Biz P sağlamak için Washington Üniversitesi (Seattle, WA) Matt Parsek teşekkür aeruginosa, E. Akarsular yazılıma erişim sağlamak için Canterbury (Yeni Zelanda) Üniversitesi&#39;nde coli suşları ve Roger Nokes. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü hibe R01AI081983 tarafından desteklenmiştir. Konfokal görüntüleme Kuzeybatı Biyolojik Görüntüleme Tesisi (BIF) gerçekleştirildi.

1. Akış Hücre Kurulum ve Aşılama NOT:. Song ve ark tarif çift giriş mikroakışkan akış hücresi kullanın, 2014 14 biyofilm büyümeye. Bu akış hücresi iyi tanımlanmış pürüzsüz kimyasal degradeler oluşturmak mümkün. Akış hücresi tasarım, önceden Song açıklanan, Şekil 1 &#39;de gösterilen ve hücre imalat akış ve ark., 2014 14. Burada detaylı Yöntemlerimizi P kullanılarak aeruginosa, E. E. coli biyofilm oluşturulması için, ancak diğer türlerin de uygun olabilir. Biz P. kullanılan aeruginosa kurucu biyofilm geliştirilmesi için bir model organizma olarak, yeşil floresan protein (GFP) ifade gfp, PAO1-. Ayrıca, E. kullanılan coli DH5a P. ile karışık türler biyofilm oluşturmak için aeruginosa. P. aeruginosa, E. E. coli suşları LB agar plakaları üzerinde yetiştirildi. <ol><li> A (PDMS) bağlı akış hücresi kullanarak polidimetilsiloksan hazırlayın14 de tarif edildiği gibi, oksijen plazma muamelesi üzerinden cam lamel. Akış hücresi odasının boyutları 0.24 mm (uzunluk x genişlik x derinlik) × 23 mm × 13 mm. </li><li> Hazırlayın FAB büyüme ortamı 15 güncellenmiştir. Akış hücre içinde bir beslenme degrade altında biyofilm büyüme gözlemlemek için, bir girişinde 0,6 mcM glukoz ile 15 orta FAB değiştirilmiş ve diğer giriş boyunca herhangi bir karbon kaynağı olmadan FAB orta tanıtmak getiriyordu. Filtre ile sterilize (gözenek boyutu = 0.2 mm) FAB orta eklemeden önce glikoz stok çözeltisi (60 mM) getirilmiştir. Ayrıca döngüsü 1 FAB orta otoklav (sıvı, 15 dakika, 121 ° C, 17 psi) ile yıkanmıştır. </li><li> Akış sistemi sterilize. Aşılamadan önce, bütün akış yolunu (orta şişe, boru, kabarcık tuzakları, akış hücreleri) akış hücresinin üst bulunan (tek ve önceden sterilize) plastik üç yollu vana hariç, döngüsü 1 kullanarak otoklav. (Üç Yollu vana hücre c enjekte edilmesi için kullanılanulture, floresan izleyici ve mikroboncukları.), montaj sırasında kirlenmesini önlemek alüminyum folyo veya otoklav önce otoklav torbaları ile tüm boru ve bağlantı açıklıkları karşılamak için. </li><li> Akış sistemi bağlayın. Dikkatle akış hücresi sistemi bileşenlerini monte (akış sistemi montajı için video bakınız) ve tam akış hızını kontrol eden bir peristaltik pompa vasıtasıyla akış hücresi büyüme ortamı sunmak. </li><li> P. bir koloni aktararak aşılama için hücre kültürü hazırlayın aeruginosa veya E. LB plakaları 3 LB et suyu ilave edildi ve 225 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de kültür O / N sallamak için E. coli. Son OD 600 su sterilize 1 ml O / N hücre kültürleri sulandırmak = 0.01 inokulum olarak. (Kültür ve kirlenmeyi önlemek için bir laminer akış kaputu bakteri sulandırmak.) </li><li> Eşdeğer OD 600 ile 1 ml 1 = 0.01 Her bir bakteri için: karışık türleri biyofilm ile deneyler için, 1 oranında iki bakteri kültürleri seyreltin. </li><li> Akış hücresi inoküle. Üç yollu bir valf akış hücresi girişine aşı 1 ml enjekte edilir. Enjeksiyon sonrası, bakteriyel hücreler cam kapak takmak için izin 1 saat akışını durdurun. (Akış hücresi askıya hücreler lamel üzerine yerleşmek için izin aşağı lamel tarafı ile yerleştirildiğinden emin olun.) </li><li> 1 saat sonra, akış devam ve 3 gün süre ile her bir giriş için 0.03 ml / dakikalık bir sabit oranda akış hücresi büyüme ortamı pompa. </li></ol> Konfokal Mikroskobu kullanılarak Besin Gradiyentler Cevabı 2. karakterizasyon Biyofilm Geliştirme NOT: P. aeruginosa kurucu olarak ifade edilen GFP ile görüntülenmiş, ve bununla birlikte E. edilebilir karma türler Biyofilmlererde coli counterstaining tarafından görüntülendi gerekir. <ol><li> Konfokal mikroskopi kullanılarak 3 gün biyofilm gözlemleyin. Temsilcisi sonuçları için bir 63X amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak biyofilm gözlemlemek. Görüntüleme önce işaretleyinizkapak cam tarafında bir ızgara ile çift giriş akış hücresi. (Bu ızgara amacı deneyci akış hücresi odasının içinde görüntüleme bölgeleri bulmak için izin vermektir.) </li><li> Örneğin STYO, 62, 990 ul stok çözeltisi (1 mM) ile sterilize edilmiş su ve daha sonra yavaş yavaş bir şırınga içine kullanılarak seyreltilmiştir leke enjekte, yeşil flüoresan nükleik asit boya olarak hücre-geçirgen kırmızı floresan nükleik asit leke 10 ul seyreltilmiş, counterstain için yukarı üç yollu vana akış hücresi odası. Durgun akış hücresi edin ve 30 dakika boyunca karanlıkta üretilmişler ve sonra 15 dakika için bağlanmamış leke üzerinden yıkama akışı devam eder. </li><li> Konfokal görüntüleme gerçekleştirin. Uyarma için 488 nm Argon lazer ve GFP (500-535 nm) ve (yeşil floresan nükleik asit leke, 650-750 nm) nükleik asit leke kanalları toplama emisyon etkinleştirin. Parlak ve temiz görüntüler için her iki kanal için kazanç ve uzaklıklar ayarlayın. Seç xyz ve eşzamanlı görüntüleme modu. Iden z kontrol düğmesini kullanınalanında biyofilm alt ve üst tespit edebilecektir. 