نشكر مات Parsek في جامعة واشنطن (سياتل، WA) لتوفير P. الزنجارية وE. سلالات القولونية وروجر Nokes في جامعة كانتربري (نيوزيلندا) لتوفير الوصول إلى تيارات البرمجيات. وأيد هذا العمل من قبل R01AI081983 منحة من المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. تم إجراء التصوير متحد البؤر في مرفق نورث وسترن التصوير البيولوجية (BIF).

1. تدفق إعداد الخلية والتلقيح ملاحظة: استخدم خلية تدفق الموائع الدقيقة مزدوجة مدخل وصفها في كلمات وآخرون 2014 14 لزراعة الأغشية الحيوية. هذه الخلية تدفق قادرة على خلق التدرجات الكيميائية سلسة واضحة المعالم. يظهر تصميم خلية تدفق في الشكل (1) وتتدفق تصنيع خلية وصفت سابقا في كلمات وآخرون. 2014 14. وهنا التفاصيل طرقنا باستخدام P. الزنجارية وE. القولونية لتشكيل الأغشية الحيوية، ولكن قد تكون الأنواع الأخرى مناسب جدا. كنا P. الزنجارية PAO1- GFP، والذي يعبر بشكل جوهري بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، وكائن نموذج للتنمية بيوفيلم. بالإضافة إلى ذلك، كنا E. القولونية DH5α لتشكيل الأغشية الحيوية مختلط الأنواع مع P. الزنجارية. P. الزنجارية وE. كانت تزرع سلالات القولونية على لوحات أجار LB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلية تدفق باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) منضما إلىساترة الزجاج عن طريق الأكسجين العلاج البلازما كما هو موضح في 14. أبعاد الغرفة خلية تدفق هي 23 ملم × 13 ملم × 0.24 ملم (طول × عرض × عمق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعديل FAB النمو المتوسطة 15. لمراقبة نمو بيوفيلم تحت التدرج الغذائية داخل الخلية التدفق، وإدخال تعديل FAB المتوسطة 15 مع الجلوكوز 0.6 ميكرومتر في مدخل واحد وإدخال FAB وسيط وبدون أي مصدر الكربون من خلال مدخل الآخرين. فلتر تعقيم (حجم المسام = 0.2 ميكرون) محلول المخزون الجلوكوز (60 ملم) قبل إضافتها إلى وسيلة FAB. الأوتوكلاف أيضا وسيلة FAB مع دورة 1 (السائل، 15 دقيقة، 121 ° C، 17 رطل) قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم نظام التدفق. قبل التلقيح، الأوتوكلاف المسار بالكامل التدفق (زجاجات المتوسطة، وأنابيب، والفخاخ فقاعة، تدفق الخلايا) باستخدام دورة 1، باستثناء البلاستيكية الصمامات الثلاثية (يمكن التخلص منها وتعقيمها قبل) الواقعة المنبع من الخلية التدفق. (تستخدم صمامات ثلاث طرق لحقن الخلايا جulture، التتبع الفلورسنت وميكروبيدات.) لتجنب التلوث أثناء التجمع، وتغطي جميع فتحات أنابيب وموصل مع رقائق الألومنيوم أو أكياس التعقيم الأوتوكلاف قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط نظام التدفق. تجميع مكونات نظام خلية تدفق بعناية (انظر الفيديو لتجميع نظام تدفق) وتحقيق نمو متوسط ​​إلى الخلية التدفق عبر مضخة تحوي التي تتحكم بدقة معدل التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد زراعة الخلايا لالتلقيح عن طريق نقل مستعمرة P. الزنجارية أو E. القولونية من لوحات LB إلى 3 مل من مرق LB ويهز ثقافة O / N في 225 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. تمييع O / مزارع الخلايا N في 1 مل تعقيم المياه إلى OD النهائي 600 = 0.01 كما قيحة. (الثقافة وتمييع البكتيريا في غطاء تدفق الصفحي لتجنب التلوث.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب مع الأغشية الحيوية مختلط الأنواع، وتمييع الثقافتين البكتيرية إلى نسبة 1: 1 في 1 مل مع OD يعادل 600 = 0.01 لكل البكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم الخلية التدفق. حقن 1 مل من اللقاح إلى مدخل الخلية التدفق من ثلاثي صمام. بعد الحقن، وقفة تدفق لمدة 1 ساعة للسماح للخلايا البكتيرية لنعلق على غطاء زجاجي. (تأكد من أن يتم وضع خلية تدفق مع الجانب ساترة لأسفل للسماح للخلايا مع وقف التنفيذ ليستقر على ساترة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، واستئناف تدفق وضخ المتوسطة النمو إلى الخلية تدفق بمعدل ثابت قدره 0.03 مل / دقيقة لكل مدخل لمدة 3 أيام. </li></ol> 2. تميز بيوفيلم التنمية في الرد على المغذيات التدرجات عن طريق متحد البؤر المجهر ملاحظة: P. الزنجارية يمكن تصويرها مع GFP أعرب جوهري، ولكن E. القولونية في الأغشية الحيوية مختلط الأنواع يجب تصويرها من قبل counterstaining. