Biz özofagus doku örnekleri ve işimizin destek kazanmakta yardım ettikleri için, Sayın Roger Ackroyd, Bay Andrew Wyman ve Bay Chris Stoddard, Sheffield Öğretim Hastaneleri NHS Foundation Trust de Danışmanı Cerrahlar müteşekkiriz. Biz modele tümör hücre hatları içeren yaptığı yardım için Ashraful Haque teşekkür ederiz. Biz minnetle Bardhan Araştırma ve Eğitim Vakfı (BRET) ve Yorkshire Kanser Araştırmaları (YCR) hibe tarafından bu çalışma için maddi destek kabul etmiş sayılırsınız.

İnsan özofagus hücreleri mide veya yemek borusu ameliyatı geçiren hastaların elde edilir. Doku araştırma amaçlı kullanılmak üzere Aydınlatılmış onam elde edilir ve doku uygun etik onayları (SSREC 165/03, İnsan Kaynakları Doku Bankası Lisansı 12.179) kapsamında anonim kullanılır. İnsan Özofagus Epitel Hücreleri 1. İzolasyon <ol><li> : 1 oranında bir laminer akış başlığı içinde doku kültürü çalışan ve steril bir teknik kullanılarak, Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve 3 Ham F12 karıştırılarak epitel kültür ortamı hazırlar (hacim: hacim). % 10 ekleme (hac / hac) FCS, 10 ng / ml, epidermal büyüme faktörü, 0.4 ug / ml hidrokortizon, 1.8 x 10 -4 M adenin, 5 ug / ml insülin, 5 ug / ml transferrin, 2 x 10 7 M triiyodotironin, 1 x 10 -10 M kolera toksin, 2 x 10 3 M glutamin, 100 IU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 0.625 ug / ml amfoterisin B </li><li> Standardı,steril teknikler, T75 doku kültür şişesi içine 100 ug / ml streptomisin DMEM 11 mL,% 10 FCS, 2 x 10 3 M, L-glutamin, 100 IU / ml penisilin, ve 0.625 ug / ml amfoterisin B koydu. Aynı ortam içinde 1 ml, 1 x 10 6 öldürücü ışınlanmış fare 3T3 fibroblastlar 12 ekleyin ve bir% 5 CO2, nemli ortamda, 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Bu epitel hücreleri daha sonra kültür için bir besleyici tabaka üretecektir. </li><li> Bir neşter kullanma ve histopatolog önerileri takip, gastrik veya özofageal cerrahi uygulanan hastalardan elde edilen özofagus skuamöz mukozasının hastalıksız arka plan bölgesinden doku yaklaşık 2 cm 2 numuneyi incelemek. Steril taşıyıcı ortam 50 ml&#39;lik bir kap içinde laboratuara nakliye (PBS, 100 lU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 0.625 ug / ml amfoterisin B), oda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> Bu noktada, taşıma doku depolamak4 ° C &#39;de (gece boyunca) en fazla 12 saat boyunca, orta, kolaylık sağlamak için; Onlar azalmış hücre canlılığı sonucu olarak, ancak daha uzun depolama süreleri kullanmayın. </li><li> Laminer akış doku kültürü kaputu çalışan ve steril bir teknik kullanılarak, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde ıslatılarak bir bisturi bıçağını sterilize edin. Steril PBS ile durulayın. </li><li> Steril bir Petri kabındaki doku yerleştirin ve 0.5 cm&#39;lik şeritler halinde kesmek için neşter kullanabilirsiniz. % 0.1 5 ml Petri kabı PBS içinde tripsin (w / v), çanak kapağı yerleştirmek ve 37 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Tripsin önleme Petri kabındaki dokuya FCS 5 ml. Şerit başına 1-2 dk çevreleyen ortama epitel hücreleri çıkarmak için steril forseps ile doku şeridi Holding, yavaşça neşter bıçağı ile epitel yüzeyi kazıyın. Kazınmış doku çıkarın ve bir kenara koyun. Tüm doku şeritleri için işlemi tekrarlayın. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ayrılmış epitel hücreleri ihtiva eden ortam toplamakve santrifüj (5 dakika, 200 xg). Süpernatantı dökün ve epitel ortam 12 ml pelet tekrar süspansiyon (adım 1.1 tarif edilmiştir). </li><li> Dökün ve aşama 1.2&#39;de hazırlanan T75 şişesi içinde besleyici hücre katmanından orta atın. % 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de bir şişeye, taze izole epitel hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübasyona bir steril pipet kullanın. </li><li> 24 saat sonra dökün ve aynı zamanda hücre artıkları içerir kültür