私たちは、Pを提供するためにワシントン大学（シアトル、ワシントン州）のMatt Parsekに感謝緑膿菌とE.ストリームソフトウェアへのアクセスを提供するためのカンタベリー大学（ニュージーランド）での大腸菌の菌株とロジャー·ノークス。この作品は、国立衛生研究所からの助成金のR01AI081983、アレルギーと国立感染症研究所によってサポートされていました。共焦点イメージングは​​、ノースウェスタン生物イメージング機能（BIF）で行った。

1.フローセルセットアップおよび接種注：Song らに記載されてダブルインレットマイクロ流体フローセルを使用し、2014年14バイオフィルムを成長させる。。このフローセルは、明確に定義された滑らかな化学的勾配を作成することができる。フローセルの設計は、 図1に示されており、電池の製造は、以前Song らに記載されて流れている。、2014 14。P.を使用してここで詳細に我々の方法を緑膿菌とE.大腸菌は、バイオフィルムを形成するが、他の種にも適切であり得る。我々はPを使用構成的バイオフィルム発生のためのモデル生物として、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する緑膿菌 PAO1- のgfp。さらに、当社は、Eを使用大腸菌DH5αP.と混合種のバイオフィルムを形成するために緑膿菌。P.緑膿菌とE.大腸菌株はLB寒天プレート上で増殖させた。 <ol><li> a側にポリジメチルシロキサン（PDMS）を使用して、結合したフローセルを準備14に記載されているように、酸素プラズマ処理を介してカバーガラス。フローセルチャンバーの寸法は、0.24ミリメートル（奥行き×幅×長さ）×13ミリメートル×23ミリメートルである。 </li><li>修正されたFAB成長培地15を準備します。 、フローセル内の栄養勾配の下でのバイオフィルムの成長を観察する一つの入口で0.6μMグルコースを培地に変更FAB 15を紹介し、他の入口から任意の炭素源なしFAB培地を導入する。フィルター滅菌し（孔径=0.2μm）でのグルコースストック溶液（60 mM）のFAB培地に​​添加する前に。使用前に、また、サイクル1（121℃、17 psiの液体、15分）を有するFAB培地をオートクレーブ。 </li><li>フローシステムを滅菌する。接種の前に、流路全体（培地ボトル、チューブ、バブルトラップ、フローセル）フローセルの上流​​に位置する（使い捨て滅菌済み）プラスチック三方弁を除いて、サイクル1を用いてオートクレーブ。 （スリーウェイバルブはセルcを注入するために使用されulture、蛍光トレーサー及びマイクロビーズ。）オートクレーブする前に、アルミ箔またはオートクレーブ袋ですべてのチューブおよびコネクタの開口部をカバーし、組み立て中に汚染を避けるために。 </li><li>フローシステムを接続します。注意深くフローセルシステムの構成要素を組み立てる（フローシステムアセンブリのためのビデオを参照）、正確に流量を制御する蠕動ポンプを介してフローセルに増殖培地を提供。 </li><li> P.のコロニーを転送することによって接種のための細胞培養を準備緑膿菌またはE. LBプレートからLBブロスの3ミリリットルに大腸菌および225rpmで、37℃で培養するO / Nを振ること。接種物として最終OD 600 = 0.01に水を滅菌1ミリリットル中にO / N細胞培養物を希釈する。 （培養および汚染を避けるために、層流フード中の細菌を希釈する。） </li><li>各細菌のための同等のOD 600 = 0.01と1ミリリットル中に1：混在種のバイオフィルムを用いた実験では、1の比に2細菌培養を希釈。 </li><li>フローセルを接種する。三方弁からフローセル入口に接種物1mlを注入する。注射後、細菌細胞をカバーガラスに付着させ、1時間の流れを一時停止。 （フローセルが懸濁された細胞は、カバースリップ上に沈降させるためにカバースリップ側を下に置かれていることを確認します。） </li><li> 1時間後、フローを再開し、3日間、各入口0.03 ml /分の一定速度でフローセルに成長培地をポンピングする。 </li></ol> 2.共焦点顕微鏡を用いて栄養グラデーションに応じて、バイオフィルムの開発の特徴付け注：P.緑膿菌は、構成的に発現したGFPが、Eで画像化することができる混合種のバイオフィルム中の大腸菌は、対比によって画像化されなければならない。 <ol><li>共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムを観察します。代表的な結果を得るには、63Xの目的とした共焦点顕微鏡を使用してバイオフィルムを観察する。イメージング、マークの前にカバーガラス側のグリッドダブルインレットフローセル。 （このグリッドの目的は、実験者がフローセルチャンバ内の撮像領域を見つけることを可能にすることである。） </li><li> 、対比などSTYO 62などの緑色蛍光核酸染色などの細胞透過赤色蛍光核酸染色、10μlのを希釈、原液（1 mM）を990μlの滅菌水にしてから、ゆっくりとシリンジを用いて希釈染みを注入するために、上流側の三方弁からフローセルチャンバー。