Ringraziamo Matt Parsek presso l&#39;Università di Washington (Seattle, WA) per la fornitura di P. aeruginosa e E. ceppi coli e Roger Nokes presso l&#39;Università di Canterbury (Nuova Zelanda) per fornire l&#39;accesso a software Streams. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione R01AI081983 dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive. Confocale è stata eseguita presso l&#39;impianto di Northwestern Imaging biologica (BIF).

Setup Cella 1. Flusso e inoculazione NOTA:. Utilizzare una cella di flusso microfluidica doppio ingresso descritto nel Canto et al, 2014 14 a crescere biofilm. Questa cella di flusso è in grado di creare gradienti chimici lisce ben definiti. Il disegno cella di flusso è mostrata in Figura 1 e flusso fabbricazione cella precedentemente descritto canzone et al. 2014 14. Qui dettaglio i nostri metodi utilizzando P. aeruginosa e E. coli per formare biofilm, ma altre specie può essere adatto anche. Abbiamo usato P. aeruginosa PAO1- GFP, che esprime costitutivamente una proteina verde fluorescente (GFP), come organismo modello per lo sviluppo di biofilm. Inoltre, abbiamo utilizzato E. coli DH5α per formare biofilm mixed-specie con P. aeruginosa. P. aeruginosa e E. ceppi coli sono state coltivate su piastre di agar LB. <ol><li> Preparare la cella di flusso utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) legato ad unacoprioggetto di vetro con trattamento al plasma di ossigeno, come descritto in 14. Le dimensioni della camera di cella di flusso sono di 23 mm x 13 millimetri × 0,24 millimetri (lunghezza x larghezza × profondità). </li><li> Preparare modificato FAB mezzo di crescita 15. Per osservare la crescita di biofilm sotto un gradiente nutrizionale all&#39;interno della cella di flusso, introducono modifiche FAB media 15 con 0,6 micron di glucosio in un ingresso e di introdurre FAB media senza alcuna fonte di carbonio attraverso l&#39;altro ingresso. Filtro-sterilizzare (dimensione dei pori = 0,2 micron) la soluzione di glucosio magazzino (60 mm) prima di aggiungerlo al mezzo FAB. Autoclave Anche il mezzo FAB con ciclo 1 (liquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) prima dell&#39;uso. </li><li> Sterilizzare il sistema di flusso. Prima dell&#39;inoculo, autoclave l&#39;intero percorso di flusso (bottiglie medie, tubi, trappole bolla, celle di flusso) utilizzando ciclo 1, eccetto per le valvole a tre vie (plastica monouso e pre-sterilizzati) a monte della cella di flusso. (Valvole a tre vie sono utilizzati per l&#39;iniezione delle cellule culture, tracciante fluorescente e microsfere.) Per evitare la contaminazione in fase di montaggio, coprire tutte le aperture e tubi di collegamento con un foglio di alluminio o sacchetti di autoclave prima autoclave. </li><li> Collegare il sistema di flusso. Assemblare i componenti del sistema di cella di flusso accuratamente (vedi video per il montaggio del sistema di flusso) e fornire terreno di coltura alla cella di flusso tramite una pompa peristaltica che controlla con precisione la portata. </li><li> Preparare coltura cellulare per l&#39;inoculazione trasferendo una colonia di P. aeruginosa o E. coli dalle piastre LB a 3 ml di brodo LB e scuotere la cultura O / N a 225 giri al minuto e 37 ° C. Diluire gli O / colture cellulari N in 1 ml di acqua sterile ad una OD finale 600 = 0,01 come inoculo. (Cultura e diluire i batteri in una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione.) </li><li> Per gli esperimenti con biofilm mista specie, diluire le due colture batteriche ad un rapporto di 1: 1 in 1 ml con un equivalente OD 600 = 0,01 per ogni batterio. </li><li> Seminare la cella di flusso. Iniettare 1 ml di inoculo all&#39;ingresso cella di flusso dalla valvola a tre vie. Dopo l&#39;iniezione, mettere in pausa il flusso per 1 ora per consentire cellule batteriche di allegare al vetro di copertura. (Assicurarsi che la cella di flusso è posizionato con il lato coprioggetto basso per consentire alle cellule in sospensione di depositarsi sul vetrino.) </li><li> Dopo 1 ora, riprendere il flusso e pompare il mezzo di crescita alla cella di flusso ad una velocità costante di 0,03 ml / min per ciascun ingresso per 3 giorni. </li></ol> 2. Characterizing biofilm sviluppo in risposta a nutrienti sfumature Utilizzo Microscopia confocale NOTA: P. aeruginosa può essere ripreso con costitutivamente-espressa GFP, ma E. coli in biofilm misti specie deve essere ripreso dalla controcolorazione. <ol><li> Osservare le biofilm 3 giorni usando la microscopia confocale. Per i risultati rappresentativi, osservare biofilm utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 63X. Prima di imaging, markla cella doppio ingresso a flusso con una griglia sul lato vetro di copertura. (Lo scopo di questa griglia è di consentire lo sperimentatore per individuare le regioni di imaging nella camera cella di flusso.) </li><li> Per colorazione di contrasto, diluire 10 ml di rosso fluorescente macchia cellule