Bu çalışma NIH hibe DE018304, R01DE018281 tarafından desteklenmiştir. KT T32 GM07092-34 ve Grad Girişimi, Akdeniz ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Chapel Hill&#39;deki North Carolina Üniversitesi bir hibe ile desteklenmektedir. PC T32 CA009156 tarafından desteklenmektedir.

QPCR ön miRNA profilleme dizileri Tecan Özgürlük Evo robot (A) ya da elle Matrix elektronik çok kanallı pipet (B) tam otomatik olarak ayarlanabilir. 1) master mix, astar plakaları ve örnekler hazırlayın. <ol><li> 12:05 96-iyi biçimi (2 plakalarının toplam) 186 primer çiftleri içeren Astar plakaları, -80 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir Oda sıcaklığında, girdap ve kullanılmadan önce santrifüj kısaca çözülme plakalar. </li><li> Ana karışımı hazırlamak için, SYBR Green 2x PCR Mix oda sıcaklığında çözünme. Her reaksiyon 2ul astar 8ul ana karışımı kullanır. Başına ana reaksiyon karışımı kompozisyon 4ul SYBR karışımı, 3ul PCR sınıf su ve 10-20 ng örnek DNA veya cDNA. </li><li> Her 96-sıra astar plaka kurulum için dört ana karışımı tüpler ihtiyaç duyulacaktır. Örnekleri plaka başına 4 örnekleri (singlicate), 2 plaka başına örnekleri (yinelenen) veya dört nüsha olarak tek bir örnek çalıştırılabilir. </li><li> 4-2ml Eppendorf tüpleri her SYBR, su ve örnek bir araya getirerek ana karışımı hazırlayın. Her tüp atık pipetleme fazla izin veren yaklaşık 100 reaksiyonlar için yeterli ana karışımı içermelidir. Karıştırmak için Vortex. </li></ol> Özgürlük Tecan Evo robot kullanarak ön miRNA tahlil A. Kur. <ol><li> Robot ve yükleme Evoware programının başlatılması ardından, doğruluğu pipetleme engel olacak hava kabarcıkları sistemi temizlemek için 30mls her üç kez yıkayın. </li><li> Robot platformu Kur şunlardır: <ul><li> 384-plaka Etiketli </li><li> 96-iyi astar plaka (1) </li><li> Ana karışımları </li><li> % 2 oranında çamaşır suyu içeren bir çukur </li><li> Doldurulmuş bir sistem sıvı konteyner </li><li> Boş atık kabını </li></ul></li><li> &quot;Çalıştır&quot; a iki kez seçerek otomatik robot çalışması başlayın. </li><li> Programın sonunda, LightCycler 480 sızdırmazlık folyo ile 384-plaka ve conta kaldırın ve kısa bir süre santrifüj. Place otel konumu 1 384-plaka imzalandı. </li><li> 2.2 adım ve yeni ana karışımları ve yeni bir 384-plaka ile astar plaka 2 için tekrar gidin. <ol><li> Otelin konumu 2 mühürlü plaka koyun. </li></ol></li><li> Otel LightCycler Yükleme ve iki kez &quot;Çalıştır&quot; ı seçin Open in new Evoware programı. <ol><li> Özgürlük Evo LightCycler içine otomatik olarak her plaka yük ve aşağıdaki SYBR-yeşil I / İKY bisiklet programı çalıştırın: Ön (1 döngüsü): 4.8 rampa oranı az 5 dakika boyunca 50 ° ° / sn 4.8 yükselme oranı az 5 dakika boyunca 95 ° ° / sn Amp (45 siklus): Yükselme oranı 4.8 ° 15 saniye 95 ° / sn 62 2.5 rampa hızı 30 sn ° ° / sn (Bu adım sırasında Tek veri toplama) Erime eğrisi: 4.8 rampa hızında 5 sn ° 95 ° / sn 2.5 rampa oranı az 1 dakika süreyle 60 ° ° / sn 95 ° rampa 0,11 oran ° / sn sürekli 5 ° C başına satın almalar Cool: 50, 30 saniye 25 rampa oranında ° ° / sn </li></ol></li></ol> B. Kur Matrix elektronik çok kanallı pipet kullanarak pre-miRNA tahlil: <ol><li> Yeri içeriğini bir rezervuar içine master karışımı tüp 1. </li><li> 2-8ul tasfiye adım adım takip dağıtmak ana karışımı 16ul aspire elektronik pipet ayarlayın. </li><li> Master miks 1 için de A1 ile başlayan 384 plaka (384-iyi ucu aralığı) diğer her kuyuya 8ul dağıtmak. (Yani kuyulardan A1, C1, E1, vb) ikinci 8ul sonra bir atık kabı ve imha ipuçları üzerinde sütun 3 (yani kuyulardan A3, C3, E3, vb.) Tasfiye hareket eder, dağıtır. </li><li> Iyi A23 ulaşana kadar kalan 5 devir için bu model izleyin. </li><li> Ana karışımı 3 (iyi, B1, D1, F1, vb başlangıç); master miks 4 (B2 başlangıcı, D2, F2, vb (iyi A2, C2, E2, vb) ile başlayan, ana mix 2 için tekrarlayın. .) </li><li> Astar plaka aliquotting için, elektronik pipet 2ul aspirat ve tasfiye adım aşağıdaki 2ul dağıtmak için ayarlayın. 