak veri analizi bölümünde bilişim ve istatistik bazı temel bilgi gerektirir iken.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;lar) onların dönüşümsel baskıyı modüle ederek, dolayısıyla, mRNA&#39;ların üzerinde bulunan siteleri hedef ve RISC yönlendirerek gen regülasyonu güçlü bir katman oluşturur. MiRNA ifadesindeki değişiklikler tüm önemli kompleks hastalıkların gelişimi dahil olmak üzere gösterilmiştir. Ayrıca, son bulgular miRNAs hücre dışı çevreye salgılanır ve yüksek stabiliteye sahip dolaşabilir kan ve diğer vücut sıvıları butonu edilebileceğini göstermiştir. Bu tür dolaşan miRNAs fonksiyonu büyük ölçüde zor olmaya devam etmektedir, ancak bu miRNA profil dizileri gibi sistematik bir yüksek veri akışı yaklaşımlar, nörodejeneratif hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere birçok çeşitli patolojik koşullarda, miRNA imzaların tanımlanmasına yol açmıştır. Bu bağlamda, beyin-omurilik sıvısında miRNA ifade profilinin tanımlanması, bizim son çalışmada rapor edildiği gibi, biyolojik analiz için miRNAs cazip adaylar yapar. _content &quot;&gt; gibi microarrays gibi microRNA, profilleme için çeşitli araçlar vardır, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), ve derin sıralama. Burada, kantitatif gerçek zamanlı PCR ile beyin omurilik sıvılarında microRNA profili için hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Exiqon mıkroRNA hazır kullanımlı PCR insan panelleri kullanılan I ve II sağlar V2.R, 742 eşsiz insan microRNA algılama. Biz üçlü çalıştırır diziler gerçekleştirilen ve biz genex Profesyonel 5 yazılımı kullanarak veri işleme ve analiz. Bu protokolü kullanarak, başarılı bir şekilde hücre hatları ve primer hücreler, CSF, plazma ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku türlerinde microRNA profilli var.

Bu çalışmanın sonuçları, daha önceden 1 yayımlanmıştır. GeNorm uygulamasını kullanarak aday referans microRNA analizi 1. sonuçlarını gösterir Şekil. Bu duruma göre, iki microRNA, miR-622 ve miR-1266, referans genler olarak tespit edilen ve miRNA değerlerini normalize etmek üzere kullanılmıştır. CSF çalışma için numuneler üç grup vardı: HIV-(n = 10), HIVE Ensefalit olmayan (n = 4) ve HIV + (HIV +, <...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR at JoVE.com

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Görüntüleme.  LSU Health Sciences Center.  Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir. 

Video: Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Tıp

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

Hareket Performans Gerçek zamanlı geri bildirim ile yeniden eğitimi

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

Yenidoğan Fare Akciğer Akciğer Akışkan Ciltler Gerçek zamanlı X-ışını görüntüleme

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...