ortamının, atın ve taze epitel ortam 12 ml ile değiştirin. % 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübe devam edin. Koloniler önümüzdeki 24-48 saat boyunca görünmeye başlayacak ve standart bir ışık mikroskobu altında kültür balon yerleştirerek görülebilir. Geçirilerek kültür ortamı dökün ve taze ortam eşit hacimde her 2-3 gün ile değiştirin. </li><li> Şişe,% 80 confluency, geçit hücreleri 13 ulaştığında. C bölmek1 bir oranda arşın: 5 modeli için hücre sayısını artırmak. Hücreleri Pasajlanması 24 saat önce epitel hücreleri alınacak her şişede ışınlanmış 3T3 hücrelerinin besleyici katmanları kurmak için adım 1.2 izleyin. Not: geçitler 1 ve sadece 4 arasında aşağıda tarif özofagus modelinde epitel hücreleri kullanın. </li></ol> İnsan Özofagus Fibroblastları 2. izolasyonu <ol><li> Bir laminer akış kabini çalışma ve steril tekniği kullanarak, adım 1.7&#39;de kenara doku alır. Steril bir Petri kabındaki yerleştirin ve steril bir neşter bıçağı ile kesme yoluyla ince kıyma. (Ağırlık / hacim) bir çözeltisi, kollajenaz ve Petri kabı kapağı yerleştirmek ve 5% CO2 nemlendirilmiş bir atmosfer içinde gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe% 0.5, 10 ml ekleyin. </li><li> Dikkatli bir şekilde, 15 ml bir santrifüj tüpüne ve santrifüj (10 dakika, 200 x g) sindirmek transfer dökün ve süpernatan atılır ve fibroblast kültür ortamında (DMEM,% 10 FCS, 10 ml pelletini2 x 10 3 M L-glutamin / ml penisilin, 100 IU, 100 ug / ml streptomisin ve 0.625 ug / ml amfoterisin B). </li><li> T75 şişesi içine süspansiyon yerleştirin ve% 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübe edin. 24 saat sonra enkaz içeren ve taze fibroblast orta 12 ml yerini alacak ortamı, kapalı dökün. Hücre sayısının artırılması 5 oranında: bir 1 hücreleri bölme,% 80 konfluent 13 ulaştığında kültür ortamı, her 2-3 gün ve geçiş hücreleri değiştirin. Not: pasajlar 4 ve sadece 10 arasında aşağıda açıklanan modelde fibroblast hücreleri kullanın. </li></ol> De-cellularized Özofagus iskele 3. hazırlanması <ol><li> Gıda üretimi için kullanılan taze kesilmiş Landrace domuzlardan bir mezbahada sağlam domuz yemek borusu edinin. Tek özofagus yaklaşık 30 ayrı yapıları için yeterli iskeleleri sağlayacaktır. Not: nedeniyle kapsamlı ve zaman coSterilizasyon protokolü gerekli nsuming, bu elde etmek ve tek seferde 10 yemek borusu, en az işlem normalde değer. </li><li> Hemen herhangi bir kirletici mikrobiyal yükü azaltmak için 5 dakika için% 10 povidon-iyot solüsyonu yaklaşık 150 ml içeren 180 ml&#39;lik steril bir kap içinde, taze kesilmiş yemek borusu yerleştirin. / Ml streptomisin, 200 lU / ml penisilin, 200 ug ve 1.25 ug / ml amfoterisin B ihtiva eden steril PBS içinde, yaklaşık 100 ml içeren ikinci bir kap için yemek transfer <ol><li> Kabın kapağını takın ve oda sıcaklığında geri laboratuara yemek borusu, taşıma. İki ya da üç Bu özofagus-lar büyüklüğüne bağlı olarak, her bir kap içinde taşınabilmektedir. </li></ol></li><li> Laboratuvarda bir kez, mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmek için aseptik teknik kullanılarak bir laminer akış kaputu doku anlaştım. % 70 etanol içinde 5 dakika için nemlendirici ve steril PBS içinde durulama ile cımbız, makas ve neşterler sterilize edin. </li><li> Es Koluophagus steril cımbız kullanarak. Makas kullanarak, uzunlamasına özofagus açık kesti. Steril PBS yaklaşık 100 ml içeren 180 ml steril pota yemek borusu yerleştirilmesi ve herhangi bir enkaz kaldırmak için hafifçe sallayarak doku durulayın. </li><li> Liberal ile% 70 etanol püskürtülerek bir mantar diseksiyon kurulu temizleyin ve kurumasını bekleyin. </li><li> Yönetim kurulu, mukoza yüzey en üstte üzerine yemek borusu dışarı pin, PBS gelen yemek borusu çıkarın ve steril iğneler kullanılarak. Steril cımbız ile özefagus bir ucunda mukozal yüzeyi kavrayın ve uzak kurulu çekin. Bu altta yatan submukozaya gelen mukozayı