停滞フローセルを維持し、30分間、暗所で、その後15分間、結合していない汚れを洗い流すためにフローを再開。 </li><li>共焦点イメージングを行います。励起のための488nmアルゴンレーザーとGFP（500から535ナノメートル）と（緑色蛍光核酸染色のため、650〜750 nm）の核酸染色のためのチャネルを収集放出をアクティブにします。明るく清潔なイメージを持っているように、両方のチャネルのためのゲインおよびオフセットを調整します。 XYZと同時撮像モードを選択します。 IDENするZ-コントロールノブを使用して、フィールド内のバイオフィルムの底部と頂部をtify。 3次元画像スタックを取得するための0.5μmからのz段階を設定する。 （画像取得のための4つのラインの平均を使用して、高画質を確保するために）。 </li><li>三つにおける空間フローセル内のバイオフィルムの発達のパターン、画像、バイオフィルムをマッピングする複数の長手方向（x）のフローセル入口に沿って距離が、 図1に示すように、3つの横方向（y）に、課された栄養勾配に対する相対位置。 </li></ol>保守党蛍光トレーサーの注射によって3の特徴付け内部溶質輸送注：そのようなCy5のような保守的な蛍光トレーサー、バイオフィルム内の溶質移動パターンを特徴付けるために使用することができる。 <ol><li>ストック溶液としてミリリットルの10mg /の最終濃度まで水でのCy5（モノ反応性NHSエステル）に溶解する。 -20℃の冷凍庫でCy5の原液を保管してください。 注：Cy5標識が光sensitであるためIVEは、ストアは、希釈し、暗所にCy5のソリューションを注入する。 </li><li>蛍光トレーサーの注射の前に、（63X対物レンズを使用）共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムの3次元画像スタックを取る。 （バイオフィルムコロニーの広い領域は、色素の輸送での時系列の観測に最適です。）（ 図5（a）に示すように）また、イメージングのための十分に分離したコロニーを有するz平面を選択します。 </li><li>各Cy5の注入実験のために、20μg/ mlのCy5標識の濃度を有する注射溶液を得、滅菌水998μlの中のCy5ストック溶液2μlを希釈する。 </li><li>流れを一時停止し、3方弁を介して注射器を用いて、フローセルの上流​​にCy5の溶液を注入するポンプを停止する。 （これは、注入しながら流路に入るの気泡を防止することが重要である。バブルトラップが戻って注入中に開いたままにすべきである。） </li><li> Cy5の溶液を注入した後、バブルトラップを閉じる三方弁を調整し、再起動するフローセルに注入Cy5のソリューションを提供するポンプ。 </li><li> XYTする共焦点撮像モードを切り替えます。同時撮像モードの下でのCy5とGFPのチャンネルをアクティブにします。定量化のために重要である、信号の飽和を避けるために、（レーザー強度、ゲイン、オフセット）Cy5の強度に共焦点設定を調整します。 （高時間分解能は、染料浸透を可視化することが好ましい。ただし、高速走査は、画像品質を低下させる。）、撮像の時間分解能および画質のバランスをとるために、適切な走査速度とライン平均値を選択する。このプロトコルの4のライン平均0.15 60Hzのフレームレートを使用。 </li><li> （静止0.03ミリリットル/分の流速で）フローセルにCy5標識を提供するためのフローを再開。同時に時系列共焦点イメージングを開始する。 </li><li>放射状に2-Dの円形のバイオフィルムコロニー内のCy5強度を平均化することによりCy5の浸透を定量化する。最初のバイオクラスターのエッジを識別する、平均化するために、クラスタの2-D区間の距離マップを生成する、最後にCy5の強度の平均半径方向のパターンが浸透曲線（ 図6参照）を生成する。 <ol><li>計算上3.8ステップ実現するために、Biospa社（バイオフィルム空間パターン解析）ソフトウェアパッケージ（リクエストに応じて利用可能未発表、ソフトウェアパッケージとマニュアル）、または他の画像解析プログラムを使用しています。 </li><li> Biospa社を使用するには、まずBiospa社に設定した画像をインポートします。その後、バイナリイメージを作るために、GFPおよびCy5チャンネルのための適切なしきい値を選択します。分析/計算メニューで、高度な分析と、その後拡散分析を選択します。クラスタのエッジを定義し、関心領域（ROI）のような1つのクラスタを選択するために、多角形ツールを使用してGFPチャネルを使用。 </li><li>二重拡散分析を実行するために選択されたバイオフィルムのクラスタをクリックします。拡散分析結果を保存し、検量線を用いてCy5の濃度にCy5の強度を較正する。 <ol><li>のCy5 conceにわたってCy5の強度を測定し、Cy5の濃度の較正曲線を生成する共焦点顕微鏡下ntration勾配。 （Cy5の強度と濃度は線形の関係を有する。） </li></ol></li></ol></li></ol> 4.追跡蛍光粒子によって周囲の流れ場の特徴付け注：蛍光ビーズのような蛍光粒子は、バイオフィルムの周りの流れ場を特徴付けるために使用することができる。バイオフィルムの周りの流れ場は、粒子追跡速度測定ソフトウェアを使用して、パーティクルの位置の時系列観測値から算出することができる。ここに示す結果はストリーム2.02ソフトウェアパッケージ16（ソフトウェアのダウンロードとで利用できるユーザーガイドを用いて得られた<a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ）。 <ol><li> 0.2％の最終固形分濃度が0.5 mlの最終容積に滅菌水で蛍光マイクロビーズ（直径約1ミクロン）で希釈する。渦は、マイクロビーズがいることを確認するよく分散されている。 </li><li>ステップ3.3から3.5から手順以下のフローセルに希釈された蛍光マイクロビーズを注入してお届けします。粒子経路の正確なトラッキングを可能にするために、比較的低流量（0.01ミリリットル/本論文では、粒子追跡結果のための時間）を使用します。 </li><li> 1のzスライスにおける粒子の動きを追跡し、時系列画像を撮影するモードをXYT共焦点設定を切り替える。 （1ヘルツのフレームレートは、この論文に示されている代表的な結果を得るために使用した。）を繰り返して、粒子噴射し、画像を別のzの位置における3次元流れ場を生成する。 </li><li>前工程の時系列（上利用可能なソフトウェアのダウンロードとマニュアルのImageJを使用してバックグラウンドの蛍光シグナル（画像セットの最初の取得画像内の信号）を減算することによって共焦点画像<a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/を</a> ）または他のプログラム。 </li><li> ImageJのでは、画像セットの最初の画像を開き、画像セットをインポートします。プロセスの下で/画像のCalculator、画像セットから最初の画像を差し引く。前処理された画像セットを保存します。 </li><li>ストリーム2.02においてフローベクトル、インポート時系列の共焦点画像を算出する。 「オープン·プロセスビュー」の下で、「粒子の識別」を選択し、実行します。粒子を識別するために、適切なしきい値を使用してください。 1ミクロンの粒子の最小値と最大直径のしきい値として0.5と5μmのを使用してください。 </li><li>その後、「オープンプロセスビュー」の下に、粒子のパスを生成するために、「PTV解析パイプライン」を選択して実行。彼らは、粒子の動きを表現するかどうかを確認するために、粒子のパスを確認してください。最後に、選択して、フローベクトルマップを生成する「速度場の作成」を実行します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorption+sites+in+biofilms.">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms.">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li><li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers.">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li><li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms.">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li><li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm.">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li><li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs.">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport.">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li><li>Liu, Y., Tay, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin.">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li><li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection.">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

