כל המחברים מודים תמיכת התשתית מNHMRC CTC, אוניברסיטת סידני, קרן המחקר לסוכרת נעורים (JDRF), אוסטרליה וקרן קופר רבקה, אוסטרליה. מחקר זה מומן באמצעות מענקים מהמועצה האוסטרלית למחקר (FT110100254) וJDRF, אוסטרליה (CRN201314) לאהה WW, RJF וMVJ ביצע את כל הניסויים המעבדה הרטובים, ASJ ביצע ניתוח נתונים. WW כתב את הטיוטה הראשונה. אהה מתוכנן המחקר וניתח את הנתונים. כל המחברים לקרוא והסכימו על הנוסח הסופי של כתב היד, דמויות וגיליונות העבודה שהוגשו לפרסום.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell.">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development,+regeneration+and+diabetes.">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li><li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes.">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development.">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li><li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer.">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies.">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24 (2006).</li><li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects.">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89 (2009).</li><li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients.">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li><li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases.">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer.">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148 (2008).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3.">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li><li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs:+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR.">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma.">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292 (2014).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media.">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury:+A+TaqMan(R)+Low+Density+Array+study.">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms:+microarray,+beads+array,+and+quantitative+real-time+PCR+array.">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167 (2011).</li><li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer.">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li><li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens.">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta, ., V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

עלויות עיבוד / פרסום מאמר היו מכוסות על ידי Life Technologies, הבא קבלה של כתב היד הזה לפרסום.

השלבים הקריטיים בפרוטוקולי qPCR מבוסס הבדיקה כדי לקבל תוצאות מדויקות ושחזור הם לעשות 1 בטוח) את אותו הנפח והריכוז של RT-מוצר טעון בכל תגובת qPCR, 2) היחסים ונפחים הנכונים של הרכיבים דרושים ל תגובת qPCR מוכנה ומעורבת היטב, 3) הכרכים הנכונים ועקביים מתווספים לכל תגובת qPCR, ו -4) העריכה ולטעינה של כל דגימה ותגובת תמהיל הושלמה בזמן הקצר ביותר אפשרי, ועדיין מודעים ל השלבים הקריטיים מעל שהוזכרו קודם לכן. כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה צריכים צנטריפוגות המתאימה ודליים ספציפיים. כל אחד מהסלים יכולים להכיל עד 3 כרטיסים (עמוסים / ריק). תמיד לוודא שכל 3 החריצים של דלי עסוקים והדלי הוא מאוזנת על ידי הצבת דלי דומה (הדלי הזה צריך להכיל גם 3 כרטיסים, ריקים או מלאים) בחריץ השני של צנטריפוגות. תוך שימת הכרטיס בbuckeבעל