3-D görüntü yığını elde etmek için 0.5 mikron z-adım ayarlayın. (Görüntü elde etmek için dört bir çizgi ortalama kullanmak, yüksek görüntü kalitesini sağlamak için.) </li><li> Üç ya da mekansal akış hücresi içinde biyofilm geliştirme şekilleri, görüntü biyofilm eşlemek için daha uzunlamasına (x) akış hücresi girişi boyunca mesafeler ve Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, üç enine (y), uygulanan besin derecesinde göre konumlandırır . </li></ol> Muhafazakar Floresan Tracer Enjeksiyonların 3. karakterizasyon İç Katı Ulaşım NOT: Cy5 gibi tutucu bir floresanlı işaret ley ic, biyofilm içinde çözünen nakil kalıpları karakterize etmek için kullanılabilir. <ol><li> Bir stok çözeltisi olarak 10 mg / ml&#39;ye bir son konsantrasyona kadar su içinde Cy5 (mono-reaktıf NHS esterlı) içinde çözülür. -20 ° C derin dondurucuda Cy5 stok solüsyonu saklayın. NOT: Cy5 ışık Sensit olduğu gibiive, mağaza, sulandırmak ve karanlıkta Cy5 çözümleri enjekte. </li><li> Floresan izleyici enjeksiyonları öncesinde, (bir 63X amacı ile) konfokal mikroskobu ile 3 gün biyofilm 3-D görüntü yığını alır. (Biyofilm kolonilerin geniş bölgeleri boya nakil zaman serisi gözlemler için idealdir.) (Şekil 5A&#39;da gösterildiği gibi) aynı zamanda görüntüleme için iyi ayrılmış koloniler ile bir z düzlemi seçin. </li><li> Her bir Cy5 enjeksiyon deney için, 20 ug / ml arasında bir Cy5 konsantrasyona sahip bir enjeksiyon çözeltisi elde etmek için su ile sterilize 998 ul Cy5 stok çözeltisi, 2 ul seyreltin. </li><li> Akışını duraklatmak ve 3-yollu vana vasıtasıyla bir şırınga kullanılarak akış hücresinin memba içine Cy5 çözüm enjekte etmek pompayı durdurun. (Bu enjekte ederken akış yolunu girmesini hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. Kabarcık tuzakları geri enjeksiyon sırasında açık tutulmalıdır.) </li><li> Cy5 çözüm enjekte ettikten sonra, 3-yollu vana ayarlamak, kabarcık tuzakları kapatın ve yeniden başlatınakış hücresi enjekte Cy5 çözüm sunmak için pompa. </li><li> XYT için konfokal görüntüleme moduna geçiş. Eşzamanlı görüntüleme modunda Cy5 ve GFP kanalları etkinleştirin. (Lazer yoğunluğu kazanmak ve ofset) Cy5 yoğunluğuna konfokal ayarlarını yapma ölçümü için kritik sinyaller, doyurarak önlemek için. (Yüksek çözünürlüklü zamansal boya penetrasyonu görselleştirmek için tercih edilir. Ancak, hızlı tarama görüntü kalitesini düşürür.) Görüntüleme süresi çözünürlük ve görüntü kalitesi dengelemek için uygun tarama hızı ve çizgi ortalama seçin. Bu protokol için dört bir çizgi ortalama ve 0.15 Hz kare hızı kullanın. </li><li> (Hala 0.03 ml / dk&#39;lık bir akış hızında) akış hücresi içine Cy5 sağlamak için akış devam edin. Aynı anda zaman serisi konfokal görüntüleme başlatın. </li><li> Radyal 2-D dairesel biyofilm koloni içinde Cy5 yoğunluğunu ortalama olarak Cy5 nüfuz niceliğini. Ilk biyofilm küme kenarını tanımlamak, ortalama, ardından kümenin 2-D bölümü için bir mesafe haritası oluşturmakVe son olarak, Cy5 yoğunluklarının ortalaması radyal kalıpları bir penetrasyon eğrisi (bakınız Şekil 6) üretir. <ol><li> Hesaplama 3.8 adıma gerçekleştirmek için, BioSpa (Biyofilm Mekansal Desen Analizi) yazılım paketi (yayınlanmamış, yazılım paketi ve el istek üzerine) veya diğer görüntü analiz programları kullanın. </li><li> BioSpa kullanmak için, öncelikle BioSpa içine ayarlanmış bir görüntüyü içe. Sonra ikili görüntüleri yapmak için GFP ve Cy5 kanalları için uygun eşik seçmek. Analiz / Hesaplama menüsünde, Gelişmiş Analizi ve ardından Difüzyon Analizi seçin. Bir küme kenarını tanımlamak ve faiz (ROI) bölgesi gibi bir küme seçmek için poligon aracını kullanmak için GFP kanalı kullanın. </li><li> Çift difüzyon analizi gerçekleştirmek için seçilen biyofilm kümeyi tıklatın. Difüzyon analiz sonuçlarını kaydedin ve bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak Cy5 konsantrasyonuna Cy5 yoğunluğunu ayarlayın. <ol><li> Bir Cy5 conce üzerinde Cy5 yoğunluklarını ölçmek, Cy5 konsantrasyonu kalibrasyon eğrisi oluşturmak içinkonfokal mikroskopta ntration degrade. (Cy5 yoğunluğu ve konsantrasyonu doğrusal bir ilişki vardır.