バイオフィルムの化学勾配に応じて、周囲の流れの微小環境上のバイオフィルムの成長、および内部輸送の制限に起因するバイオフィルムの不均一性の影響：私たちは三つの重要なバイオフィルムと環境の相互作用を特徴づけるための方法のスイートを実証した。 まず、バイオフィルム発生のために明確に定義された化学勾配を課すことは、新規なマイクロ流体フロー?...

細胞外ポリマーマトリックス1で囲まれた細胞凝集物-微生物は、表面およびフォームバイオフィルムに付着する。バイオフィルムは、内部溶質移動の制限と細胞代謝2,3における空間的変化の組み合わせから得られる劇的な空間的不均一性を持っているので、バイオフィルムは、非常に異なる個別の微生物細胞から振る舞う。酸素と栄養素濃度が大幅にバイオフィルムと流体と、さらにバイオフィルム2における内枯渇取得周囲の間の界面に減少する。バイオフィルム呼吸およびタンパク質合成の空間変動もローカライズ酸素および栄養素利用2に対する応答として生じ得る。 水生および土壌環境では、ほとんどの細菌はバイオフィルムに住む。ナチュラルバイオフィルムは、炭素と窒素を循環し、金属4,5の削減などの重要な生物地球化学的処理を行う。臨床的には、バイオフィルム形成はRESPONSです長期の肺と尿感染症の6のためible。バイオフィルム中の細胞はそれらのプランクトン様の対応物6と比較して、抗菌剤に対して極めて高い耐性を有するので、バイオフィルム関連感染症は非常に問題である。バイオフィルムは、多様な設定において重要であるため、研究のかなりの量は、バイオフィルム活性とバイオフィルム中の空間的不均一性と、周囲の微小環境を制御する環境要因を理解することに焦点を当ててきた。 以前の研究では、バイオフィルムの開発が強く環境要因の数によって調節されることを見出した：バイオフィルムは、種々の流動条件下で、異なる形態を開発する。酸素と栄養素の可用性に影響を与えるバイオフィルム形態。と流体力学的せん断応力が表面に浮遊性細胞の付着とバイオフィルム7-9からの細胞の脱離に影響を与えます。また、外部フロー条件は、基板のintの配信に影響を与えるO及びバイオフィルム10内。バイオフィルムの成長はまた、物理的および化学的条件を囲む変える。例えば、バイオフィルムの成長は、酸素と栄養2のローカル枯渇をもたらす。バイオフィルムは、周囲の環境11からの無機および有機化合物を蓄積。とバイオクラスターは流れをそらすと表面摩擦12,13を増やす。バイオフィルムは、非常に複雑な方法でその周囲の環境と相互作用するので、同時にバイオフィルムの特性および環境条件についての情報を得ることが重要であり、学際的なアプローチが包括的にバイオフィルム環境の相互作用を特徴付けるために使用される必要がある。 ここでは、課せられた栄養勾配の下でのモノ種とデュアル種のバイオフィルム内の微生物の増殖に空間パターンを特徴づけるために統合された一連の方法を提示し、局所的な化学的および流体微小環境の結果の変更を観察する。我々モミstは明確な化学勾配下バイオフィルムの成長を観察するための最近開発されたダブルインレットマイクロ流体フローセルの使用を記載している。次に、栄養条件の範囲の下でバイオフィルム中の細菌は、 緑膿菌、大腸菌 、2種の成長を観察するために、このマイクロ流体フローセルの使用を示す。我々は、バイオフィルムコロニーへの蛍光トレーサーの伝播のインサイチュ可視化定量的バイオフィルムにおける溶質輸送のパターンを評価するために使用できる方法を示す。最後に、共焦点顕微鏡下で行う、どのマイクロ粒子追跡速度測定を示し、成長したバイオフィルムの周りに局所的な流れ場を得るために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">Miniplus 3</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">F117934</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock</td>
			<td style="width:89px;">Smiths Medical&#160;</td>
			<td style="width:104px;">MX9311L</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td>
			<td style="width:89px;">ML Solar LLC</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td>16157-191</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">C-FLEX Tubing</td>
			<td style="width:89px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:104px;">06422-02</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">1 mL TB Syringe</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309659</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Polymer Tubing</td>
			<td style="width:89px;">IDEX</td>
			<td style="width:104px;">1520G</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td>
			<td style="width:89px;">Clay Adams</td>
			<td style="width:104px;">427564</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">305195</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:89px;">HACH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Syringe filters- sterile (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:89px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:104px;">09-719A</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">MAXQ Shaker</td>
			<td style="width:89px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ammonium sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4418</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">RES20908-A7</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P5655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">S7653</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Magnisium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M8266</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C5670</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C3771</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">215422</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M7634</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">451657</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">Z0251</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium molybdate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">243655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Boric acid</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">B6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Dextrose</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D9434</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">L3022</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">TCS SP2 Confocal Microscopy</td>
			<td style="width:89px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">SYTO 62</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">S11344</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:227px;">Cy5</td>
			<td style="width:89px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">PA15100</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">F-8801</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">BioSPA</td>
			<td style="width:89px;">Packman Lab</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">ImageJ</td>
			<td style="width:89px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Volocity</td>
			<td style="width:89px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Streams 2.02</td>
			<td style="width:89px;">University of Cantebury</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