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الأغشية الحيوية لمدة 3 أيام باستخدام متحد البؤر المجهري. لنتائج ممثلة، ومراقبة الأغشية الحيوية باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف 63X. قبل التصوير، علامةخلية تدفق مزدوج مدخل مع شبكة على الجانب غطاء زجاجي. (الغرض من هذه الشبكة هو السماح للالمجرب لتحديد المناطق التصوير داخل غرفة خلية تدفق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمباين، وتمييع 10 ميكرولتر من خلايا نفيذ الحمراء الفلورسنت وصمة عار الحمض النووي، مثل الأخضر الفلورسنت وصمة عار الحمض النووي مثل STYO 62، حل سهم (1 ملم) في 990 ميكرولتر تعقيم الماء ثم حقن ببطء وصمة عار المخفف باستخدام حقنة في غرفة خلية تدفق من صمام المنبع ثلاثي. الحفاظ على خلية تدفق راكدة وفي الظلام لمدة 30 دقيقة، ثم استئناف تدفق لتغسل وصمة عار غير منضم لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التصوير متحد البؤر. تفعيل 488 نانومتر الأرجون ليزر لالإثارة وانبعاث جمع قنوات GFP (500-535 نانومتر) وصمة عار النووية حامض (لالخضراء الفلورسنت وصمة عار الحمض النووي، 650-750 نانومتر). ضبط المكاسب والتعويضات لكل من القنوات لديك صورا مشرقة ونظيفة. حدد XYZ وطريقة التصوير في وقت واحد. استخدام مقبض التحكم ض لايدنمنظمة حددت السفلي والعلوي من بيوفيلم في هذا المجال. ضبط خطوة ض إلى 0.5 ميكرون للحصول على 3-D صورة المكدس. (لضمان جودة الصورة العالية، واستخدام المتوسط ​​خط من أربعة لاقتناء الصورة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعيين الأنماط المكانية للتنمية بيوفيلم داخل الخلية التدفق، والأغشية الحيوية في صورة ثلاثة أو أكثر طولية (خ) المسافات على طول مدخل الخلية التدفق، وعلى ثلاثة عرضية (ذ) الأوضاع النسبية لالتدرج الغذائية المفروضة، كما هو مبين في الشكل (1) . </li></ol> 3. تميز المذاب الداخلية النقل عن طريق الحقن من المحافظين نيون الراسم ملاحظة: التتبع الفلورسنت المحافظ، مثل Cy5، ويمكن استخدامها لتوصيف أنماط النقل المذاب داخل بيوفيلم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل Cy5 (مونو-رد الفعل NHS استر) في الماء لتركيز النهائي من 10 ملغ / مل كحل الأسهم. تخزين محلول المخزون Cy5 في الثلاجة -20 درجة مئوية. ملاحظة: كما Cy5 هو خفيف sensitإيف، وتخزين، وتمييع حقن حلول Cy5 في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل حقن التتبع الفلورسنت، تأخذ 3-D صورة كومة من بيوفيلم 3 أيام مع المجهر متحد البؤر (مع الهدف 63X). (مناطق واسعة من المستعمرات بيوفيلم مثالية لملاحظات السلاسل الزمنية النقل صباغة.) أيضا اختيار لض الطائرة مع المستعمرات فصل جيدا للتصوير (كما هو موضح في الشكل 5A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تجربة حقن Cy5، وتمييع 2 ميكرولتر من محلول المخزون Cy5 في 998 ميكرولتر تعقيم المياه لتسفر عن حل حقن وجود تركيز Cy5 من 20 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف ضخ لإيقاف تدفق وحقن الحل Cy5 في المنبع من خلية تدفق باستخدام حقنة عن طريق 3 في اتجاه وصمام. (من المهم منع فقاعات الهواء من الدخول إلى مسار تدفق في حين حقن. يجب أن تبقى الفخاخ فقاعة مفتوحة خلال الحقن في الظهر.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن محلول Cy5، أغلق الفخاخ فقاعة، وضبط 3 في اتجاه وصمام، وإعادة تشغيلضخ لإيصال الحل Cy5 حقنها في الخلية التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل طريقة التصوير متحد البؤر لXYT. تفعيل Cy5 وGFP قنوات تحت وضع التصوير في وقت واحد. ضبط إعدادات مبائر على كثافة Cy5 (كثافة الليزر، وكسب وتعويض) لتجنب تشبع الإشارات، وهو أمر حاسم بالنسبة الكمي. (ويفضل القرار الزماني عالية لتصور تغلغل الصبغة. ومع ذلك، مسح سريع يقلل جودة الصورة.) اختر سرعة المسح الضوئي المناسبة والمتوسط ​​خط لتحقيق التوازن القرار وقت التصوير وجودة الصورة. لهذا البروتوكول استخدام المتوسط ​​خط من أربعة ومعدل الإطار من 0.15 هرتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئناف تدفق لتقديم Cy5 في الخلية التدفق (لا يزال بمعدل تدفق 0.03 مل / دقيقة). في وقت واحد وقت بدء سلسلة متحد البؤر التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد Cy5 الاختراق عن طريق حساب متوسط ​​كثافة Cy5 شعاعيا داخل بيوفيلم دائرية 2-D مستعمرة. في المتوسط، أولا التعرف على حافة مجموعة بيوفيلم، ثم إنشاء مخطط المسافة لقسم 2-D من الكتلة، وأخيرا متوسط ​​أنماط شعاعي من شدة Cy5 لتوليد منحنى الاختراق (انظر الشكل 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق حسابيا خطوة 3.8، استخدم BioSPA (بيوفيلم المكانية تحليل نمط) حزمة برامج (غير منشورة، مجموعة من البرامج ودليل متوفرة عند الطلب) أو غيرها من برامج تحليل الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخدام BioSPA، استيراد أول صورة مجموعة الى BioSPA. ثم حدد عتبة المناسبة لGFP وقنوات Cy5 لجعل الصور ثنائية. في القائمة تحليل / الحساب، حدد تحليل متقدمة ومن ثم تحليل الانتشار. استخدام قناة GFP لتحديد حافة العنقودية واستخدام أداة المضلع لتحديد مجموعة واحدة، مؤكدا أن المنطقة ذات الاهتمام (ROI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر نقرا مزدوجا فوق الكتلة بيوفيلم المختارة لإجراء تحليل نشرها. حفظ نتائج التحليل نشر ومعايرة شدة Cy5 إلى تركيز Cy5 باستخدام منحنى المعايرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد Cy5 منحنى تركيز معايرة وقياس شدة Cy5 على مدى بغية دراسته واقراره Cy5التدرج ntration تحت المجهر متحد البؤر. (كثافة Cy5 والتركيز لديها علاقة خطية). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. يميز مجال تدفق المحيطة التي تتبع نيون الجسيمات ملاحظة: جزيئات الفلورسنت، مثل ميكروبيدات الفلورسنت، ويمكن استخدامها لتوصيف مجال تدفق حول الأغشية الحيوية. ويمكن حساب مجال تدفق حول الأغشية الحيوية من الملاحظات الوقت سلسلة من المواقف الجسيمات باستخدام برنامج تتبع الجسيمات velocimetry. تم الحصول على النتائج المعروضة هنا مع تيارات 2.02 حزمة برامج 16 (تنزيل البرمجيات ودليل المستخدم متاحة في <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع ميكروبيدات الفلورسنت (قطر ~ 1 ميكرون) في الماء المعقم إلى تركيز قوي النهائي من 0.2٪ والحجم النهائي من 0.5 مل. دوامة للتأكد من أن ميكروبيداتوفرقت أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن وتسليم ميكروبيدات الفلورية المخفف في خلية تدفق الإجراءات من الخطوات 3،3-3،5 التالية. للسماح لتتبع دقيق لمسار الجسيمات، واستخدام معدل منخفض نسبيا تدفق (0.01 مل / ساعة لتتبع النتائج الجسيمات في هذه الورقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل إعدادات مبائر لXYT وضع لتتبع حركة الجسيمات في واحدة ض شريحة ويستغرق وقتا طويلا سلسلة الصور. (تم استخدام معدل الإطار من 1 هرتز لنتائج ممثل هو مبين في هذه الورقة.) حقن كرر الجسيمات وصورة في أماكن مختلفة لتوليد ض 3-D مجال تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما قبل العملية السلاسل الزمنية صور مبائر بطرح إشارة مضان الخلفية (إشارة في الصورة المكتسبة الأولى من مجموعة صورة) باستخدام يماغيج (تحميل البرمجيات ودليل متوفرة على <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) أو غيرها من البرامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يماغيج، فتح الصورة الأولى من مجموعة الصورة ثم استيراد مجموعة الصورة. تحت عملية / صورة كاليفورنياlculator، طرح أول صورة من مجموعة الصور. حفظ معالجتها قبل مجموعة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب نواقل التدفق، استيراد السلاسل الزمنية صور مبائر في تيارات 2.02. تحت عنوان &quot;عرض عملية مفتوحة&quot;، اختيار وتنفيذ &quot;تحديد الجزيئات&quot;. استخدام عتبة المناسبة لتحديد الجزيئات. استخدام 0.5 و 5 ميكرون كحد أدنى وأقصى قطر عتبات 1 ميكرون الجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تحت &quot;وجهة نظر عملية مفتوحة&quot;، اختيار وتنفيذ &quot;خط أنابيب تحليل PTV&quot; لتوليد مسارات الجسيمات. تحقق مسارات الجسيمات لمعرفة ما إذا كانت تمثل حركة الجسيمات. وأخيرا، اختيار وتنفيذ &quot;إنشاء حقل سرعة&quot; لإنشاء مخطط ناقلات التدفق. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li><li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease.">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms.">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+A+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li><li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure.">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).</li><li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear:+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology.">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li><li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk/biofilm+interface.">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Convection+around+biofilms.">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorption+sites+in+biofilms.">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms.">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li><li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers.">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li><li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells.">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel.">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms.">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li><li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm.">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li><li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs.">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport.">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li><li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge.">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions.">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin.">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li><li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection.">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