ayıracaktır. <ol><li> Ardından, diseksiyon mukoza uzak kaldırdı izin vermek ilerledikçe işaretçilerine kaldırarak, lamina propria boyunca uzunlamasına özofagus incelemek için steril bir neşter bıçak kullanın. </li></ol></li><li> Disseke mukozayı saklayın ve altta yatan submukozayı atın. </li><li> Cut off ve t en yakın ve uzak 2 cm atmaksırasıyla, 7, bu alanda submukozal bezlerin daha fazla sayıda ve daha kalın bir lamina propria olarak orada da mukozayı. </li><li> 5 cm 2 Kalan doku kesmek için bir neşter kullanın. Steril PBS yaklaşık 150 ml içeren bir 180 ml steril pota tüm kesim doku yerleştirin ve doku durulama hafifçe çalkalayın. Aynı anda en fazla beş özofagus-lar, işleme durumunda, bu için birden fazla kap ve takip eden üç adımları kullanmak gerekli olabilir. </li><li> Steril cımbız kullanarak, 37 ° C&#39;de 72 saat süre ile, 150, steril 1 M NaCl ml, 200 IU / ml penisilin, 200 ug / ml streptomisin ve 1.25 ug / ml amfoterisin B inkübe ihtiva eden bir 180 ml kap içine kesilmiş doku aktarın. </li><li> 150 ml steril PBS içeren taze bir 180 ml&#39;lik pota doku yerleştirin. epitel gözle görülür yatan dokudan ayrılması başlamış olacak. Yavaşça domuz yemek borusu ayrılmakta epitel steril forseps kullanarak ve atın soyun. <ol><li> Kalan t yerleştirintaze 180 ml&#39;lik pota sorunu ve steril PBS 150 ml ekleyin. 5 dakika yıkama için yavaşça çalkalayın. PBS dökün ve taze PBS ile iki kez daha tekrarlayın. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 24 saat süre ile, steril% 80, 400 ml (v / v) gliserol çözeltisi ihtiva eden 500 ml&#39;lik bir cam şişeye tüm doku yerleştirin. Bir 24 saat daha, steril% 90 (h / h) gliserol çözeltisi, 400 ml aktarın. </li><li> Kurutmak ve bazal membran bütünlüğünü korurken doku sterilize etmek için 4 ay, en az oda sıcaklığında steril% 100 gliserol çözeltisi, 400 ml saklayın. </li></ol> Kültür Medya 4. Üretim <ol><li> Kültür ortamı içinde kullanılmak üzere şelat yeni doğmuş buzağı serumu hazırlayın. <ol><li> Cam 1 L&#39;lik şişeye Chelex-100 100 g dökün ve deiyonize su ilave edilir. Kesin hacmin kritik öneme sahip değildir, ancak yeterli su Chelex toz kapsayacak şekilde eklenmelidir. Bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve otoklavda (121 ° C için sterilize15 dakika). </li><li> Şişe soğumasını bekleyin ve Chelex yerleşmek. Laminer akış kabininde, fazla su dökün yeni doğmuş dana serumu (NCS) ve 500 ml ilave edilir ve 4 ° C&#39;de gece boyunca karışmaya bırakılmaktadır. </li><li> Karıştırma durdurun ve Chelex bu 30 dakika kadar sürebilir, yerleşmek için izin verir. Laminer akış kabini içinde -20 ° C&#39;de 10 mi alikotlar içinde Chelex ve mağaza bozmamaya özen göstererek, steril bir pipet kullanarak şelatlı serum süzün. </li></ol></li><li> Pro-proliferatif ile başlayarak ve pro-farklılaştırma formülasyonlar ile biten bir düzgün akış kabininde üç farklı ortam hazırlar. <ol><li> 1 oranında (hac: hac), 4 x 10 3 M L-glutamin, 0.5 ug / ml hidrokortizon, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x Bileşik orta hazırlayın bir 3 DMEM ve Hams F12 oluşan 10 -12 M triiyodotironin, 1.8 x 10 -4 M adenin, 1.88 x 10 3 M CaCl2, 4 x 10 -12 M progesteron, 10 ug / mlSulin, 10 ug / ml transferrin, 10 ng / ml selenyum, 1 x 10 3 M etanolamin ve% 0.1 (v / v) ile şelatlanmış NCS. </li><li> % 0.1 (h / h) olmayan şelatlı NCS ile şelat serumu değiştirmek dışında bileşik ortamı I, burada tanımlanan kompozit Orta II hazırlayın. </li><li> % 2 (hac / hac) olmayan şelatlı NCS Omit progesteron ve artış serum haricinde bileşik Orta II olarak Bileşik III orta hazırlayın. </li></ol></li></ol> İnsan Özofagus Mukoza Modelinin 5. Üretim <ol><li> Steril bir ortam sağlamak için aseptik teknik kullanılarak, bir laminer akış kaputu tüm çalışmaları gerçekleştirin. Steril PBS içinde yıkamadan önce, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde ıslatarak tüm