permeante acidi nucleici, come l&#39;acido macchia verde fluorescente nucleico come STYO 62, soluzione madre (1 mm) in 990 ml di acqua sterilizzata e poi lentamente iniettare la macchia diluito con una siringa in la camera di cella di flusso dalla valvola a tre vie monte. Mantenere la cella di flusso stagnante e al buio per 30 minuti, quindi riprendere il flusso di lavare la macchia non legato per 15 min. </li><li> Eseguire confocale. Attivare la 488 nm Argon laser per l&#39;eccitazione e l&#39;emissione di raccolta canali per GFP (500-535 nm) e macchia acidi nucleici (per lampade fluorescenti colorazione verde acido nucleico, 650-750 nm). Regolare guadagni e offset per entrambi i canali per avere immagini brillanti e pulite. Selezionare xyz e modalità di imaging simultaneo. Utilizzare la manopola di z-controllo per idenduare parte inferiore e superiore del biofilm nel campo. Impostare la z-passo a 0,5 micron per l&#39;acquisizione di una serie di immagini 3-D. (Per garantire immagini di alta qualità, utilizzare una media linea di quattro per l&#39;acquisizione di immagini.) </li><li> Per mappare i modelli spaziali di sviluppo biofilm all&#39;interno della cella di flusso, biofilm immagine a tre o più longitudinale (x) distanze lungo l&#39;ingresso della cella di flusso, e alle tre trasversale (y) posizioni relative al gradiente nutrizionale imposto, come mostrato in Figura 1 . </li></ol> 3. Characterizing Soluto interno Trasporto Iniezioni di conservatore fluorescente Tracer NOTA: Un tracciante fluorescente conservatore, come Cy5, può essere utilizzato per caratterizzare modelli di trasporto dei soluti all&#39;interno del biofilm. <ol><li> Sciogliere Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) in acqua ad una concentrazione finale di 10 mg / ml come soluzione madre. Conservare la soluzione di riserva Cy5 in un -20 ° C freezer. NOTA: Come Cy5 è chiaro Sensitive, magazzini, diluite e iniettare soluzioni Cy5 nel buio. </li><li> Prima delle iniezioni del tracciante fluorescente, prendere una serie di immagini 3-D del biofilm di 3 giorni con la microscopia confocale (con un obiettivo 63X). (Regioni larghe delle colonie biofilm sono ideali per serie temporali osservazioni di trasporto colorante.) Anche scegliere un piano z con colonie ben separati per l&#39;imaging (come mostrato in Figura 5A). </li><li> Per ogni esperimento iniezione Cy5, diluire 2 ml di soluzione madre Cy5 in 998 microlitri di acqua sterilizzata per fornire una soluzione di iniezione avente una concentrazione Cy5 di 20 ug / ml. </li><li> Arrestare la pompa per interrompere il flusso e iniettare la soluzione Cy5 nel monte della cella di flusso utilizzando una siringa attraverso la valvola a 3 vie. (E &#39;importante per evitare bolle d&#39;aria di entrare nel percorso di flusso durante l&#39;iniezione. Bubble trappole devono essere tenuti aperti durante l&#39;iniezione posteriore.) </li><li> Dopo aver iniettato il soluzione Cy5, chiudere le trappole bolla, regolare la valvola a 3 vie, e riavviare ilpompa per fornire la soluzione Cy5 iniettato nella cella di flusso. </li><li> Passa alla modalità di imaging confocale a XYT. Attivare Cy5 e GFP canali sotto la modalità di imaging simultaneo. Regolare le impostazioni confocale su intensità Cy5 (intensità del laser, di guadagno e offset) per evitare segnali, che è fondamentale per la quantificazione saturazione. (Alta risoluzione temporale è preferito per la visualizzazione penetrazione del colorante. Tuttavia, la scansione veloce diminuisce la qualità dell&#39;immagine.) Scegliere la corretta velocità di scansione e media linea per bilanciare la risoluzione temporale dell&#39;imaging e la qualità dell&#39;immagine. Per questo protocollo utilizzare una media linea di quattro e un frame rate di 0,15 Hz. </li><li> Riprendere il flusso di consegnare Cy5 nella cella di flusso (ancora ad una portata di 0,03 ml / min). Contemporaneamente avviare serie temporali confocale. </li><li> Quantificare penetrazione Cy5 da radialmente media intensità Cy5 all&#39;interno di un 2-D biofilm colonia circolare. Per media, prima identificare il bordo di un cluster biofilm, quindi generare una mappa di distanza per una sezione 2-D del cluster, E infine modelli medi radiali di intensità Cy5 per generare una curva di penetrazione (vedere Figura 6). <ol><li> Per computazionalmente realizzare passo 3.8, utilizzare BioSPA (biofilm Spatial Pattern Analysis) pacchetto software (inedito, software e manuale disponibile su richiesta) o di altri programmi di analisi delle immagini. </li><li> Per utilizzare BioSPA, prima importare un&#39;immagine impostata in BioSPA. Quindi selezionare soglia adeguata per i canali GFP e Cy5 per rendere le immagini binarie. Nel menu di analisi / calcolo, selezionare Advanced Analysis e quindi Analysis diffusione. Utilizzare il canale GFP per definire il bordo di un cluster e utilizzare lo strumento poligono per selezionare un cluster come la regione di interesse (ROI). </li><li> Fare doppio clic sul gruppo biofilm selezionato per eseguire l&#39;analisi di diffusione. Salvare i risultati delle analisi di diffusione e calibrare l&#39;intensità Cy5 alla concentrazione Cy5 utilizzando una curva di calibrazione. <ol><li> Per generare Cy5 curva di calibrazione concentrazione, misurare intensità Cy5 su una conce Cy5gradiente ntration al microscopio confocale. (Intensità Cy5 e concentrazione hanno una relazione lineare.