96-iyi astar plaka (AH) sütun 1 astar 2ul bir atık kabı ve imha ipuçları plaka üzerinde 384-kuyu, kuyu A1, C1, E1, vb Temizle içine koyun. D2 ve B2, F2, vb; B1, D1, F1; kuyuları A2, C2, E2 için tekrarlayın </li><li> Tam 384 plaka aliquotted kadar her astar sütun için her 2 sütun üzerinde hareketli, satır 96-iyi primerler 2-12 için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> LightCycler sızdırmazlık folyo ve kısa süreli santrifüj Seal plakalar. </li><li> SYBR Green I / İKY algılama biçimini kullanarak aşağıdaki ayarlara göre LightCycler 480 ve plakaları döngüsü içine yerleştirin plakaları: Ön (1 döngüsü): 4.8 rampa oranı az 5 dakika boyunca 50 ° ° / sn 4.8 yükselme oranı az 5 dakika boyunca 95 ° ° / sn Amp (45 siklus): 15 saniye boyunca 95 ° yükselme oranı4.8 ° / sn 62 2.5 rampa hızı 30 sn ° ° / sn (Bu adım sırasında Tek veri toplama) Erime eğrisi: 4.8 rampa hızında 5 sn ° 95 ° / sn 2.5 rampa oranı az 1 dakika süreyle 60 ° ° / sn 95 ° rampa 0,11 oran ° / sn sürekli 5 ° C başına satın almalar Cool: 50, 30 saniye 25 rampa oranında ° ° / sn </li><li> Aliquotting, taze hazırlanmış ana karışımları kullanarak yeni bir 384-plaka içine astar plaka 2 kullanarak tekrarlayın. </li></ol> Başarının Sırları: PCR dizileri tasarımı önemli bir özelliği, her 186 primer çiftleri aynı tavlama sıcaklığı olması, aynı optimal PCR çalışması program ayarları plaka çalıştırılabilir. Her yeni bir dizi çalışan örnekleri öncesinde üç kontrollerini kullanarak kontrol edilmelidir. Bu kontroller şunlardır: 1 su veya 0,1 x TE astar kontaminasyonu ekarte etmek için çalışan tüm primerlerin çalıştırın. 1 hiçbir taşınmasını sağlamak için, su / TE ve pozitif kontrol alternatif çalışır. 3 çalışan arasında yeniden sağlamak için, aynı pozitif kontrol kullanarak çalışır. Ana karışımları taze hazırlanmış olmalıdır ve plakalar en iyi sonuçlar için 24 saat içinde çalıştırılması gerekir Primer plaka folyo kuyuları arasında kontaminasyon riskini azaltmak için yavaş yavaş çıkarılmalıdır. Sabit ipuçları ile bir robot kullanırken,% 2 oranında çamaşır suyu yıkama, su floş pipetleme her adım arasında ipuçları, yıkamak için gereklidir. Bu veriler aksi kontamine ve sonuçsuz sonuçlara yol açabilir taşınmasını önler ve ortadan kaldırır. LightCycler ile bir tabak çalıştırıldıktan sonra, PCR kurulum odasında tekrar açılacak olmamalıdır. Bu PCR kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur. Temsilcisi Sonuçlar: qPCR sonuçları genellikle LightCycler analiz yazılımı belirlenen CT değerleri ile temsil edilmektedir. Başarılı bir vadede, genellikle pozitif örnekler için örnekler için, genellikle 20-35 arasında trafolarından bir dizi oluşur. Iyi bir vadede su örneklerinin, her zaman bir CT&gt; 40 ve 37 üzerinde herhangi bir numune veya bir BT ile özel kuyular negatif veya tespit olarak kabul edilir. Genel bir kural olarak, bir BT &lt;10 verimli örnekleri de güvenilir değildir ve daha fazla analiz dışında tutulmuştur. Örnek giriş değişimi için kontrol etmede yardımcı olur tayininde qPCR veri ve iç kontrollerin dahil analiz etmek için çeşitli yollar vardır. Pre-mir dizi, farklı örnekleri CT değerleri normalleştirmek için bir referans gen olarak sık sık kullanılan bir U6 kontrol astar, içerir. Bu normalize değeri delta CT değeri (DCT) olarak adlandırılır. Sonuçlar genellikle ham CT, DCT değeri olarak görülebilir ya da daha fazla standardize edilmiş değerleri analiz edilebilir. Şekil 1, bir timecourse deney dört farklı örnekleri ön microRNA dizi analizi ısı haritası biçiminde sunulmaktadır. Her ön microRNA göreceli ifade gösterilen ve üç ana, farklı kümeler