araçları sterilize edin. </li><li> Gerekirse bir gün önce, aselüler domuz özofagus iskele rehydrate. Her yapı hazırlanacak iskele tek parça gereklidir. <ol><li> Steril PBS 100 ml içeren bir pota domuz iskele doku yeri yeterli parçaları rehydrate, ajite ve 10 dakika bekletin. DecaPBS nt ve taze PBS ile değiştirin. Tüm gliserol izlerinin kaldırılmasını sağlamak için yıkama işlemini beş kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> 37 ° C&#39;de gece boyunca 100 ml DMEM içinde tekrar ıslatılabilir dokuyu inkübe etme ile iskele sterilite edin. Skafold, steril olduğu varsayılır inkübasyon döneminin sonunda, kültür ortamının rengi ya da bulanıklık ile herhangi bir değişiklik olursa. Sterilite onaylandıktan sonra, üstte bir 6 yuvalı plaka içine submukozal tarafı 5 cm2 hücresel olmayan iskele yerleştirin. </li><li> Her iskele merkezi üzerine steril tıbbi sınıf paslanmaz çelik yüzük (iç çapı 10 mm, dış çapı 20 mm) yerleştirin ve yavaşça doku ile yeterli bir sızdırmazlık sağlamak için, steril forseps kullanarak bastırın. </li><li> Bir hücre süspansiyonu üretmek için tripsin-EDTA kullanılarak 13 fibroblastlar Hasat. Bir hemositometre 14 kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonu (10 dakika, 200 x g) santrifüj. Bir ÖDENEK içine hücre pelletinifibroblast ortamının te hacmi, ml başına 2.5 x 10 6 hücre bir son hücre sayısını üretir. </li><li> Her bir halka içinde 5 x 10 5, insan yemek borusu fibroblastlar içeren fibroblast ortamının 0.2 ml, ekleyin. Fibroblast ortamının yaklaşık 2 ml halkanın dış çevresini boyayın. % 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 24 saat sonra halkalar ve fibroblast orta kaldırmak ve skafold tamamen ortamına daldırılır sağlanması, her bir oyuğa taze fibroblast ortamının en az 5 ml ekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 1 hafta boyunca kültür, orta, her 2-3 gün yerine nemlendirilmiş bir atmosfer. </li><li> 1 hafta sonra üst mukozal yüzeyi yerleştirerek, bir laminer sel kaput iskeleleri içeren 6 kuyu plakaları kaldırmak orta kaldırmak ve steril forseps kullanarak her iskele ters çevirin. Bu zaman noktası, gün 0 olarak adlandırılır. </li><li> Merkezinde mukoza yüzeyi üzerinde çelik halkalar yerleştirinadım 5.4 gibi doku. </li><li> Tripsinizasyonu 13 epitel hücrelerinin T75 balonlarına hazırlayın. PBS yıkama ve önceki tripsin-EDTA çözeltisi ilavesinden sonra, her bir şişeye, steril% 0.02 2 ml (ağırlık / hacim) EDTA çözeltisi ekleyin. 37 ° C&#39;de 2 dakika süreyle inkübe edilir. Ekli epitel hücreleri bırakarak seçici i3T3 besleyici katmanını ayırmak için hafifçe şişeyi hafifçe vurun. Not: Genellikle zaten önceki hafta modelinde dahil fibroblastlar epitel hücreleri maç hastaya pratik ya da gerekli değildir. </li><li> Besleyici katmanını içeren EDTA çözeltisi dökün ve epitel hücreleri 13 hasat tripsin-EDTA çözeltisi ilave edilir. Bir hemositometre 14 kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonu (10 dakika, 200 x g) santrifüj. Ml başına 5 x 10 6 hücre nihai hücre sayımı üretmek üzere Bileşik Orta 1 uygun bir hacmi içine hücre pelletini. </li><li> Içeren, Bileşik ortamı I, burada 0.2 ml ilave 1 x 1Halka içinde 0 6 epitel hücreleri,. Kompozit ortamı I, burada yaklaşık olarak 2 ml halkanın dış çevresini boyayın ve% 5 CO2, nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübatör içine yerleştirmeyi. </li><li> 24 saat (Gün 1) Mesai yüzük ve orta kaldırmak ve taze Kompozit Orta I en az 5 ml ekleyin, iskeleleri tamamen batık sağlanması ve inkübatör dönmek. Daha 24 saat (Gün 2) Mesai orta kaldırmak ve yeniden iskeleleri tamamen batık ve inkübatör dönmek vardır sağlanması, Kompozit Orta II en az 5 ml ile değiştirilir. </li><li> Gününde 4 yerde steril tıbbi sınıf paslanmaz çelik hasır ızgaralar, taze 6 kuyu tabak içine (2 cm uzunluk x 0,5 cm yüksekliğinde genişlik x 2 cm), yapının başına bir. Çelik ızgaralar, mukoza