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Caratterizzare il campo di moto circostante tracciando particelle fluorescenti NOTA: particelle fluorescenti, quali microsfere fluorescenti, può essere usato per caratterizzare il campo di flusso intorno biofilm. Campo di moto intorno biofilm può essere calcolata dalle osservazioni di serie temporali di posizioni delle particelle che utilizzano software di monitoraggio di particelle velocimetria. I risultati qui riportati sono stati ottenuti con il software Streams 2.02 pacchetto 16 (download del software e la guida a disposizione dell&#39;utente in <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> Diluire le microsfere fluorescenti (diametro ~ 1 micron) in acqua sterile ad una concentrazione solida finale di 0,2% e un volume finale di 0,5 ml. Vortex per assicurarsi che le microsferesono ben dispersi. </li><li> Iniettare e fornire i microsfere fluorescenti diluito nella cella di flusso in base a procedure da passaggi 3,3-3,5. Per consentire un monitoraggio accurato del percorso particella, utilizzare un tasso relativamente basso flusso (0,01 ml / h per i risultati di monitoraggio di particelle in questo documento). </li><li> Passare impostazioni confocale modalità di XYT per tracciare il movimento delle particelle in un z-slice e prendere le immagini serie temporali. (Una frequenza di 1 Hz è stato utilizzato per i risultati rappresentativi riportati in questo articolo.) Iniezione di ripetizione di particelle e di immagini in diverse posizioni z di generare flusso di campo 3-D. </li><li> Pre-processo time-series immagini confocale sottraendo il segnale di fluorescenza di fondo (il segnale nella prima immagine acquisita del set di immagini) utilizzando ImageJ (download del software e manuale disponibile su <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) o altri programmi. </li><li> In ImageJ, aprire la prima immagine di un set di immagini e quindi importare il set di immagini. Sotto processo / Immagine Calculator, sottrarre la prima immagine dal set di immagini. Salvare il set di immagini pre-trattati. </li><li> Per calcolare i vettori di flusso, import time-series immagini confocale in Streams 2.02. In &quot;vista del processo Apri&quot;, selezionare ed eseguire &quot;Identificare le particelle&quot;. Utilizzare soglia adeguata di identificare particelle. Utilizzare 0,5 e 5 micron come soglie di diametro minimo e massimo per 1 micron particelle. </li><li> Poi sotto &quot;view processo Open&quot;, selezionare ed eseguire &quot;PTV analisi condotta&quot; per generare percorsi di particelle. Controllare i percorsi di particelle per vedere se essi rappresentano il movimento delle particelle. Infine, selezionare ed eseguire &quot;Crea campo di velocità&quot; per generare una mappa di flusso vettoriale. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li><li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease.">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms.">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+A+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li><li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure.">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).</li><li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear:+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology.">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li><li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk/biofilm+interface.">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Convection+around+biofilms.">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorption+sites+in+biofilms.">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms.">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li><li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers.">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li><li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells.">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel.">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms.">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li><li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm.">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li><li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs.">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport.">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li><li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge.">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions.">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin.">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li><li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection.">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Abbiamo dimostrato una serie di metodi per la caratterizzazione di tre importanti interazioni biofilm-ambiente: risposta biofilm a gradienti chimici, gli effetti della crescita biofilm sul flusso microambiente circostante, e eterogeneità biofilm derivanti da limitazioni di trasporto interno. Per prima mostrato l&#39;uso di una cella di flusso microfluidica romanzo imporre un gradiente chimica ben definita per lo sviluppo biofilm. Per generare un gradiente chimica ben definita all&#39;intern...