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Takip Floresan Parçacıklar tarafından Etraftaki Akış Field karakterize NOT: floresan mikro Flüoresan parçacıklar, biyofilm çevresinde akış alanı karakterize etmek için kullanılabilir. Biyofilm etrafında akış alanı parçacık izleme velosimetri yazılımını kullanarak parçacık pozisyonların zaman serisi gözlemlerinden hesaplanabilir. Burada gösterilen sonuçlar Akımlar 2.02 yazılım paketi 16 (yazılım indir ve mevcut kullanıcı kılavuzu ile elde edilmiştir <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> % 0.2&#39;lik bir nihai katı konsantrasyonu ve 0.5 ml nihai hacme kadar steril su içinde floresan, mikro (çap yaklaşık 1 um) seyreltin. Vortex mikroboncukları emin olmak içiniyi dağılmıştır. </li><li> Enjekte ve adımlar 3,3-3,5 arası prosedürleri aşağıdaki akış hücre içine seyreltilmiş floresan mikroboncukları teslim. Parçacık yolunun doğru izleme, (bu yazıda parçacık izleme sonuçları için 0.01 ml / saat) nispeten düşük akış hızını kullanmak izin vermek için. </li><li> Bir z-dilim partikül hareketi izlemek ve zaman serisi görüntüleri çekmek için modu XYT için konfokal ayarları geçin. (1 Hz A kare hızı, bu yazıda gösterilen temsilcisi sonuçları için kullanılmıştır.) Tekrar parçacık enjeksiyon ve görüntü farklı z yerlerde 3-D akış alanını oluşturmak için. </li><li> Ön işlem zaman serisi (mevcut yazılım indirme ve kılavuzu ImageJ kullanarak arka plan floresan sinyali (görüntü kümesinin ilk kazanılmış görüntüde sinyali) çıkarılarak konfokal görüntüleri <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) veya diğer programlar. </li><li> ImageJ, bir görüntü kümesinin ilk görüntüyü açmak ve ardından görüntü seti ithal. Süreci altında / Görüntü Calculator, görüntü kümesinden ilk görüntüyü çıkarma. Önceden işlenmiş görüntü kümesi kaydedin. </li><li> Akarsu 2.02 akış vektörleri, ithalat zaman serisi konfokal görüntüleri hesaplamak için. &quot;Açık süreç görüntüsü&quot; altında seçin ve &quot;parçacıkları tanımlamak&quot; yürütmek. Parçacıkları tanımlamak üzere uygun eşik kullanın. 1 um parçacıkları için minimum ve maksimum çapı eşik olarak 0.5 ile 5 um kullanın. </li><li> Ardından &quot;Aç süreç görünümü&quot; altında, seçmek ve parçacık yolları üretmek için &quot;PTV analiz boru hattı&quot; yürütmek. Onlar parçacık hareketi temsil görmek için parçacık yolları kontrol edin. Son olarak, seçmek ve bir akış vektör haritası oluşturmak için &quot;hız alanını oluşturma&quot; yürütmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li><li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease.">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms.">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+A+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li><li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure.">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).</li><li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear:+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology.">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li><li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk/biofilm+interface.">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Convection+around+biofilms.">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorption+sites+in+biofilms.">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms.">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li><li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers.">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li><li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells.">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel.">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms.">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li><li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm.">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li><li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs.">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport.">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li><li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge.">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions.">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin.">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li><li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection.">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biyofilm kimyasal geçişlerini yanıt, çevredeki akış mikroçevre üzerinde biyofilm büyüme ve iç ulaşım sınırlamaları kaynaklanan biyofilm heterojenite etkileri: Biz üç önemli biyofilm-çevre etkileşimlerini karakterize etmek yöntemler paketi gösterdi. İlk biyofilm gelişimi için iyi tanımlanmış kimyasal gradyanı empoze etmek için yeni bir mikro-akışkan akış hücresinin kullanmıştır. Akış hücresi içinde, bir iyi tanımlanmış kimyasal gradyanı üretmek ...