yüzey en üstte üst üzerine yapıları aktarmak için steril bir cımbız kullanın. <ol><li> Sıvı kompozit alt ulaşır, ancak yüzey şekilde yeterli Bileşik Orta III eklemehavaya maruz kalan, bu örnek, bir hava-sıvı ara yüzeyinde tutulmasını sağlar. iskele, oyuk hacmi ve paslanmaz çelik ızgara kesin bir yüksekliğe sahip kalınlığına bağlı olarak değişecektir gerekli ortamın tam hacmi. </li></ol></li><li> Deney gereksinimlerine bağlı olarak, 10 ila 20 gün sonra (gün 24 gün 14) için bir hava-sıvı ara yüzeyindeki kompozit koruyun. Taze ortam ile Kompozit Orta III değiştirin, her 2 ila 3 gün (Pazartesi, Çarşamba, Cuma kullanıcı dostu bir rejimdir). Not: Bir hava-sıvı arayüzü (Gün 9), 5 gün sonra yapılan, yemek borusu epitelindeki çevre faktörlerinin etkisi deneylerde kullanılmak üzere yeterince olgun yemek borusu epitelindeki sahiptir. </li><li> Deneyin sonunda, daha fazla analizi kullanılmıştır için epitelden histolojik analiz ve immunohistokimyasal lekeleme 7 veya ekstrakt proteininin 15 ya da RNA 11,16 için yapıları tamirolduğunu. Gerekirse, hücre-dışı sinyal molekülleri 17 analizi için kıvamlandırılmış kültür ortamı muhafaza eder. </li></ol>

<ol>
	<li>Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">Epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).</li><li>Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+effect+of+bile,+and+bile+and+hydrochloric+acid+mixture+on+the+esophageal+mucosa.">Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa.</a> Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).</li><li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Underwood, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+primary+oesophageal+squamous+epithelial+cells+with+HET-1A+in+organotypic+culture.">A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture.</a> Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Okawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+EGFR+overexpression,+hTERT+activation,+and+p53+mutation+in+esophageal+epithelial+cells+with+activation+of+stromal+fibroblasts+induces+tumor+development,+invasion,+and+differentiation.">The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).</li><li>Green, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+an+organotypic+tissue-engineered+human+esophageal+mucosal+model.">The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+induces+immortalization+of+human+esophageal+keratinocytes+without+p16INK4a+inactivation.">Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation.</a> Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).</li><li>Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+buccal+mucosa+for+substitution+urethroplasty.">Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty.</a> BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).</li><li>Ralston, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+contract+human+dermal+extracellular+matrix+and+reduce+soluble+fibronectin+production+by+fibroblasts+in+a+skin+composite+model.">Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model.</a> Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).</li><li>Green, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+exposure+to+simulated+reflux+leads+to+changes+in+gene+expression+in+a+3D+model+of+oesophageal+mucosa.">Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa.</a> Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).</li><li>Wang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+epithelial+cells+from+primary+breast+carcinomas+using+irradiated+3T3+cells+as+feeder+layer.">Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer.</a> Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells.">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+a+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abnormal+expression+of+retinoic+acid+receptor-beta,+p+53+and+Ki67+protein+in+normal,+premalignant+and+malignant+esophageal+tissues.">The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues.</a> World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).</li><li>Moll, R., Divo, M., Langbein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+keratins:+biology+and+pathology.">The human keratins: biology and pathology.</a> Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).</li><li>Rice, R. H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope:+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions.">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li><li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes.">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda yemek borusu epitelindeki üzerine, çevresel stres maruz kalma etkisini incelemek için bir deney platform olarak kullanılmak için müsait biyolojik açıdan ilgili insan özofagus mukozal modeli üretimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır. Bir insan özofagus mukoza modelinin başarılı üretimi için en kritik adımlar vardır: epitel hücrelerinin çoğunluğu proliferatif kalır ve zaten iskele bunları ekim öncesinde ayırt etmek başlamış değil sağlanması; bile...

Özofagus mukoza bağ dokusu, lamina propria tabakası üzerinde tabakalı, skuamöz epitel içerir ve yutulur çevresel stres karşılaşmaya ilk yerlerden biridir. Duodenogastro reflü özofagus kanserine dönüşme riski ile ilişkili Barrett metaplazi, patogenezinde kritik bir faktör ise beslenme toksinlere maruz kalma, özofagus skuamöz karsinom gelişiminde rol oynar. Özofagus karsinomlar İngiltere erkek ve özofagus adenokarsinomu 8 inci en sık görülen malign tümör hızla Batı dünyasında 1 artmaktadır vardır. Ayrıca,% 15 genel 5 yıllık sağkalım oranı ile hastalık prognozu küçük iyileşme olmamıştır. Sonuç olarak develo Bu özofagus epiteli üzerinde çevresel stres maruz kalma etkisini ve potansiyel katılımı araştırmak için deney platformlar için bir ihtiyaç vardırmetaplazi veya neoplazi pment. Ölümsüzleştirilmiş veya tümör hücre çizgileri araştırmacılar bu in vitro stres epitel hücrelerinin tepkisini incelemek için izin birlikte, çoğalma kalır ve yemek borusu mukozasına en üst tabakalar bulunan olgun epitelyal hücrelere farklılaşmaları için başarısız. Ayrıca, zaten tümörogenez geçirmiş hücreler hatları çevresel faktörlere epitel içinde normal hücrelerin ilk tepkiler konusunda sadece sınırlı bilgi sağlayabilir; ve bu terapötik müdahale için potansiyel yüksek olabilir aşamasıdır. Son olarak, geleneksel bir hücre kültürü sistemleri epitelyal ve mezenkimal hücreler arasındaki ve in vivo doku içinde meydana bu hücrelerin ve çevredeki matris arasındaki potansiyel olarak önemli etkileşimlerin yakalamak için başarısız olur. Hayvan modelleri özofagus epitheli tepkilerini incelemek için daha gerçekçi bir mikro sağlamakum ve gastro-özofageal reflü hastalığı 2 yapay indüksiyon dahil edebilirsiniz. Ancak bu modellerde çevre stres işlemek için daha zor olabilir ve onlar tamamen insan yemek borusu içinde yanıt temsil etmeyebilir. Diğer deney, insan özofagus modelleri kollajen birincil hücreler, ölümsüzleştirilmiş hücreleri ya da tümör hücre hatları kullanan geliştirilmiştir veya kollajen / Matrigel, skafold ihtiva eden fibroblastlar 3,4 kombine edilmiştir. Bu yazıda anlatılan aselüler özofagus iskele yerine bu iskeleleri oluşturmak için daha az emek yoğun olduğunu ve bu organotipik modeller özellikle kollajen jel içine tümör hücre infiltrasyonu kolayca olabilir tümör invazyonu 5,6, çalışmada, yararlı bir araç sağlar gözlenmiştir. Bununla birlikte, bu kolajen jeli yerli olmayan mekanik özelliklere sahip ve belirli bir bazal membran ve appropriat içeren orijinal dokunun belirli özellikleri eksikliğie yüzey topoğrafyası. Bir kollajen jel iskele 7 kullanırken bu, örneğin, epitel ve iskele arasında yoksul yapışma sonuçlanan hücrelerin