Microrganismi attribuiscono alle superfici e formare biofilm - aggregati di cellule racchiuse in una matrice extracellulare-polimero 1. I biofilm si comportano in modo molto diverso dalle cellule microbiche individuali, perché biofilm hanno drammatico eterogeneità spaziale risultante da una combinazione di limitazioni del trasporto dei soluti interni e variazioni spaziali nel metabolismo cellulare 2,3. Le concentrazioni di ossigeno e nutrienti drasticamente diminuire all&#39;interfaccia tra biofilm e dintorni fluido e ottenere ulteriori impoverito all&#39;interno del biofilm 2. Variazioni spaziali in biofilm la respirazione e la sintesi proteica può verificarsi anche come una risposta all&#39;ossigeno localizzato e la disponibilità di nutrienti 2. In ambienti acquatici e del terreno, la maggior parte dei batteri abitano in biofilm. Biofilm naturali svolgono importanti processi biogeochimici compresa ciclo del carbonio e azoto e ridurre i metalli 4,5. Clinicamente, la formazione di biofilm è responsbile per polmonare prolungato e infezioni urinarie 6. Infezioni biofilm associate sono molto problematico perché le cellule in biofilm sono estremamente elevata resistenza agli antimicrobici rispetto ai loro omologhi planctonici 6. Perché biofilm sono importanti in contesti diversi, una notevole quantità di ricerca si è focalizzata sulla comprensione dei fattori ambientali che controllano le attività biofilm e l&#39;eterogeneità spaziale biofilm e microambiente circostante. Studi precedenti hanno dimostrato che lo sviluppo del biofilm è fortemente regolato da una serie di fattori ambientali: biofilm sviluppano differenti morfologie sotto varie condizioni di flusso; ossigeno e nutrienti disponibilità influenza biofilm morfologia; e sforzo di taglio idrodinamico colpisce l&#39;attaccamento di cellule planctoniche alle superfici e il distacco delle cellule dal biofilm 7-9. Inoltre, condizione di flusso esterno influenza la consegna dei substrati into ed entro 10 biofilm. La crescita di biofilm altera anche circostante condizioni fisiche e chimiche. Ad esempio, la crescita di biofilm porta alla deplezione locale di ossigeno e nutrienti 2; biofilm accumulano composti inorganici e organici dall&#39;ambiente circostante 11; e cluster biofilm deviano il flusso e l&#39;aumento della superficie di attrito 12,13. Perché biofilm interagiscono con il loro ambiente circostante in modi molto complessi, è fondamentale per ottenere contemporaneamente informazioni sulle proprietà biofilm e delle condizioni ambientali, e gli approcci multi-disciplinari devono essere utilizzati per caratterizzare completo interazioni biofilm-ambiente. Qui vi presentiamo una serie di metodologie integrate per caratterizzare i modelli spaziali in crescita microbica all&#39;interno mono-specie e biofilm dual-specie sotto una pendenza nutrizionale imposto, e di osservare la modifica conseguente della sostanza chimica locale e microambiente fluido. Noi FIRv descrivono l&#39;uso di una cella di flusso microfluidica doppia aspirazione recentemente sviluppato per osservare la crescita di biofilm sotto gradienti chimici ben definiti. Abbiamo poi dimostrare l&#39;uso di questa cella di flusso microfluidica per osservare la crescita di due specie di batteri, Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli, in biofilm sotto una varietà di condizioni nutrizionali. Mostriamo come in visualizzazione situ fluorescente di propagazione tracciante in colonie biofilm può essere utilizzato per valutare quantitativamente i modelli di trasporto dei soluti in biofilm. Infine, si mostra come microscala velocimetria tracciamento di particelle, eseguita al microscopio confocale, può essere utilizzato per ottenere campo di moto locale intorno alle biofilm crescita.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">Miniplus 3</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">F117934</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock</td>
			<td style="width:89px;">Smiths Medical&#160;</td>
			<td style="width:104px;">MX9311L</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td>
			<td style="width:89px;">ML Solar LLC</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td>16157-191</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">C-FLEX Tubing</td>