أثبتنا مجموعة من الطرق لتوصيف الثلاثة المهمة التفاعلات بيوفيلم للبيئة: استجابة بيوفيلم إلى التدرجات الكيميائية، وآثار نمو بيوفيلم على المكروية تدفق المحيطة بها، وعدم التجانس بيوفيلم الناجمة عن القيود النقل الداخلي. أظهرنا لأو...

الكائنات الحية الدقيقة نعلق على الأسطح والأغشية الحيوية شكل - المجاميع الخلية المغلقة في مصفوفة خارج الخلية البوليمر 1. الأغشية الحيوية تتصرف بشكل مختلف جدا من الخلايا الميكروبية الفردية، لأن الأغشية الحيوية لها التنوع المكاني الدرامي الناتجة عن مزيج من القيود النقل المذاب الداخلية والاختلافات المكانية في الأيض الخلوي 2،3. تركيزات الأكسجين والمواد الغذائية انخفاضا كبيرا في واجهة بين بيوفيلم والمحيطة السائل والحصول على مزيد من ضمن المنضب في بيوفيلم 2. يمكن أن تحدث أيضا تغيرات المكانية في التنفس بيوفيلم وتخليق البروتين كرد فعل على الأكسجين المحلية وتوافر المواد الغذائية 2. في البيئات المائية والتربة، ومعظم البكتيريا يسكن في الأغشية الحيوية. الأغشية الحيوية الطبيعية تنفذ العمليات البيولوجية الكيميائية الهامة بما في ذلك ركوب الدراجات الكربون والنيتروجين والحد من المعادن 4،5. سريريا، وتشكيل بيوفيلم هو رد والمرئي لفترة طويلة الرئوية والتهابات المسالك البولية 6. العدوى المرتبطة بيوفيلم هي مشكلة كبيرة لأن الخلايا في الأغشية الحيوية لها مقاومة عالية للغاية لمضادات الميكروبات مقارنة مع نظرائهم العوالق 6. لأن الأغشية الحيوية مهمة في إعدادات متنوعة، وقد تركز قدر كبير من البحوث على فهم العوامل البيئية التي تتحكم في أنشطة بيوفيلم وعدم التجانس المكاني في الأغشية الحيوية والمكروية المحيطة بها. وقد وجدت دراسات سابقة أن التنمية بيوفيلم وينظم بقوة من قبل عدد من العوامل البيئية: الأغشية الحيوية تتطور الأشكال التضاريسية مختلفة تحت ظروف تدفق مختلف. الأكسجين والمغذيات توافر تأثير التشكل بيوفيلم. وإجهاد القص الهيدروديناميكية يؤثر المرفق من خلايا العوالق على الأسطح ومفرزة من الخلايا من الأغشية الحيوية 7-9. وعلاوة على ذلك، حالة التدفق الخارجي يؤثر على تسليم ركائز كثافة العملياتس وداخل الأغشية الحيوية 10. نمو الأغشية الحيوية يغير أيضا الظروف المحيطة الفيزيائية والكيميائية. على سبيل المثال، يؤدي نمو بيوفيلم في استنفاد المحلي من الأوكسجين والمواد المغذية 2. الأغشية الحيوية تتراكم المركبات العضوية وغير العضوية من البيئة المحيطة 11؛ ومجموعات بيوفيلم تحويل تدفق وزيادة سطح الاحتكاك 12،13. لأن الأغشية الحيوية تتفاعل مع بيئتها المحيطة بطرق معقدة جدا، فمن الأهمية بمكان الحصول على المعلومات في وقت واحد على خصائص بيوفيلم والظروف البيئية، ونهج متعدد التخصصات في حاجة لاستخدامها لتوصيف شامل التفاعلات بيوفيلم للبيئة. هنا نقدم سلسلة من أساليب متكاملة لتوصيف الأنماط المكانية في النمو الميكروبي داخل الأنواع أحادية والأغشية الحيوية ثنائي الأنواع تحت التدرج الغذائية المفروضة، ومراقبة التعديل الناتجة من هذه المادة الكيميائية المحلية والمكروية السوائل. نحن التنوبالحادي ووصف استخدام خلية تدفق ميكروفلويديك مزدوجة مدخل وضعت مؤخرا لمراقبة نمو بيوفيلم تحت التدرجات الكيميائية واضحة المعالم. نحن ثم شرح استخدام هذه الخلية تدفق الموائع الدقيقة لمراقبة نمو نوعين من البكتيريا، الزائفة الزنجارية والقولونية، في الأغشية الحيوية في ظل مجموعة من الظروف الغذائية. وتبين لنا كيف التصور الموقع من نشر التتبع الفلورسنت في المستعمرات بيوفيلم في يمكن استخدامها لتقييم كمي لأنماط النقل المذاب في الأغشية الحيوية. وأخيرا، وتبين لنا كيف الميكروسكيل velocimetry تتبع الجسيمات، وتتم تحت المجهر متحد البؤر، ويمكن استخدامها للحصول على مجال تدفق المحلي حول الأغشية الحيوية المتنامية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">Miniplus 3</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">F117934</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock</td>
			<td style="width:89px;">Smiths Medical&#160;</td>
			<td style="width:104px;">MX9311L</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td>
			<td style="width:89px;">ML Solar LLC</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td>16157-191</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">C-FLEX Tubing</td>
			<td style="width:89px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:104px;">06422-02</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">1 mL TB Syringe</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309659</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Polymer Tubing</td>
			<td style="width:89px;">IDEX</td>
			<td style="width:104px;">1520G</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td>
			<td style="width:89px;">Clay Adams</td>
			<td style="width:104px;">427564</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">305195</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:89px;">HACH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Syringe filters- sterile (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:89px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:104px;">09-719A</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">MAXQ Shaker</td>
			<td style="width:89px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ammonium sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4418</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">RES20908-A7</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P5655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">S7653</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Magnisium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M8266</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C5670</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C3771</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">215422</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M7634</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">451657</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">Z0251</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium molybdate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">243655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Boric acid</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">B6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Dextrose</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D9434</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">L3022</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">TCS SP2 Confocal Microscopy</td>
			<td style="width:89px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">SYTO 62</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">S11344</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:227px;">Cy5</td>
			<td style="width:89px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">PA15100</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">F-8801</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">BioSPA</td>
			<td style="width:89px;">Packman Lab</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">ImageJ</td>
			<td style="width:89px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Volocity</td>
			<td style="width:89px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Streams 2.02</td>
			<td style="width:89px;">University of Cantebury</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