ortaya çıktı. Beklendiği gibi analiz öncesi MIRS çoğunluğu (Şekil 1A) küçük, önemsiz değişiklikler yapıldı. Ancak, ön microRNA küçük bir kısmını önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 1B) veya timecourse deney boyunca önemli ölçüde artmıştır (Şekil 1C). Her bir ön microRNA ifade düzeyleri bazal seviye olarak 0h timepoint (Örnek 1) normalize edildi. Bazı durumlarda, bazı kümelenmiş pre-microRNA da (let-7a, Şekil 1B eski) İlgi haritası analizi birlikte küme dikkat. Deney bağlı olarak, kümeler, viral enfeksiyon bağlı olduğunu ortaya çıkabilir, ortak bir molekül ya da sinyal yolağı tarafından düzenlenir-microRNA öncesi ya da önceden MIRS hücre türüne özgü bir ifade. Biz de geliştirdik microRNA öncesi tahlil, Kaposi sarkomu, insan ön-MIRS ek İlişkili Herpes (KSHV) ve Ebstein Barr Virus (EBV) tarafından kodlanan bilinen viral öncesi microRNA ve genler bir dizi içerir. Bunlar hücre hattı ve kullanılan örnekleri viral durumuna bağlı olarak, pozitif veya negatif kontrol olarak kullanılabilir. Şekil 2&#39;de, dört nüsha olarak işletilen bir KSHV negatif örnek ortalama akım trafosu gösterilmiştir. KSHV LANA önemlisi, çok hassas qPCR dizi bu örnek tespit değildi. Ancak, U6 - iç kontrol ve izin-7a - yüksek ifade insan öncesi microRNA saptanabilir düzeyde ifade edildi. Son olarak, beklendiği gibi, PCR-dereceli su negatif kontrol qPCR ürün verim vermedi. Başarılı bir qPCR çalışması bir diğer göstergesi de örnekleri potansiyel kirlenme içine iyi bir fikir verebilir erime eğrisi analizi. Erime sıcaklığı kurmak için PCR işlemi tamamlandıktan sonra, plaka yavaş ısıtılır. DNA ipliklerini ayrı olarak, SYBR yeşil yayımlanan ve floresan sinyal azalır. Sıcaklık bu drop grafikler halinde oluşur ve örnek erime sıcaklığı olarak bilinir. DNA dizisi olarak, örnekler, birbirinden DNA mevcut olduğundan bir ergime sıcaklığına sahip olmamalıdır su negatif kontrol farklı sıcaklıklarda erir. Her bir primer çifti PCR ürünleri, benzer sıcaklıklarda erir. Örneğin, Şekil 3 çift aynı örnek kullanarak iki farklı astarlar için yeni bir erime eğrisi analizi gösterir. Bu iki primer çifti için erime sıcaklığı farklı ama örnek her çoğaltmak için aynı sıcaklıkta eriyen açıktır. Veya potansiyel olarak kontamine kötü bir örnek belirtileri giriş iki farklı kaynaklardan varlığını düşündüren çeşitli erime doruklarına içerebilir. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Ön-microRNA imzalar roman qPCR tabanlı bir dizi kullanarak profil yoluyla ortaya çıkar. Ortalama deltaCTU6 hesaplanır ve standartlaştırılmış değerlere heatmaps olarak gösterilen 3 ayrı kümeler verimli ArrayMinerTM yazılımı yüklenir. (A) Ön microRNA ifade küçük değişiklikler ile gösterilmiştir. Seviyelerini önemli ölçüde azalmıştır Öncesi microRNA (B) veya (C) artış da gösterilmiştir. Kırmızı ifade seviyeleri temsil ederken Mavi ifade alt seviyelerine karşılık gelir. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 qPCR tabanlı bir ön microRNA dizideki iç kontrollerin dahil edilmesi . 3 farklı genler ve hiç bir şablon kontrolü için ham CT değerleri gösterilmiştir. U6 PCR H2O negatif kontrol olarak sunarken dahili bir pozitif kontrol olarak kullanılır. Let-7a-1-1 KSHV LANA kullanılan hücre hattı veya doku viral durumuna göre ya bir pozitif veya negatif kontrol olarak kullanılabilir normalde pek çok farklı hücre tipleri ifade microRNA. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3-microRNA öncesi astar ve örnek kontaminasyon eksikliği zirve analiz Erime. Erime eğrileri LightCycler yazılım Tm çağrı analizi kullanılarak elde edildi. Yinelenen çalıştırmak aynı örnek için iki farklı primerler (Primer A ve B) gösterilmektedir. Her astar için erime sıcaklığı farklıdır. Ancak, örnek, örnek kontaminasyon eksikliği gösteren, sadece bir tepe vardır.