			<td style="width:89px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:104px;">06422-02</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">1 mL TB Syringe</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309659</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Polymer Tubing</td>
			<td style="width:89px;">IDEX</td>
			<td style="width:104px;">1520G</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td>
			<td style="width:89px;">Clay Adams</td>
			<td style="width:104px;">427564</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">305195</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:89px;">HACH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Syringe filters- sterile (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:89px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:104px;">09-719A</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">MAXQ Shaker</td>
			<td style="width:89px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ammonium sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4418</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">RES20908-A7</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P5655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">S7653</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Magnisium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M8266</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C5670</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C3771</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">215422</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M7634</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">451657</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">Z0251</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium molybdate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">243655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Boric acid</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">B6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Dextrose</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D9434</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">L3022</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">TCS SP2 Confocal Microscopy</td>
			<td style="width:89px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">SYTO 62</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">S11344</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:227px;">Cy5</td>
			<td style="width:89px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">PA15100</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">F-8801</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">BioSPA</td>
			<td style="width:89px;">Packman Lab</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">ImageJ</td>
			<td style="width:89px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Volocity</td>
			<td style="width:89px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Streams 2.02</td>
			<td style="width:89px;">University of Cantebury</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

I biofilm sono comunità microbiche-superficie collegata che hanno strutture complesse e producono significativi eterogeneità spaziali. Sviluppo di biofilm è fortemente regolata dal flusso circostante e l&#39;ambiente nutrizionale. Crescita biofilm aumenta anche l&#39;eterogeneità del microambiente locale generando campi di flusso complessi e modelli di trasporto dei soluti. Per studiare lo sviluppo di eterogeneità in biofilm e le interazioni tra biofilm e il loro locale micro-habitat, siamo cresciuti biofilm mono-specie di Pseudomonas aeruginosa e biofilm dual-specie di P. aeruginosa e Escherichia coli sotto gradienti nutrizionali in una cella di flusso microfluidica. Forniamo protocolli dettagliati per creare gradienti nutrienti all&#39;interno della cella di flusso e per la crescita e la visualizzazione sviluppo biofilm in queste condizioni. Abbiamo anche protocolli presenti per una serie di metodi ottici di quantificare modelli spaziali nella struttura biofilm, flusso Distributi su biofilm, e trasporto di massa intorno e all&#39;interno di colonie biofilm. Questi metodi supportano le indagini a tutto campo del co-sviluppo di biofilm e di habitat eterogeneità.

La cella doppia presa flusso microfluidica consente l&#39;osservazione della crescita biofilm sotto un gradiente chimica ben definita formata miscelando due soluzioni all&#39;interno della camera di flusso. Il gradiente chimica risultante è stato precedentemente osservato per iniezione colorante e caratterizzato in dettaglio da Song et al. 14. Gradienti di concentrazione lisce sono formate in direzione trasversale, come illustrato in Figura 1. Il profilo di concentrazione era ripida...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity at JoVE.com

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K Views.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 