davranışını etkileyebilir. Sonuç olarak aselüler domuz özofagus iskele daha biyolojik gerçekçi iskele ve deneysel bir platform olarak kullanmak için böylece daha uygun olmanın avantajı ile geliştirilmiştir. Ayrıca, bu hücreler, bir çok-tabakalı epitelyum oluşturmak için, bu tür Het-1A ölümsüzleştirilmiş özofagus epitelyal hücre hatları, daha özofagus yapılarına birincil hücreler dahil, ancak tabakalandırmak veya 4,7,8 ayırt etmek için başarısız daha iyi olduğu gösterilmiştir . Sonuç olarak, bu protokol daha önce doku mühendisliği deri ve oral mukoza 9,10 yapmak için MacNeil laboratuarda kullanılan bir yöntem ile ilgili uyarlanmıştır ve primer insan yemek borusu epitel hücreleri ve fibroblastlar ile birlikte, bir de-cellularized domuz özofagus iskele içermektedir olmuştur. ThiCK4, CK14, Ki67 ile ve lekeleme involukrini gösterildiği gibi protokolüne normal insan yemek borusunda benzer olgun, tabakalı epitel üretir. Ortaya çıkan model çevresel stres yanıtları incelemek için deneysel bir platform sağlar ve bileşenleri 11 refluxate tepki olarak özofagus epiteli gen ifadesi değişikliklerini araştırmak için etkin olarak kullanılmaktadır edilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">215240</td>
			<td>Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-D1112</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-H1236</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>FB-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Prepare 200 &#181;g/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydorcortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0396</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2767</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2036</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2752</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Prepare stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>Brand name Fungizone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td>Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">10103578001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>10830E</td>
			<td>Brand name Videne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">433209</td>
			<td>Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26010074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0503</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin, transferrin, selenium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-838Z</td>
			<td>Used for composite media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.02% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">11819650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml universal tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>SLS7504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 ml pot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td align="right">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel mesh grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ki67</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>KI67-MM1-L-CE</td>
			<td>Clone MM1 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9004</td>
			<td>Clone 6B10 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>LL002-L-CE</td>
			<td>Clone LL002 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Involucrin</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>INV</td>
			<td>Clone&#160; SY5 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE21</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96062201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE33</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96070808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Het-1A</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>previously growth arrested by irradiation (60 Gy)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, characterization and potential uses of a 3d tissue-engineered human esophageal mucosal model