t, לוודא כי המאגרים 8 להקרין כלפי מעלה ובארות תגובת הפנים לקיר החיצוני של צנטריפוגות. ספין הכרטיסים ב331 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר. אחרי הספין ראשון, לפתוח את צנטריפוגות וחזותית להבטיח את תערובת התגובה כבר חילקה באמצעות 384 הבארות. חזור על הספין באותן הגדרות עבור 1 יותר זמן. הסר את הכרטיס מהדלי ולהבטיח כי רמת תערובת תגובה בכל אחד מהמאגרים 8 היא אחידה. כל חוסר עקביות בנפחי הנוזל שנותרו במאגרים להפוך את הכרטיס לשימוש בלתי הולם נוסף. כדי לקבל את אותו הריכוז של RT-המוצר, אותו ריכוז קלט של רנ&quot;א הוסיף לכל תגובת RT. סך הכל ריכוז RNA נמדד באמצעות מיקרו-volumespectrophotometer. היחס נצפה 260/280 יכול להיות נמוך כמו 1.3 לRNA מבודד מפלזמה / סרום; זה לא נראה שיש להם השפעה על תהליך הקשור לqPCR במורד הזרם או נתונים שנוצרו 30. כמו כן, יחס 260/280 שלדגימות RNA נבדקו במסמך זה היו בין 1.3-1.7 ללא תופעות חריגות בqPCR נצפו. בעת שימוש בדגימות נמוכות RNA תוכן, כמו אלה מbiofluids, זה עלול להיות קשה לכמת RNA לפני העיבוד. אנו ממליצים על השימוש בספייק-בסינטטי בבידוד RNA, כמו גם את שלבי שעתוק לאחור. מניסיוננו, מועמדי ארבידופסיס thaliana מירנה (ATH-miR-159a וATH-miR-172a) עדיפים על miRNAs elegans Caenorhabditis (כגון cel-miR-39 או cel-miR-54), אשר בניסיון שלנו עשוי להיות גבוה יותר הומולוגיה מאלה מא thaliana. השימוש בספייק-בשלב ספציפי כזה יכול להסביר את הנורמליזציה של נתונים מירנה פני דגימות מרובות assayed בזמנים שונים. שימוש קבוע קלט נפח של RNA לתגובת סינתזת cDNA מומלץ גם 32,33. שלושה הפרוטוקולים מבוססים-הבדיקה לכימות מירנה שתוארו כאן דורשים כמויות משתנותשל קלט RNA הכולל, זרימות עבודה ועלויות שונות. כל אחד מתהליכי העבודה נועד לספק תפוקה שונה המבוססת על מספר מטרות מירנה ומספר הדגימות להיות מנותחים. עם הגדלת תפוקה (96 rxn rxn 3072 384 rxn), העלות לכל תגובה יורדת עם עלייה בכמות של נתונים המתקבלים על יחידת זמן. מאז כל פלטפורמות אלה לנצל כימיה TaqMan, ניתן לצפות באיכות של נתונים המתקבלים להיות דומה. TaqMan qPCR הוא שיטה מבוססת היטב לזיהוי השפע של miRNAs בדגימות סרום / פלזמה 9,11,27. למרות ששלוש הפלטפורמות שנדונו כאן חולקות את אותה הכימיה, ירידה בנפח התגובה מובילה לירידה בטווח דינמי של גילוי תמליל (פאר RJ et al., נתונים שלא פורסמו). פלטפורמת qPCR 96-גם היא תפוקה נמוכה יותר, אבל פלטפורמת רגישות גבוהה ולדעתנו, &quot;תקן הזהב&quot; לכל פלטפורמות PCR (או דיי מבוסס) המבוסס על הבדיקה. עם זאת, ייתכן שזהלא תהיה הפלטפורמה החסכונית או יעילה ביותר אם כמה מאה או אלפי דגימות שמתבצעת assayed ולמייקרו-רנ&quot;א מרובה. מיקרופלואידיקה (TLDA) וnanofluidics פלטפורמות (OA) הן פלטפורמות תפוקה גבוהה / תוכן שנועדו לאפשר רכישה של נתונים גדולים יותר בזמן קצר יותר. למרות הבדלים אצווה נצפו בכרטיסי TLDA, זה יכול להיות ממוזער על ידי בקשת כרטיסי TLDA מאותה אצווה. אנו צופים כי פלטפורמת TLDA (איור 3) הראתה וריאציה משמעותית בכ -17% מאמצע - miRNAs שפע נמוך כאשר נבדק באמצעות המדגם זהה בקבוצות שונות של כרטיסי TLDA. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש באותו מספרים אצווה לניתוח באמצעות כרטיסי TLDA. גם וריאציה זו יכולה להיות בגלל ההשתנות הטכניות לרבות כל שגיאות טעינה וpipetting פוטנציאליות. עם זאת, אנו ממליצים הזמנה / מבקש את אותו אצווה של כרטיסי TLDA. אין וריאציה אצווה משמעותית נצפתה על פלטפורמת OA. למרות זאת, TaqMan experimen מבוססטל qPCR גישות הצעת קלות למדוד את השפע של miRNAs בדגימות פלזמה / סרום. גישות התפוקה נמוכה, בינוניות וגבוהות שנדונו כאן מציעות את הגמישות כדי לנתח מגוון של דוגמאות וmiRNAs באמצעות כימיה יעילה ביותר, לשחזור ונקיה (רעש רקע נמוך).