Bir hücre dışı-polimer matrisi 1 içine hücre agrega - İman yüzeyler ve form biyofilm eklemek. Biyofilm hücre metabolizmasında 2,3 iç çözünen taşıma sınırlamaları ve mekansal varyasyonların bir arada kaynaklanan dramatik mekansal heterojenlik çünkü Biyofilmler, çok farklı bireysel mikrobiyal hücrelerin davranır. Oksijen ve besin konsantrasyonları önemli ölçüde biyofilm ve sıvı ve daha biyofilm 2 içinde tükenen çevreleyen arasındaki arayüzde azalır. Biyofilm solunum ve protein sentezinde Mekansal varyasyonları da lokalize oksijen ve besin durumu 2 yanıt olarak oluşabilir. Sucul ve toprak ortamlarında, çoğu bakteri biyofilmlerde yaşamak. Doğal biyofilm karbon ve azot bisiklet ve metaller 4,5 azaltarak gibi önemli biyokimyasal süreçlerini yürütmek. Klinik, biyofilm oluşumu tepk olduğunuUzun süreli akciğer ve üriner enfeksiyonlar 6 ible. Biyofilmlererde hücreler planktonik muadillerine göre 6 antibiyotiklere son derece yüksek direnç var çünkü biyofilm ilişkili enfeksiyonlar oldukça sorunludur. Biyofilm farklı ortamlarda önemli olduğundan, araştırma önemli bir miktarda biyofilm faaliyetleri ve biyofilm mekansal heterojenlik ve çevredeki mikroortam kontrol çevresel faktörleri anlamaya odaklanmıştır. Önceki çalışmalar, biyofilm geliştirme; çevresel bir dizi faktöre göre düzenlenir olduğunu bulduk: biyofilm çeşitli akış koşullarında farklı morfolojiler geliştirilmesi; oksijen ve besin kullanılabilirliği etkisi biyofilm morfolojisi; ve hidrodinamik kayma gerilmesi yüzeylere planktonik hücreler eki ve biyofilm 7-9 hücrelerinin ayrılmasını etkiler. Ayrıca, dış akış durumu yüzeyler int teslim etkilero ve biyofilm 10 içinde. biyofilm büyüme de fiziksel ve kimyasal koşulları çevredeki değiştirir. Örneğin, biyofilm büyüme oksijen ve besin 2 yerel tükenmesine yol açar; biyofilm çevresini 11 inorganik ve organik bileşikler birikir; ve biyofilm kümeleri akış ve artış yüzey sürtünmesi 12,13 yönlendirir. Biyofilm onların çok karmaşık yollarla çevreyi saran etkileşim nedeniyle, aynı anda biyofilm özellikleri ve çevre koşulları hakkında bilgi edinmek için kritik ve çok disiplinli yaklaşımlar kapsamlı biyofilm-çevre etkileşimlerini karakterize etmek için kullanılması gerekmektedir. Burada bir uygulanan besin derecesinde mono- türler ve ikili türler biyofilm içindeki mikrobik büyüme uzamsal desen karakterize etmek ve yerel kimyasal ve sıvı mikro-elde edilen modifikasyon gözlemlemek için entegre yöntem bir dizi sunulmuştur. Biz köknarst iyi tanımlanmış kimyasal geçişlerini altında biyofilm büyüme gözlemlemek için bir süre önce geliştirilen çift giriş mikroakışkan akış hücresinin kullanımını tarif. Daha sonra beslenme koşulları kümesi altında biyofilm bakteri, Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia coli, iki türün gelişimini izlemek için bu mikro-akışkan akış hücresinin kullanımını göstermektedir. Biz biyofilm koloniler halinde floresan izleyici yayılma yerinde görselleştirme nicel Biyofilmlererde çözünen ulaşım modellerini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Son olarak, biz konfokal mikroskobu altında yapılan mikro parçacık izleme velosimetri, büyüyen biyofilm etrafında yerel akış alanını elde etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">Miniplus 3</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">F117934</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock</td>
			<td style="width:89px;">Smiths Medical&#160;</td>
			<td style="width:104px;">MX9311L</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td>
			<td style="width:89px;">ML Solar LLC</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td>16157-191</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">C-FLEX Tubing</td>
			<td style="width:89px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:104px;">06422-02</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">1 mL TB Syringe</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309659</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Polymer Tubing</td>
			<td style="width:89px;">IDEX</td>
			<td style="width:104px;">1520G</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td>
			<td style="width:89px;">Clay Adams</td>
			<td style="width:104px;">427564</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">305195</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:89px;">HACH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Syringe filters- sterile (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:89px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:104px;">09-719A</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">MAXQ Shaker</td>
			<td style="width:89px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ammonium sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4418</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">RES20908-A7</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P5655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">S7653</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Magnisium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M8266</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C5670</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C3771</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">215422</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M7634</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">451657</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">Z0251</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium molybdate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">243655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Boric acid</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">B6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Dextrose</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D9434</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">L3022</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">TCS SP2 Confocal Microscopy</td>
			<td style="width:89px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">SYTO 62</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">S11344</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:227px;">Cy5</td>
			<td style="width:89px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">PA15100</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">F-8801</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">BioSPA</td>
			<td style="width:89px;">Packman Lab</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">ImageJ</td>
			<td style="width:89px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Volocity</td>
			<td style="width:89px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Streams 2.02</td>
			<td style="width:89px;">University of Cantebury</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