özofagus adenokarsinomu ve öncüsü, Barrett metaplazi hem görülme sıklığı, batı dünyasında hızla yükseliyor. Ayrıca özofagus adenokarsinomu genellikle son yıllarda hayatta kalma oranlarında çok az düzelme kötü prognoz vardır. Bunlar incelemek için zor koşullardır ve özofagus mukozasının bozuklukları araştırmak için uygun deneysel platformlarda eksikliği olmuştur. İnsan yemek borusu mukozasına ait bir model, geleneksel 2D hücre kültür sistemleri farklı olarak, in vivo olarak, bu, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini tekrarlar ve normal insan benzer olgun, tabakalı epitel üreten MacNeil laboratuarda geliştirilmiştir Yemek borusu. Kısaca, model porcine&#39;den türetilmiş bir hücresel olmayan yemek borusu iskele içinde yetiştirilen dönüştürülmemiş primer insan fibroblastları özofagus normal ve epitel hücreleri kullanır. Bu modelin immünohistokimyasal karakterizasyonuCK4, CK14, Ki67 tarafından ve involukrini boyama normal insan özofagus mukozasının histoloji uygun recapitulation göstermektedir. Bu model, insan özofagus mukozasının sağlam, biyolojik ilgili deneysel bir model sunmaktadır. Kolayca farmakolojik ajanların etkinliği ve alkol, toksinler, yüksek sıcaklık veya gastro-özofageal refluxate bileşenleri gibi çevresel faktörlere maruz kalma etkisi de dahil olmak üzere araştırma bir dizi soru araştırmak için manipüle edilebilir. modeli aynı zamanda sağlayan geleneksel 2D hücre kültürü, diğerlerinin yanı sıra ile elde değil genişletilmiş kültür dönemleri kolaylaştırır, en fazla 20 gün süreyle ilgi ajana olgun bir epitel tekrarlanan maruz etkisinin incelenmesi. Ayrıca, bu tür yemek borusu tümörleri veya Barrett &#39;türetilmiş olanlar gibi hücre çizgileri, çeşitli, tümör invazyonu ve ilaç responsivene gibi süreçleri araştırmak için bir model içine dahil edilebilirBir biyolojik olarak daha uygun bir ortamda ss.

Bu yazıda başarılı bir şekilde, insan yemek borusu epitelindeki kültürü 3D modellere, Şekil 1 &#39;de şematik bir biçimde gösterilmiştir gerekli işlemi tarif etmektedir. Deneysel bir platform histolojik ve immünohistokimyasal çalışmalar normal insan özofagus skuamöz mukoza ile kültürlü dokuları karşılaştırılarak yapılmıştır gibi modelin uygunluğunu onaylamak için. Tarif edilen yöntem ile üretilen epitel histolojik olarak değerlendirilmes...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model at JoVE.com

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Bu yazının üretimi, karakterizasyonu ve normal birincil insan özofagus fibroblast ve de-cellularized domuz iskele içinde ekilmiş skuamöz epitel hücrelerinden hazırlanan bir dokuya işlenmiş 3D özofagus yapı potansiyel kullanımlarını açıklar. Sonuçlar normal insan yemek borusunda benzer olgun tabakalı epitel oluşumunu göstermektedir.

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Görüntüleme.  University of Sheffield.  Bu yazının üretimi, karakterizasyonu ve normal birincil insan özofagus fibroblast ve de-cellularized domuz iskele içinde ekilmiş skuamöz epitel hücrelerinden hazırlanan bir dokuya işlenmiş 3D özofagus yapı potansiyel kullanımlarını açıklar. Sonuçlar normal insan yemek borusunda benzer olgun tabakalı epitel oluşumunu göstermektedir. 

Video: Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Tri-broşür Polimer Vanalar göreceli hidrodinamik Değerlendirme Protokolü

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Biyomühendislik

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Büyük Tendon Kusurlarını Onarmak İçin Doku Mühendisliği Kollajen Greftli Yeni Bir Tenorhaphy Dikiş Tekniği

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Tohum ve bir biyosentetik doku Mühendisliği trakeal greft bir fare modeli implantasyonu

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...