מייקרו RNA (miRNAs) הוא ~ 22 נוקליאוטידים (NC) RNAs ללא קידוד, מתפקד כרגולטורים של ביטוי גני 1-3. רוב miRNAs בבעלי חיים לתפקד באמצעות זיווג בסיס רצף ספציפי עם mRNA, מיקוד &#39;UTR 3, מה שמוביל לרגולציה שלילית של ביטוי גני 2-4. זו מתרחשת בדרך כלל באמצעות בלימת תרגום mRNA או אחר טיפה-off ריבוזומלי. miRNAs במחזור הוכח להיות סמנים ביולוגיים חדשניים במחקר ובשדות קליניים עבור מגוון רחב של מחלות, כגון סוכרת 5-7, השחלות 8, סרטן הערמונית וסרטן השד 9 10,11, צהבת מסוג B 12 ומחלות אוטואימוניות אחרות 13. מחקר נערך לזהות miRNAs בשפע בתאים או רקמות שונים, כמו גם שבמחזור מפלזמה אנושית ודגימות סרום, שהוא נגיש יותר ופחות פולשני 9,11-15. שיטות שונות של כימות מירנה היו דוארstablished באמצעות פלטפורמות מרובות, כגון פלטפורמת 96-היטב סטנדרטית צלחת 4,12,16-18, פלטפורמת כרטיס מיקרופלואידיקה 12,18-23 ופלטפורמת מערך nanofluidics 17,24. בזמן אמת PCR (qPCR) מציע את היכולת למדוד מספרים יחסי או מוחלטים של תמלילים באמצעות מרובה (dye- או מבוסס בדיקה) chemistries. כימיה PCR בזמן אמת המבוססת על הבדיקה מציעה את היתרון של הקרינה רקע נמוכה ורגישות גבוהה לגילוי עותק תמליל בודד. הוא יחסית חסכוני, פשוט לשימוש ומאוד לשחזור, מה שהופך את שיטה מועדפת לכימות וקביעת ביטוי מירנה 25. שיטת qPCR מבוססת בדיקה בדרך כלל כרוכה בשני שלבים: להפוך שעתוק (RT) וqPCR 4,26,27. RT הוא המקום שבי פריימר גזע הלולאה RT הוא הכלאה למולקולת מירנה בוגרת או עיקרי והמיר ל- DNA משלים (ג). כימות של מוצר cDNA מתבצעת לאחר מכן באמצעות פריימרים PCR מירנה ספציפיים26-28. עיקרון qPCR מבוסס בדיקה מבוסס על זיהוי של הארכה משלימה גדיל בזמן אמת, הכוללת הידרוליזה של החללית מתויג fluorescently. בדיקות אלה נועדו להכיל כתב ניאון ומרווה, כי הם פשוט בנפרד כדי לאפשר סריג (העברת הקרינה תהודה אנרגיה). זיהוי של הפליטה מכתב הקרינה (פולט) מוסווה בקרבתה של מולקולת המרווה. כאשר פולימראז תקי (pol) משתרע מפריימר במעלה הזרם ומגיע מזלג (סוף &#39;5 של הבדיקה), פעילות exonuclease pol תקי hydrolyses הבדיקה, שהובילה לניתוק / הפרדה פיזית של פולט הניאון מהמרווה. גרסה זו של מולקולה בודדת של פולט הקרינה שתועדה על ידי הגלאים ומוצגת כגידול מצטבר באות הקרינה שמגם / תגובה. העלייה בקרינה היא פרופורציונלית לכמות של מוצר ה- PCR שנוצרה, המאפשר qu מדויקantification