الأغشية الحيوية هي المجتمعات الميكروبية المرفقة السطحية التي لديها هياكل معقدة وإنتاج التغاير المكانية كبيرة. وينظم تطوير بيوفيلم بقوة تدفق المحيطة والبيئة الغذائية. يزيد نمو بيوفيلم أيضا عدم تجانس المكروية المحلية عن طريق توليد حقول تدفق المعقدة وأنماط النقل المذاب. للتحقيق في وضع من عدم التجانس في الأغشية الحيوية والتفاعلات بين الأغشية الحيوية والخاصة المحلية الصغيرة الموائل، ونحن نمت الأغشية الحيوية أحادية أنواع الزائفة الزنجارية والأغشية الحيوية ثنائي الأنواع من P. الزنجارية والقولونية تحت التدرجات الغذائية في خلية تدفق الموائع الدقيقة. ونحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لإنشاء التدرجات المواد الغذائية داخل الخلية وتدفق لزراعة وتصور تنمية بيوفيلم في ظل هذه الظروف. نحن أيضا بروتوكولات الحالية لسلسلة من وسائل بصرية لقياس الأنماط المكانية في هيكل بيوفيلم، وتدفق زعتهbutions على الأغشية الحيوية، والنقل الجماعي حول وداخل المستعمرات بيوفيلم. هذه الأساليب تدعم تحقيقات شاملة للشارك في تطوير بيوفيلم والسكن التجانس.

