Bu protokol önemlidir, çünkü araştırmacıların ticari veya kurum içi hiPSC-CM'leri, kardiyotoksisite taramasında hiPSC-CM'lerin öngörücü değerini önemli ölçüde artıran yetişkin benzeri bir fenotipe olgunlaştırmalarını sağlar. Bu protokolün temel avantajı, kalsiyum veya voltaj değişiminin optik haritalanması için yüksek verimli bir formatta olgun hiPSC-CM'ler sunmasıdır. Bu protokol, hastalık mekanizmalarını araştırmak veya ilaçları kardiyotoksisite açısından taramak için kullanılabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Jeffrey Creech olacak. Kardiyomiyosit kaplamadan 1 saat önce, olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matris veya MECM plakalarını 200 mikrolitre Hank'in dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile iki kez yıkayarak başlayın. Kuyuları nemli tutun.
Kardiyomiyosit tüplerini sıvı azot tankından kuru buza aktarın ve tüp kapaklarını hafifçe açarak basıncı serbest bırakın. Daha sonra, tüp kapaklarını tekrar kapatın ve 4 dakika boyunca su banyosunda çözün. Hücrelerin çözülmesinden sonra, tüpleri açmadan önce% 70 etanol ile püskürtün.
Hücreleri 1 mililitrelik pipetle 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Kriyovyal malzemeye 1 mililitre kaplama ortamı ekleyin ve yıkamayı 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Ardından, yavaşça 1 mililitre kaplama ortamı damlatın ve tüpü çalkalayın.
8 mililitre kaplama ortamının transferine kadar bunu tekrarlayın. 15 mililitrelik tüpü 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve peletleri kaplama ortamının 1 mililitresinde tekrar askıya alın. Bir aliquot'u çıkarın ve mililitre başına 5. hücrelere 7.5 x 10 elde etmek için bir kaplama ortamı eklemeden önce bir hemositometre ile canlı hücre sayımı yapın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak MECM kaplı 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın ve hücreleri 2 gün boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı 200 mikrolitre bakım ortamı ile değiştirin ve plakaları 7 gün boyunca koruyun, 5. günde ortam değişikliği yapın. 7. günde, metinde açıklandığı gibi EP testi yapın.
Hücre kültürünü genişletmeyi tercih ederken ortamı her geçen gün değiştirdiğinizden emin olun. HiPSC-CM'yi manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama veya MACS yoluyla saflaştırmak için, hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücreleri 1 mililitre HBSS ile yıkayın-Daha sonra, 1 mililitre% 0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik veya EDTA ekleyerek hücreleri ayırın ve hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 2 mililitre kaplama ortamı ile yeniden göndererek ve tekilleştirerek tripsin / EDTA'yı inaktive edin.
Altı kuyucuktan, hücreleri 70 mikrometrelik bir süzgeç kullanarak 50 mililitrelik bir konik tüpe toplayın. Süzgeci 3 mililitre kaplama ortamı ile yıkadıktan sonra, hücreleri sayın. Sayımdan sonra, hücre peletini 2 mililitre buz gibi soğuk MACS ayırma tamponu ile santrifüj edin ve yıkayın, sonra peletleyin ve hücreleri 5 x 10 başına 80 mikrolitre soğuk MACS ayırma tamponunda 6. hücrelere yeniden gönderin.
20 mikrolitre soğuk kardiyomiyosit olmayan tükenme kokteyli ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmeden önce süspansiyonu karıştırın. Hücreleri 300 x g'de 4 mililitre soğuk MACS ayırma tamponu ile 5 dakika yıkadıktan sonra, pelet 80 mikrolitre soğuk MACS ayırma tamponunda tekrar askıya alın. 6. hücrelere 5 x 10 başına 20 mikrolitre soğuk anti-biyotin mikroboncuk ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmeden önce hücre süspansiyonunu hafifçe karıştırın.
Numuneler inkübe edilirken, 30 mikrometre ön ayırma filtreleriyle donatılmış pozitif tükenme sütunlarını MACS ayırıcısına yerleştirin ve etiketli 15 mililitrelik toplama tüplerini sütunların altına yerleştirin. Ardından, her sütunu 3 mililitre soğuk MACS ayırma arabelleği ile amortismana alın. Antikorla muamele edilmiş hücre süspansiyonunu 2 mililitre MACS ayırma tamponu ile karıştırın ve sütuna ekleyin.