של 26,28 היעד המוגבר. עם ביקוש גובר בכימות מירנה, בינוני לטכנולוגיות תפוקה גבוהה פותחו כדי לאפשר למספר גדול יותר של דגימות לעיבוד בפרק זמן קצר. מערך TaqMan בצפיפות נמוכה (TLDA) הוא עיצוב בינוני תפוקה חדשני microfluidic מבוסס על הכימיה qPCR מבוסס בדיקה מציע גידול במספר miRNAs ניתח בצלחת אחת. TLDA כרוך בשימוש בברכה מוגדרת מראש של RT-פריימרים המשמשים לסינתזת cDNA. אז cDNAs אלה הסתחררו לתוך 384 גם מיקרו-fluidic כרטיס מותאם אישית כדי לקבוע את הביטוי של miRNAs מרובה באמצעות qPCR 22,26,29. היטב בכל הכרטיס מכיל מיובש פריימרים ובדיקות כדי להגביר מירנה ספציפית (ים), ולכן עד 384 תגובות יכולות להיות מעובד בכרטיס היחיד TLDA 26. מערך nanofluidics הוא פלטפורמת תפוקה גבוהה המשמשת לזיהוי של תמלילי גן <sup&gt; 24 תוך שימוש באותה הכימיה מבוססת בדיקה. הוא מנצל מטריצת קניינית מציעה אינטראקציות הידרופוביות-הידרופילי כדי להקל על טעינה קלה של תערובת תגובת 33 nanoliter למערך של 3072 דרך חורים בשקופית נירוסטה 24. מאמר זה מתמקד במדגים כיצד שיטות אלה לכימות miRNAs בסרום / פלזמה מבוצעות והגורמים הקריטיים שיש לקחת בחשבון בעת ​​ביצוע ופרשנות נתונים כאלה. נלקחו בחשבון, היתרונות האישיים שלהם ואת המגבלות יידונו במאמר זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

PCR כמותי המבוסס על בדיקה (qPCR) הוא שיטה מועדפת למדידת שפע תמליל, שכן הוא אחד מהשיטות זיהוי הרגישים ביותר המספקת ניתוח מדויק ושחזור. כימיה מבוססת Probe מציעה את הקרינה רקע לפחות בהשוואה לchemistries אחר (המבוסס על צבע). נכון להיום, יש כמה פלטפורמות זמינות שכימיה מבוססת בדיקה שימוש כדי לכמת שפע תמליל. qPCR בצלחת גם 96 הוא השיטה הנפוצה ביותר באופן שגרתי, אך רק למקסימום של 96 דגימות או miRNAs ניתן לבדוק בטווח אחת. זה זמן רב ומייגע, אם מספר גדול של דגימות / miRNAs הוא להיות מנותח. פלטפורמות מבוססות בדיקה תפוקה גבוהה כגון מיקרופלואידיקה (למשל כרטיס מערך TaqMan) ומערכי nanofluidics (למשל OpenArray) הצעת קלות וביעילות reproducibly לזהות את השפע של מיקרו-רנ&quot;א המרובים במספר גדול של דגימות בזמן קצר. הנה, אנחנו מדגימים את ניסיוני התקנהnd פרוטוקול כדי לכמת את מירנה מסרום או דגימות פלזמה EDTA, באמצעות כימיה מבוססת בדיקה ושלוש פלטפורמות שונות (96 צלחת גם, מיקרופלואידיקה ומערכי nanofluidics) מציעה רמות גוברים של תפוקה.