خلية تدفق الموائع الدقيقة مزدوجة مدخل تتيح مراقبة نمو بيوفيلم تحت التدرج كيميائية محددة جيدا التي شكلتها خلط حلين داخل غرفة التدفق. مما أدى التدرج الكيميائية لوحظ سابقا عن طريق الحقن صبغ وتتميز بالتفصيل كلمات وآخرون. 14. وتم تشكيل التدرجات تركيز الملساء في...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity at JoVE.com

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

طرق للتميز الرئيسين تطوير بيوفيلم والموئل التجانس

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Views.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

Video: Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To this end, our laboratory has applied the principles of nanomedicine to simplify ART regimens and as such reduce toxicities while improving compliance and drug pharmacokinetics. Simple and reliable methods for manufacturing nanoformulated ART (nanoART) are shown. Particles of pure drug are encapsulated by a thin layer of surfactant lipid coating and produced by fractionating larger drug crystals into smaller ones by either wet milling or high-pressure homogenization. In an alternative method free drug is suspended in a droplet of a polymer. Herein, drug is dissolved within a polymer then agitated by ultrasonication until individual nanosized droplets are formed. Dynamic light scattering and microscopic examination characterize the physical properties of the particles (particle size, charge and shape). Their biologic properties (cell uptake and retention, cytotoxicity and antiretroviral efficacy) are determined with human monocyte-derived macrophages (MDM). MDM are derived from human peripheral blood monocytes isolated from leukopacks using centrifugal elutriation for purification. Such blood-borne macrophages may be used as cellular transporters for nanoART distribution to human immunodeficiency virus (HIV) infected organs. We posit that the repackaging of clinically available antiretroviral medications into nanoparticles for HIV-1 treatments may improve compliance and positively affect disease outcomes.

Nanoparticles of indinavir, ritonavir, efavirenz and atazanavir were manufactured using wet milling, homogenization and ultrasonication. These nanoformulations, collectively termed nanoformulated antiretroviral therapy (nanoART), assessed macrophage-based drug delivery. Monocyte-derived macrophage nanoART uptake, retention and sustained release were determined. These preliminary studies suggest the potential of nanoART for clinical use.

أساليب التنمية للنقل الدم البلاعم التي تنقلها من العقاقير المضادة للفيروسات Nanoformulated

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

المبيضات البيض بيوفيلم رقاقة (كاليفورنيا BChip) لالفرز الفائق الإنتاجية مضاد للمخدرات

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

بروتوكول لتشكيل بيوفيلم الملون في جهاز ميكروفلويديك مع مايكرو الأركان

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

طرق لالتكامل الذاتي للMegamolecular البوليمرات الحيوية على تجفيف الهواء-LC واجهة

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

طريقتين ديسيلولاريزيشن أنسجة النباتية لتطبيقات هندسة الأنسجة

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

تقييم شامل لفعالية وسلامة إيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة باستخدام ثلاثة أساليب تكميلية

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

أجهزة المجال الكهربائي والمغناطيسي لتحفيز الأنسجة البيولوجية

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

صياغة وتميز الجسيمات النانوية الدهنية لتسليم الجينات باستخدام منصة خلط Microfluidic

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...