Her sütuna 2 mililitre MACS ayırma tamponu ekleyin ve 12 mililitre akışlı kardiyomiyosit süspansiyonu toplayın. Kardiyomiyositleri santrifüj edin ve kardiyomiyositleri 1 mililitrelik bir kaplama ortamında yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Konsantrasyonu belirlemek için, hücreleri sayın ve saflaştırılmış kardiyomiyosit hücrelerini MECM 96 kuyucuklu plakalara kaplamadan önce hacmi istenen tohumlama yoğunluğuna ayarlayın.
Kardiyomiyosit bakım ortamını aspire edin ve 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 mikrolitre voltaja duyarlı boya veya VSD veya kalsiyuma duyarlı floroforlar veya CSF ile değiştirin. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, boyaları bir tahlil ortamı veya HBSS ile değiştirin. Yüksek verimli bir optik haritalama cihazı kullanarak temel veri optik haritalamasını almadan önce hücreleri 37 santigrat derecede dengeleyin.
Hücreleri akut maruziyet testi için ilaçlarla tedavi etmek veya kronik olarak ilgili ilaçlara maruz kalan hücreleri haritalamak için, ilaçları dimetil sülfoksit veya DMSO içinde seyreltin ve HBSS'de istenen konsantrasyonlara seyreltmeden önce 20 santigrat derecede stok çözeltileri olarak saklayın. 96 kuyucuklu plakalarda kardiyotoksisite testi için, doz başına en az sekiz kuyucuklu bir bileşiğin dört dozunu ekleyin. Etkili doz da dahil olmak üzere klinik olarak etkili terapötik plazma konsantrasyonunun altından üstüne kadar değişen dozları kullanın.
İlaç uygulamasından önceki temel elektrofizyoloji ölçümlerine benzer şekilde, kronik çalışmalar için ilaç tedavisinden en az 30 dakika sonra elektrofizyoloji kayıtlarını yakalayın. Temel kayıtlardan sonra, GCaMP6m'yi ifade eden olgun hiPSC-CM'lerin monokatmanlarına, doz başına en az sekiz kuyucuk olacak şekilde, her ilacın en az dört dozunu uygulayın. Hücreler üzerindeki ilaçları 30 dakika boyunca dengeleyin ve veri toplama öncesinde ve sırasında hücreleri 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.
Tüm plakanın temel kayıtlarını takiben, sağlam ilaç yanıt verilerini sağlamak ve izoproterenolün tek katmanlı atım hızı, kasılma genliği ve kalsiyum geçici süresi üzerindeki etkilerini ölçmek için her kuyucuğa 500 nanomolar izoproterenol ekleyin. Optik eşleme verilerini almak için ön çekmeceyi açın ve plakayı plakalı ısıtıcının üzerine yerleştirin. Edinme yazılımını açtıktan ve yazılımdaki dosya kaydetme konumunu belirledikten sonra, daha yüksek zamansal çözünürlük için 10 ila 30 saniye süreyi ve kare hızını seçin ve Almayı Başlat'ı tıklatın.
Analiz yazılımını açın ve İçe Aktarma Filtresi sekmesinde, tek bir dosyaya gözat'ı veya bir plakayı yeniden oluşturmak için Birden Çok Döşeme'yi seçin. Dosyaları seçin, bir dizi satır ve sütun girin ve Otomatik'i seçin. Ardından, Piksel Boyutunu Güncelleştir'i seçin, piksel başına mesafe girin ve Kaydet'i İşleme'yi tıklatıp bir sonraki sekmeye geçmeden önce görüntüdeki kuyucukların konumunu belirlemek için Kuyu Sihirbazı'nı kullanın.
YG'leri veya İlgi Çekici Bölgeler sekmesini açın ve YG'leri manuel, otomatik olarak çizmeyi veya tüm plakanın analizi için dikkate alınacak YG'leri hiç kullanmamayı seçin. Kuyudaki bölgeyi seçtikten sonra, bir sonraki adıma geçmek için İşlem Kaydet düğmesine tıklayın. YG'leri görselleştirmek için Kutuları Gizle ve Yalnızca Filtrelenmiş Olanları Göster kutularını işaretleyin.