הנפח המומלץ לתגובת qPCR מבוססת assay הבדיקה מירנה הוא 20 μl. הערה: יש לנו אישר כי עוצמת תגובה של 5 μl היא מסוגלת לייצר תוצאות דומות לאלה שהושגו באמצעות 4,7,30 נפח 20 μl. הפחתת נפח התגובה ל5 μl מאפשרת לירידה של 75% בעלויות מגיב ללא הפסד ניכר ברגישות. כפי שהוצגו באיור 2, כרכי תגובה של 20 μl ו -5 μl להראות שיתוף ביחס חזק עד 39 מחזורים (עם r 2 של 0.92, p = 0.0002). מערך מיקרופלואידיקה מספק כלי לקבלת נתונים על 754 miRNAs בא לידי ביטוי במדגם בסביבות 5 שעות (לכרטיס והכרטיס B), שהיא דרך יעילה יותר של ניתוח דגימות מרובות בהשוואה ל -96 PCRs צלחת גם הקונבנציונלי. אנחנו לעומת כרטיסי מירנה מערך מיקרופלואידיקה עבור אותו המדגם (לדוגמא ודוגמה חוזרת) איור 3 א -. B מציג עלילה בלנד-אלטמן (&lt;strong&gt; 3 א) ועלילת מתאם (3B) לכל 754 miRNAs נבדק דגימות אלה. ישנם 3 miRNAs שונה שליטה (U6, RNU44 וRNU48) ממוקם באופן אקראי בשני כרטיסים (Card ו- B) במקומות רבים. כאשר סף מחזור U6 ערכים (CT) הם בהשוואה בין 2 הריצות, אנחנו לא רואים הבדלים משמעותיים בין הערכים (לוח 4). כמו כן, חשוב לציין כאן שU6 מתבטא בשפע גדול יותר (ערך נמוך Ct) במדגם העריך. לאחר מכן, אנו לעומת כל miRNAs שיש לי ערכי ה- CT בין 0-19.99 בשתי הריצות (n = 150), שהיה לי ביטוי דומה של miRNAs כולל עם שיתוף יעיל של נחישות של 98% (איור 3 ג-ד). מכל 277 miRNAs שיש לי ערכי ה- CT בין 20 ל 29.99 בשתי הריצות, 16 מירס היה שונה משמעותי בין הריצות המקוריות וחזור (איור 3E - F) מספר miRNAs עם הבדל משמעותי betwee.n הריצות מוגברות (89 של 327), כאשר ערכי ה- CT נבחרו בין 30-40 עבור שני הריצות (איור 3G - H). פלטפורמת מערך nanofluidics מספקת נתונים לmiRNAs 754 מכל מדגם בסרום / פלזמה נבדק, כפי שהוא מיוצג באיור 4 א זה חשוב לבחון עקומות הגברה אלה -. כפי שהוא עם כל qPCR - כדי להבטיח שהתוצאה מעידה על הגברה נכונה. כל אחד מsubarrays 48 (איור 1) מכיל גם assay לשלוש ncRNAs הפופולרי ביותר &quot;משק הבית&quot;:. U6, RNU44 וRNU48 איור 4 ממחיש אשכולות טיפוסיים של U6 משכפל ממדגם יחיד. משכפל אלה להציג סטייה נמוכה סטנדרטית (SD &lt;0.5) וכך גם מדד לאמינות. לחלופין, איור 4C מדגים את השונות מוגברות של משכפל U6 (SD&gt; 0.5) במדגם שני. זה אינו שולל את תוקף of מבחני שנותרו, על אף שהוא עושה מחייב ביקורת מעמיקה יותר. U6, כמו עם רוב miRNAs &quot;משק הבית&quot; בנוזלים ביולוגיים, יכול להיות ביטוי משתנה. יש לציין כי אחת דוגמאות, שמתוארים באיור 4C, מציג פי 4 פחות תוכן U6 מכפי שהוצגו באיור 4. מאחר והרמה של U6 במדגם מוצג ב4C היא 75% פחות מלכתחילה מזו שהוצגה ב4B פנל, השתנות טכנית יותר צפויה בשל התפלגות פואסון של תמלילים, שהוחמרה על ידי קטן נפח תגובת 17. כלי שימושי נוסף הוא תמונות בקרת איכות (QC), זמינות ליצוא ברגע שהשלימה הריצה. בחירה של אלה משתמשת בקרינה של רוקס, הצבע הפסיבי נמצא בתמהיל מגיב qPCR, כדי לוודא שכל-חור נטען (איור 5) בצורה נכונה. דרך חור, או אכן en<html> subarray הצמיג, עשוי שלא להיטען בשל מספיק נפח דגימה, אידוי, בועות הנוכחיות בבארות של צלחת מדגם 384 גם, אי להסיר לחלוטין את חותם צלחת מדגם, או פגמים במערכת Accufill או העצות שלה. כל נפרקו דרך החורים חייבים להיות מזוהים, כדי למנוע miRNAs תיוג כ&quot; בלתי ניתן לגילוי &quot;, כאשר במציאות assay לא נטען מעולם. אם בעיה זו היא נתקלה, מאשר כי לפחות 5 μl של המדגם / mastermix הוא נטען לתוך היטב בכל צלחת מדגם 384-היטב, צלחת מדגם centrifuged כראוי לפני הטעינה, חותם נייר נמחק לחלוטין, וOpenArray הטעון השקופית אטומה ולהפעיל בתוך הזמן המוקצב לכל ריצות הרצופות. אם ייתקל בבעיות טעינה עדיין נמשכות, אלה עשויים להיות סביר יותר הנוגעים ליצוו ספציפיים או הרבה מערכים או מתכלה קשורים וסיוע נוסף יש לחפש דרך היצרן. &quot;Src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 52,586 / /&gt; 52586fig1.jpg &quot; איור 1: פריסה של דגימות לעבודת מערך Nanofluidics: (א) כל צלחת מדגם 384 גם יכול להחזיק דגימות עד 8 ​​מערכי nanofluidics. (ב) בדילול מלא, cDNA הגברה מראש ממוקם לתוך 8 בארות (2 עמודות על ידי 4 שורות), עם בריכה וברכה ב &#39;בקבוצות 8 היטב סמוכות. כל עיגול מייצג גם אחד. היטב בכל צלחת המדגם (C) יהיה טעון לsubarray אחד של מערך nanofluidics. כל ריבוע קטן מייצג subarray אחד. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> איור 2: ניתוח Co-ביחס למשך 96 היטב פלטפורמות קונבנציונליות PCR: Co-יחס בין 20 μl ו -5 כרכי תגובת μl על TaqMan בזמן אמת qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית בערכי CT (39 מחזורים). אנחנו לעומת 4 מיקרו-רנ&quot;א שונה (miR-375, miR-30c, miR-30D וmiR-7) ב 4 דגימות סרום ופלזמה אנושיות שונות. רק 11 נקודות נתונים הם זממו מאז אחרים היו בלתי ניתנות לגילוי. R 2 = 0.92, p = 0.0002. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . איור 3: מחזור פרופיל מירנה באמצעות כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה שימוש 2 כרטיסי מיקרופלואידיקה (כרטיס וכרטיס-B), פרופיל של 754 miRNAs נוצר (- B). כפי שניתן לראות כאן, השתמשנו מדגם זהה עבור 2 מערך מיקרופלואידיקה פועל כדי לבדוק שחזור של תוצאות כרטיס מיקרופלואידיקה. אנו הבחנו ביטוי דומה של miRNAs כולל, עם ערכי ה- CT בין 0-19.99 (C - D). יש מעט miRNAs (16 277) עם ערכי ה- CT בין 20-29.99 ומשמעותי הבדלים בין ריצות החוזרות (E - F). שמונים ותשע של 327מיקרו-רנ&quot;א עם ערכי ה- CT גבוהים יותר (30-40) הציג הבדלים משמעותיים בין שני הריצות (G - H). &#160; הנתונים נותחו באמצעות מבחן T לזווג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> איור 4: פרופיל נציג של Curves PCR מוצרי ההגברה: האם דמות מייצגת של עקומות הגברה () בשילוב של כל מטרות מירנה למדגם פלזמה אנושי. Assay לU6 (שליטה משותפת ncRNA) ממוקם בכל subarray. המדגם ב( B) מדגים שונות נמוכות (SD &lt;0.5) ואילו (C) מראה סטיית תקן גבוהה (SD&gt; 0.5) בתוך U6 משכפל. שני הדוגמות טוטהRNA l מבודד מפלזמה אנושית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> איור 5: ניתוח QC של מערכי Nanofluidics: בקרת איכות תמונות (QC) של מערך נטען כראוי nanofluidics (משמאל) ומערך nanofluidics נטען באופן שגוי (מימין). הצבע הפסיבי, רוקס (הנוכחי בתמהיל מגיב qPCR), מאיר כדי לציין-חור נטען כראוי. יש המערך מהימין כמה subarrays / דרך חורים שאינם עמוסים בתערובת מגיב qPCR ואלה צריכים להיות מזוהים כPCR תגובות שליליות-שגויות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל 5 תגובת μl (μl) </td></tr&gt; <tr><td> מאגר RT (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 מ&quot;מ) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNase מעכב </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> nuclease ללא מים </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Transcriptase הפוך </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> נפח כולל </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> לוח 1 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT בזמן אמת TaqMan qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל 5 תגובת μl (μl) </td><td> נפח לכל 20 תגובת μl (μl) </td></tr><tr><td> mastermix המהיר PCR (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> assay TaqMan qPCR (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nuclease ללאמים </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> נפח כולל: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * רכיב assay המבוסס על מירנה נבחרה נבדקה. 