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

QPCR çok hassas bir çalışma örnekleri arasında gen ekspresyon düzeylerini karşılaştırmak için kullanılabilir testinin yanı sıra virüs durumda pozitifliği belirlemek için. QPCR dizileri kullanmanın yararı zaman kısa bir süre içinde her bir örnek için birçok primerler (bizim durumumuzda, astar 186 çift) çalıştırma yeteneği. Tecan Özgürlük Evo kadar azaltılmış olabilir bir deney ayarlamak için gerekli süreyi, ve robot doğruluk ve tutarlılık gibi bir pipetleme robot kullanarak pipe...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), gen ekspresyon düzeyleri profil doğru ve değerli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Birçok avantajlarından biri, her bir deney için küçük miktarlarda girişi kullanırken gen ekspresyon profil diğer yöntemlere göre daha düşük bir algılama sınırı. Otomatik qPCR kurulum büyük tekrarlanabilirlik için izin vererek bu alanda geliştirdi. Her bir deney için aynı anda pek çok farklı genler profil sağlayan, kullanışlı ve hızlı kurulum, yüksek verimlilik deneyler için sağlar. Bu yöntem aynı zamanda iç plaka kontrolleri ile birlikte diğer tekniklerin ortak deneysel değişkenler azaltır. Biz son zamanlarda bir dizi 186 primer çiftleri kullanarak ön microRNA profil qPCR assay (ön miRNA&#39;ların) geliştirdi. MicroRNA yeteneği ile birçok mRNA transkripsiyon sonrası seviyede hedefler düzenlemek için küçük, non-coding RNA&#39;ların bir roman sınıf olarak ortaya çıkmıştır. Bu küçük RNA&#39;lar sonra habercisi miRNA (pre-miRNA) bölünmüş bir birincil miRNA (pri-miRNA) transkript, ilk olarak, RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu. Ön-miRNA&#39;lar Dicer olgun miRNA&#39;lar verim saç tokası döngü parçalayarak sitoplazma ihraç edilmektedir. MiRNA düzeylerde artışlar yararlı olabilir, hem de bu formları habercisi ve olgun miRNA düzeyleri ve profil hem görülebilir. Olgun miRNA&#39;lar için piyasada bulunan birçok deneyleri vardır; bununla birlikte, yüksek maliyetli bu profil tekniği araştırmacılar caydırıcı olabilir. Burada, ön miRNA&#39;lar profil maliyet-etkin, güvenilir, SYBR tabanlı qPCR yöntemi tartışacağız. -MiRNA öncesi düzeylerinde değişiklikler genellikle olgun miRNA değişiklikleri yansıtmak ve olgun miRNA ifade yararlı bir göstergesi olabilir. Yedeksiz bilgi katkıda bulunmak ve microRNA işleme içgörü sağlayabilir Ancak, pre-miRNA&#39;lar ve olgun miRNA&#39;lar hem de eş zamanlı olarak profil optimal olabilir. Ayrıca, burada açıklanan tekniği, özel yollar veya patojenler için diğer kütüphane setleri profil kapsayacak şekilde genişletilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays at JoVE.com

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

17.2K Görüntüleme.  University of North Carolina at Chapel Hill. Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Video: Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Biyoloji

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Aurora kinazının Gerçek Zamanlı İzlenmesi Canlı Hücrelerde Konformasyonsal FRET Biyosensörleri Kullanılarak Aktivasyon

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...