Biyofilmler kompleks yapılara sahip ve önemli mekansal farklılıklarını üreten yüzey bağlı mikrobiyal topluluklar vardır. Biyofilm geliştirme güçlü çevredeki akışı ve besin ortamında düzenlenir. Biyofilm büyüme de karmaşık akış alanları ve çözünen taşıma modellerini üreterek yerel mikroçevresinin heterojenliğini artırır. Biyofilm ve yerel mikro-yaşam arasındaki Biyofilmlererde ve etkileşim içinde heterojenite gelişimini araştırmak için, biz Pseudomonas aeruginosa mono-tür biyofilm ve P. çift türler biyofilm büyüdü mikroakışkan akış hücresi beslenme geçişlerini altında aeruginosa ve Escherichia coli. Bu akış hücresi içinde besin gradyanları oluşturmak için büyüyen ve bu koşullar altında biyofilm geliştirme görselleştirmek için ayrıntılı protokolleri sağlar. Biz aynı zamanda optik yöntemler bir dizi için mevcut protokoller distri akış, biyofilm yapısı mekansal desen ölçmek içinrı payı etrafında biyofilm ve kitle ulaşım üzerinde ve biyofilm koloniler içinde. Bu yöntemler biyofilm ve habitat heterojenite eş-geliştirme kapsamlı araştırmalar destekler.