1B שולחן: רכיבי תערובת מגיב qPCR ב5 או 20 μl הכנת תגובת qPCR בזמן אמת TaqMan qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל תגובה (μl) </td></tr><tr><td> Primers Megaplex RT (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTPs עם dTTp (100 מ&quot;מ) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe ההפוך transcriptase (50 U / μl) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT מאגר </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 מ&quot;מ) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase מונעי &amp; #<html> 160; (20 U / μl) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nuclease ללא מים </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> לוח 2 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT לפנל TLDA מירנה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל תגובה (μl) </td></tr><tr><td> TaqMan קדם המגבר mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Primers Megaplex קדם המגבר (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> nuclease ללא מים </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> שולחן 2B: רכיבי תערובת מגיב קדם מגבר בהכנת תגובת 25 μl מראש amplication לפנל TLDA מירנה. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל תגובה (μl) </td></tr><tr><td> Primers Megaplex RT (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTPs עם dTTp (100 מ&quot;מ) </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe ההפוך transcriptase (50 U / μl) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT מאגר </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 מ&quot;מ) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase אינהיביטור (20 U / μl) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Nuclease ללא מים </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> לוח 3 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT לפנל מירנה nanofluidics מבוסס בדיקה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבs </td><td> נפח לכל תגובה (μl) </td></tr><tr><td> TaqMan קדם המגבר mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Primers Megaplex קדם המגבר (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> nuclease ללא מים </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> שולחן 3B:. מרכיבי תערובת מגיב קדם מגבר בהכנת תגובת 25 μl מראש amplication לפנל מירנה nanofluidics מבוסס בדיקה הערה: המשלים האינטראקטיבי להצטיין גיליונות אלקטרוניים הניתנים לשלוש פלטפורמות, כבר מהווה תוספת של 5% כדי לפצות על pipetting שגיאה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לדוגמא </td><td> לדוגמא חוזרת </td></tr><tr><td> 15.535 </td><td> 16.156 </td></tr><tr><td> 15.471 </td><td> 15.652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16.063 </td></tr><tr><td> 15.963 </td><td> 15.889 </td></tr><tr><td> 14.006 </td><td> 13.993 </td></tr><tr><td> 14.502 </td><td> 14.623 </td></tr><tr><td> 14.907 </td><td> 14.384 </td></tr><tr><td> 13.732 </td><td> 14.946 </td></tr></tbody></table> לוח 4: מחזור פרופיל U6 מירנה באמצעות כרטיס מערך מיקרופלואידיקה. שימוש בשני כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה (A ו- B). CT-ערכים של מירנה שליטת U6 מדוגמה (סה&quot;כ = 8). שפע מירנה שליטת U6 עקבי נצפה בין הריצות.

Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

מיקרו-רנ&quot;א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ&quot;א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K Views.  The University of Sydney.  מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור...

Video: Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Experimental Approaches to Tissue Engineering

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...