Analiz sekmesini açın, otomatik vuruş algılamanın doğruluğunu onaylamak için her bir kuyucuğu veya yatırım getirisini seçin. Tek bir vuruş seçip klavyede Delete tuşuna basarak izlemelere darbe ekleyin veya izlemelerden vuruşları kaldırın. İşiniz bittiğinde, Kaydet'e tıklayın.
Ardından, Analiz sekmesindeki Zaman-Uzay Grafiği düğmesini tıklatın ve her bir kuyu veya YG için verileri görselleştirmek üzere zaman-uzay grafiğini belirlemek üzere çizgiyi ekleyin. Yatay veya dikey bir çizgi seçtikten sonra, Çizim Oluştur'a tıklayın. Doğru vuruş algılamasını sağladıktan sonra, Dışa Aktar sekmesine ilerleyin ve Dosya Biçimi'ni seçin, Dışa Aktar'ı tıklamadan önce Vuruş İstatistikleri seçeneğini girin.
Dışa aktarıldıktan sonra, veri dosyalarını açın ve seçilen istatistiksel analiz rutinini çalıştırın. Faz kontrastlı görüntüleme, MECM üzerine kaplanmış hiPSC-CM'lerin olgunlaştığını ve fare ECM'sinde kaplanan aynı hiPSC-CM grubundan yapısal olarak farklı hale geldiğini göstermiştir. Olgun hücreler çubuk şeklinde olurken, olgunlaşmamış hücreler dairesel bir şekil aldı.
Alfa-aktinin antikorları ile boyanmış kardiyomiyositler, her ECM koşulunda kültürlenen hücrelerin tipik şeklini göstermiştir. TnI boyaması ile tutarlı olarak, alfa-aktinin boyaması, MECM üzerinde olgunlaşan hiPSC-CM'lerin çubuk şeklinde olgun bir fenotipi teşvik ettiğini ve daha büyük sarkomer organizasyonunu indüklediğini göstermiştir. Mitokondriyal içerik ve aktivite, fare ECM'sinde kültürlenen hücreler ile MECM arasında farklıydı.
VSD'ler ve optik haritalama sistemi kullanılarak kaydedilen aksiyon potansiyelleri için elektrofizyolojik veriler, atriyal spesifik hücrelerin ventriküler spesifik hücrelerden önemli ölçüde daha hızlı bir spontan vuruş hızına ve daha kısa aksiyon potansiyeli süresine veya APD80'e sahip olduğunu göstermiştir. APD80 gibi parametreler için tüm plaka ısı haritaları, belirli bir parametrenin bir plaka içinde tekrarlanabilirliğini ortaya çıkardı. Olgun hiPSC-CM monokatmanlarının tipik aksiyon potansiyelleri, izole edilmiş ve test edilmiş yetişkin kardiyomiyositlerin aksiyon potansiyeli morfolojisini göstermiştir.
Tipik bir aksiyon potansiyeli spontan ritim de görüntülendi. İzoproterenol'e yanıt olarak, beta-1-adrenerjik reseptörlerin aktivasyonu pozitif kronotropi, pozitif inotropi ve pozitif lusitropiye neden oldu. İnsan Ether-a-go-go ile ilişkili gen veya hERG, E-4031, domperidon, vandetanib ve sotalol dahil olmak üzere kanal blokerine HiPSC-CM yanıtı, ritmi izlemek için GCaMP6m kalsiyum floresansı kullanılarak incelenmiştir.
Çalışma, E-4031 hERG kanal blokajının neden olduğu erken depolarizasyonların tespitini göstermiştir. Süspansiyondaki hücrelerle hızlı çalışın ve hücreleri nazikçe pipetleyerek kayma stresini önleyin. Ek olarak, hiPS sinsitisine zarar vermemek için ortam değişimini dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.
Bu prosedürü takiben, hücreler araştırmacıların en sevdiği teknikle analiz için protein, RNA, DNA ve lipit toplanması için uygundur. Bu teknik, araştırmacıları hastalıkları araştırmak ve yetişkin benzeri kardiyomiyositler kullanarak yeni ilaçların kardiyotoksisitesini test etmek için güçlendirir.