çift ​​giriş mikro-akışkan akış hücresi akış bölme içinde iki çözeltinin karıştırılması ile oluşturulan bir iyi tanımlanmış kimyasal derecesinde biyofilm büyüme gözlenmesini sağlar. Elde edilen kimyasal degrade eski boya enjeksiyonu ile gözlenen ve Şarkı ark. 14 tarafından ayrıntılı olarak karakterize edildi. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, pürüzsüz değişim ölçüleri, enine yönde oluşturulmuştur. Konsantrasyon profili girişin yan?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity at JoVE.com

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K Görüntüleme.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

Video: Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To this end, our laboratory has applied the principles of nanomedicine to simplify ART regimens and as such reduce toxicities while improving compliance and drug pharmacokinetics. Simple and reliable methods for manufacturing nanoformulated ART (nanoART) are shown. Particles of pure drug are encapsulated by a thin layer of surfactant lipid coating and produced by fractionating larger drug crystals into smaller ones by either wet milling or high-pressure homogenization. In an alternative method free drug is suspended in a droplet of a polymer. Herein, drug is dissolved within a polymer then agitated by ultrasonication until individual nanosized droplets are formed. Dynamic light scattering and microscopic examination characterize the physical properties of the particles (particle size, charge and shape). Their biologic properties (cell uptake and retention, cytotoxicity and antiretroviral efficacy) are determined with human monocyte-derived macrophages (MDM). MDM are derived from human peripheral blood monocytes isolated from leukopacks using centrifugal elutriation for purification. Such blood-borne macrophages may be used as cellular transporters for nanoART distribution to human immunodeficiency virus (HIV) infected organs. We posit that the repackaging of clinically available antiretroviral medications into nanoparticles for HIV-1 treatments may improve compliance and positively affect disease outcomes.

Nanoparticles of indinavir, ritonavir, efavirenz and atazanavir were manufactured using wet milling, homogenization and ultrasonication. These nanoformulations, collectively termed nanoformulated antiretroviral therapy (nanoART), assessed macrophage-based drug delivery. Monocyte-derived macrophage nanoART uptake, retention and sustained release were determined. These preliminary studies suggest the potential of nanoART for clinical use.

Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Biyomühendislik

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Kurutma Hava-LC Arayüz üzerinde Megamolecular Biyopolimerlerin Kendinden entegrasyonu için Yöntemler

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Kapsamlı değerlendirme etkinliği ve güvenliği üç tamamlayıcı yöntemlerle plasenta hedefli ilaç dağıtım

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Biyolojik Dokuların Uyarılması için Elektrikli ve Manyetik Alan Cihazları

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...