バイオフィルムは、複雑な構造を持ち、重要な空間的不均一性を生成する表面結合微生物群集である。バイオフィルムの開発が強く、周囲の流れおよび栄養環境によって調節される。バイオフィルムの成長はまた、複雑な流れ場と溶質輸送パターンを生成することによって、局所微小環境の不均一性を増大させる。バイオフィルムとそのローカルマイクロ生息地間のバイオフィルムとの相互作用における異質の開発を調査するために、我々は緑膿菌とP.のデュアル種のバイオフィルムのモノ種のバイオフィルムを成長したマイクロ流体フローセル中の栄養勾配下緑膿菌、大腸菌 。我々は、フローセル内の栄養勾配を作成するために成長し、これらの条件下で、バイオフィルム発生を可視化するための詳細なプロトコルを提供する。また私たちは現在、バイオフィルム構造で空間パターンを定量化するための光学的方法の一連のためのプロトコル、フローdistriバイオフィルム上butions、および大量輸送の周りや生物膜コロニー内。これらのメソッドは、バイオフィルムと生息地の異質の共同開発の総合的な調査をサポートしています。

ダブルインレットマイクロ流体フローセルは、フローチャンバー内の2つの溶液を混合することにより形成された、明確に定義された化学勾配下でのバイオフィルムの成長の観察を可能にする。得られた化学勾配が以前の染料注入により観察し、Song ら 14により詳細に特徴付けた。 図1に示すように、滑らかな濃度勾配は、横方向に形成された。濃度プロファイルは?...

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Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K ビュー.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

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Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To this end, our laboratory has applied the principles of nanomedicine to simplify ART regimens and as such reduce toxicities while improving compliance and drug pharmacokinetics. Simple and reliable methods for manufacturing nanoformulated ART (nanoART) are shown. Particles of pure drug are encapsulated by a thin layer of surfactant lipid coating and produced by fractionating larger drug crystals into smaller ones by either wet milling or high-pressure homogenization. In an alternative method free drug is suspended in a droplet of a polymer. Herein, drug is dissolved within a polymer then agitated by ultrasonication until individual nanosized droplets are formed. Dynamic light scattering and microscopic examination characterize the physical properties of the particles (particle size, charge and shape). Their biologic properties (cell uptake and retention, cytotoxicity and antiretroviral efficacy) are determined with human monocyte-derived macrophages (MDM). MDM are derived from human peripheral blood monocytes isolated from leukopacks using centrifugal elutriation for purification. Such blood-borne macrophages may be used as cellular transporters for nanoART distribution to human immunodeficiency virus (HIV) infected organs. We posit that the repackaging of clinically available antiretroviral medications into nanoparticles for HIV-1 treatments may improve compliance and positively affect disease outcomes.

Nanoparticles of indinavir, ritonavir, efavirenz and atazanavir were manufactured using wet milling, homogenization and ultrasonication. These nanoformulations, collectively termed nanoformulated antiretroviral therapy (nanoART), assessed macrophage-based drug delivery. Monocyte-derived macrophage nanoART uptake, retention and sustained release were determined. These preliminary studies suggest the potential of nanoART for clinical use.

Nanoformulated抗レトロウイルス薬の血液媒介マクロファージのキャリッジのための方法の開発

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

生物工学

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（ カルシウム BChip）

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

乾燥風-LCインターフェイス上Megamolecular生体高分子の自己統合するための方法

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

組織工学用植物組織の Decellularization の 2 つの方法

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

3 つの補完的な手法を使用して胎盤をターゲットとした薬剤投与の安全性の総合評価

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

生体組織の刺激のための電界・磁場装置

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...